Ganze Tier Perfusionsfixierung für Nager

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine kostengünstige, schnelle, kontrollierte und gleichmäßige Fixierung Verfahren unter Verwendung von 4% Paraformaldehyd über das Gefäßsystem perfundiert: durch das Herz der Ratte, um die bestmögliche Erhaltung des Gehirns zu erhalten.

Zusammenfassung

Das Ziel der Fixierung ist es, schnell und gleichmäßig zu bewahren Gewebe in einem lebensbedrohlichen Zustand. Während die Platzierung direkt im Gewebe Fixativ eignet sich gut für kleine Gewebestücke, größere Exemplare wie die intakten Gehirn ein Problem darstellen, zum Eintauchen Fixierung, weil das Fixativ nicht erreicht, alle Regionen des Gewebes mit der gleichen Rate ^5,7. Oft fangen sich in Reaktion auf Hypoxie, bevor das Gewebe ¹² erhalten werden kann. Der Vorteil der direkt Perfusion Fixativ durch das Kreislaufsystem ist, dass die chemische lassen sich schnell erreichen jeden Winkel des Organismus mit dem natürlichen Kreislauf-Netz. Um den Kreislauf am besten zu nutzen, muss darauf geachtet werden, anzeigen lassen physiologischen Drücken ^3. Es ist wichtig zu beachten, dass die physiologische Drücke abhängig von der verwendeten Art sind. Techniken für Perfusionsfixierung hängen von der zu fixierenden Gewebe abhängig und wie das Gewebe wird folgende Fixierung verarbeitet werden. In diesem Video, Beschreiben wir eine kostengünstige, schnelle, kontrollierte und gleichmäßige Fixierung Verfahren unter Verwendung von 4% Paraformaldehyd über das Gefäßsystem perfundiert: durch das Herz der Ratte, um die bestmögliche Erhaltung des Gehirns für die Immunhistochemie zu erhalten. Der Hauptvorteil dieser Technik (vs Schwerkraft-Systeme) ist, dass die Kreislauf-System am effektivsten genutzt wird.

Protokoll

1. Bereiten Sie Fixativ

(Siehe Tabelle Fixativ und Puffer.)

2. Bereiten Perfusion Puffer

(Siehe Tabelle Fixativ und Puffer.)

3. Bereiten Apparate-und Anästhesie

1. Mit dem Wasserbad warm Perfusionspuffer bis 37 ° C. Auslaßventil Platz in einem Becherglas mit Puffer gefüllt. Füllen Sie eine 50 ml Spritze mit Puffer und heften sich an Fixativ Schlauch. Flush Schlauch wiederholt durch Austreiben und Aberkennung der Puffer.
2. Deaktivieren der Linie mit Puffer, bis alle Luftblasen in dem Schlauch entfernt sind. Es ist entscheidend für den Erfolg eines Perfusion um keine Luftblasen zu einem der Linien haben.
3. Entfernen Sie die Spritze und schließen Sie die 4% Paraformaldehyd-Fixativ (Raumtemperatur) Behälter. Um Luftblasen am Rohrende zu vermeiden, drücken das Rohr während der Positionierung des Rohrs in den Behälter, so dass ein Tropfen Puffer von dem Ende to an der Oberfläche der Flüssigkeit in dem Behälter.
4. Schließen der Auslaßöffnung (Nadelende). Drehen Puffer Ventil (blau) auf der gleichen Position wie das Fixiermittel Ventil (weiß). Dies ermöglicht Flow aus dem Puffer Linie nur.
5. Öffnen Sie die Auslassöffnung und wiederholen Sie Schritt A1 bis A3 zum Füllen des Puffers Linie. Nachdem alle Luftblasen nahe der Auslassöffnung eliminiert werden, entfernen Sie die Spritze und verbinden Sie den Pufferbehälter, dabei nicht um Luftblasen in den Schlauch einführen.
6. Testsystem zur Fähigkeit, Druck durch Pumpen mit der Gummi-Manometer blub halten. Es ist normalerweise ein Widerstand durch die Kompression der Luft in dem System.
7. Richten Chirurgie Werkzeuge, damit leicht zugänglich. Füllen Perfusion Nadel mit Puffer, um die Möglichkeit von Luftblasen zu beseitigen.
8. Vor der Operation wird ein Ketamin / Xylazin-Mischung (bis zu 80 mg / kg Körpergewicht Ketamin und 10 mg / kg Körpergewicht Xylazin) durch intraperitoneale Injektion (27 Gauge Nadel und 1 ml-Spritze) verabreicht. Zusätzliche der Anästhesie falls erforderlich, wird im Verlauf jeder Operation, um ein chirurgisches Ebene Anästhesie beizubehalten durchgeführt werden.

4. Perfusion Chirurgie

1. Sobald das Tier einen chirurgischen Ebene der Anästhesie erreicht hat, setzt sie auf die flache Schale mit Crushed Ice gefüllt. (Verwenden Sie Zeh Pinch-Response-Verfahren, um Narkosetiefe zu bestimmen. Tier darf nicht ansprechbar sein, bevor Sie fortfahren).
2. Machen Sie eine 5-6 cm seitlichen Schnitt durch die Haut und Bauchdecke direkt unter dem Brustkorb. Sie vorsichtig die Leber von der Membran.
3. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Membran mit den gebogenen, stumpfen Schere. Die Position und der Druck des dem Finger in der Fähigkeit, um die Membran geschnitten zu unterstützen.
4. Fahren Sie mit der Membran Einschnitt über die gesamte Länge des Brustkorbs, um die Pleurahöhle aussetzen.
5. Legen gebogen, stumpf Scheren entlang einer Seite der Rippen, sorgfältig Verschieben der Lunge, und einen cut durch den Brustkorb bis zum Schlüsselbein. Machen Sie einen ähnlichen Schnitt auf der Gegenseite.
6. Heben Sie das Brustbein entfernt, schneiden Sie aufmerksam alle Gewebe Anschluss an das Herz. Klemmen Sie die Spitze des Brustbeins mit der Blutstillung und platzieren Sie den Gefäßklemme über den Kopf. Wenn man es richtig macht, hebt die Thymusdrüse entfernt vom Herzen zusammen mit dem Brustbein und bietet einen freien Blick auf den großen Schiffen.
7. Einen kleinen Schnitt mit dem hinteren Ende des linken Ventrikels mit Iris Schere.

Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .

8. Übergeben Sie eine 15-Gauge-stumpf-oder Olivenöl-bestückte Perfusion Nadel durch den Schnitt Herzkammer in die Aorta ascendens. Die Spitze sichtbar sein soll durch die Wand der Aorta, und sollte nicht erreichen den Aortenbogen, wo die Arm-und Halsschlagadern divergieren.
9. Mit einer Klemme, um das Herz zu klemmen, sichert dies die Nadel und ein Auslaufen verhindert. Falls gewünscht, kann das modifizierte Gefäßklemme verwendet, um die Aorta um die Nadelspitze Klemme (diese Hämostaten werden bis zum Dissektion beginnt, wird aber von künftigen Abbildungen aus Gründen der Klarheit weggelassen werden).
10. Schließlich einen Einschnitt machen, um das Tier rechten Vorhof mit Iris-Schere, um so groß wie möglich einen Ausgang ohne Beschädigung der absteigenden Aorta zu schaffen. An diesem Punkt ist das Tier bereit, perfundiert werden.

5. Perfusion

1. Öffnen und schließen Auslassöffnung zu Nadelgrundteils kümmert sich nicht um mögliche Luftblasen einzuführen.
2. Pump up the Manometer Glühbirne zu einem Druck von 80 mm Hg schnell & gleichmäßig. Halten Sie diesen Druck während der Puffer Infusionsdauer. Starten Sie den Timer.
3. Passen Sie die Nadel Winkel. Der Winkel der Nadel ist entscheidend für die Erreichung eines maximalen Durchfluss (man beachte die Strömung Veränderung mit Winkelverstellung).
4. Schalten Sie den Buffer Ventil (blau), wenn Puffer ist fast fertig (200 ml). Die Flüssigkeit sollte ausgeführt werden, klar. Die Räumung der Leber ist ein Indikator für eine gute Durchblutung. Die Leber sollte an dieser Stelle klar. Geben Sie Zeit für Ihre Unterlagen.
5. Fixation Zittern sollte innerhalb von Sekunden beobachtet werden, dies sollte in Betracht gezogen der wahre Zeitpunkt der Fixierung werden. Geben Sie Zeit für Ihre Unterlagen.
6. Der Druck kann schrittweise auf bis zu einem Maximum von 130 mm Hg ^2, um eine konstante Durchflussrate zu halten.
7. Schließen Sie das Auslassventil einmal das Fixativ fast fertig ist. Geben Sie die Endzeit für Ihre Unterlagen.
8. Die Ratte sollte in dieser Phase steif.
9. Das verwendete Paraformaldehyd müssen gesammelt und zur Entsorgung gelagert werden gemäß den Vorschriften Ihrer Institution.

6. Dissection ^4,11

1. Nehmen Sie den Kopf mit einer Schere.
2. Machen Sie einen Einschnitt an der Mittellinie entlang der Haut vom Hals bis zur Nase und setzen dieSchädel.
3. Schneiden Sie die verbleibenden Nackenmuskulatur so dass die Basis des Schädels freigelegt wird; entfernen Restmuskelfunktionen mit Schere oder Rongeure.
4. Platzieren Sie das spitze Ende eines Paares von Iris Schere in das Foramen magnum auf der einen Seite, sorgfältig Verschieben der Schere entlang der Innenfläche des Schädels.
5. Als nächstes erstellen Sie ein Schnitt Verlängerung bis zum äußeren Rand des hinteren Schädel Oberfläche. Machen Sie einen identischen Schnitt auf der Gegenseite. Verwenden Sie die Rongeure dem Weg zu räumen um den Schädel des Kleinhirns.
6. Vorsichtig die Schere entlang der inneren Oberfläche des Schädels, während die Spitze bewegt sich von der dorsalen distalen hinteren Ecke des distalen Vorderkante des Schädels, Anheben der Schaufel, wie Sie schneiden, um eine Beschädigung des Gehirns zu verhindern. Der gegenüberliegenden Seite wiederholen.
7. Mit Rongeure peel der dorsalen Oberfläche des Schädels entfernt vom Gehirn. Schneiden Sie die Seiten des Schädels mit Rongeure ebenso.
8. Mit einem Spatel, trennen Sie die Riechkolben und nervöse Verbindunggen entlang der ventralen Oberfläche des Gehirns.
9. Sie vorsichtig in das Gehirn vom Kopf weg, Trimmen jedes Dura noch verbindet das Gehirn mit dem Schädel mittels Blende Schere.
10. Entfernen Sie das Gehirn und legen Sie sie in einem Fläschchen von Fixativ haltigen Flüssigkeit mindestens 10x das Volumen des Gehirns selber. Schwenken Sie die Durchstechflasche gelegentlich.

7. Post-Fixierung und Lagerung

1. Halten Sie das Gehirn in Fixierungsmittel für 24 Stunden bei 4 ° C, gelegentlich wirbeln.
2. Nach 24 Stunden Waschen des Gehirns mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung durch den Austausch der Medien 3 Mal und Verwirbelung jeweils.
3. Gehirne können dann in Phosphat-gepufferter Salzlösung aufbewahrt werden oder HBHS mit Natriumazid und bei 4 ° C

8. Repräsentative Ergebnisse

Ein erster Indikator für den Erfolg der Perfusion ist die Rodung von Extremitäten wie Nase, Ohren und Pfoten und innere Organe wie der Thymusdrüse und der Leber (IHC World).Gross Inspektion des Gehirns zeigt das Blutgefäß Leere des Blutes (weiße bis hellgelbe Aussehen). Das wird auch in Gewebeschnitten Destine für die Färbung und Immunhistochemie wahr. Der letzte Indikator des Ergebnisses der Perfusion ist der Zustand der Ultrastruktur im Gewebe. ^1,6,7,8

Bereiten Sie Fixativ:

Bereiten 8% Paraformaldehyd Lager

Fügen Sie 40 g Paraformaldehyd in 500 ml dH 2 O. Erhitzen Sie die Lösung auf 60 - 65 ° C unter Rühren (nicht mehr als 65 ° C, dabei kann sich negativ auf den Erfolg der immunhistochemischen Verfahren). Um die Lösung klar, Hitze reduzieren und 2-3 ml von 1,0 M NaOH mit einer Pipette. Filter und lagern bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.

Planen 0,2 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,4

Für die Mononatriumphosphat Lager, fügen 27,8 g NaH 2 PO 4 * H 2 O auf 1 L dH 2 O. Für die Dinatriumhydrogenphosphat Lager, hinzuzufügen 28,4 g Na 2 HPO 4 zu 1 l dH 2 O Fügen Sie 810 ml des einbasischen Lager bis 190 ml des zweibasischen Lager.

Bereiten Sie 4% Paraformaldehyd-Fixativ

In gleichen Teilen 8% Paraformaldehyd Lager zu 0,2 M Natriumphosphat-Puffer Hinweis: dieses Update wird am besten frisch zubereitet, nicht mehr als 72 Stunden im Voraus.

Bereiten Perfusion und Lagerung Puffer:

Bereiten Phosphate Buffered Saline, pH 7,4

1 l dH 2 O 9 g NaCl 144 mg KH 2 PO 4 795 mg Na 2 HPO 4 PH-Wert prüfen

HEPES-gepufferter Hanks Solution (HBHS) mit Natriumazid pH 7,4

990 ml dH 2 O 7,5 g NaCl, 0,3 g KCl 0,06 g KH 2 PO 4 0,13 g Na 2 HPO 4 2 g Dextrose / Glucose 2,4 g 10 mM Hepes 0,1 g MgCl 2 6 Teile dH 2 O 0,05 g MgSO 4 7 Teile dH 2 O 0,165 g CaCl 2 2 Teile dH 2 O 90 mg NaN 3 PH-Wert prüfen

Tabelle 1. Vorbereitung der Fixierlösung und Puffer.

Abbildung 1. Perfusionsapparatur mit markierten Komponenten.

Abbildung 2. Vorbereitung des Perfusionsapparatur I. mit dem Fixativ Zeile beginnen. Spülen Sie den Schlauch von Luftblasen und füllen mit Puffer durch schnelles Austreiben und Aberkennung der Puffer in die Spritze und durch die Leitung. Schließen Sie das Ventil auf der Nadel Ende aus. Legen Sie die Leitung in den Fixativ Fixativ Flasche ohne Einbringen von Luftblasen.

3. Herstellung der Vorrichtung Perfusion II. 1. Ventil öffnen auf dem Nadelende. 2. Schalten Puffer Ventil (blau) bis zum Fluss zu positionieren. 3. Spülen Sie den Schlauch von Luftblasen und füllen mit Puffer durch schnelles Austreiben und Aberkennung der Puffer mit der Spritze. 4. Ventil schließen auf dem Nadelende. Setzen Sie das Rohr in die Flasche Puffer. Prüfdruck um sicherzustellen, dass das System versiegelt ist richtigly durch das Aufpumpen des Manometer Glühbirne und beobachtete die Spurweite. Die Vorrichtung ist jetzt bereit für die Perfusion.

4. Perfusion Vorrichtung in Position für den Puffer Lieferung.

Abbildung 5. Perfusion Chirurgie I. a) Machen Sie einen seitlichen Schnitt durch die Haut und Bauchwand. b) Einen Einschnitt in der Membran geschnitten und an der Membran Aussetzen des Herzens. Machen parallele Schnitte auf beiden Seiten der Rippen bis zum Schlüsselbein. c) klemmen die Spitze des Brustbeins mit der Blutstillung und platzieren Sie den Gefäßklemme über den Kopf.

Abbildung 6. Perfusion Chirurgie II. a) Führen Sie die Nadel durch die Perfusion Schnitt Herzkammer in die Aorta ascendens. b) Sichern Sie diePerfusion Nadel Verwendung eines Satzes von Hämostaten, um das Herz zu klemmen. Ein zweiter Satz von einem modifizierten Gefäßklemme kann auch verwendet werden, um die Aorta um die Nadelspitze um ein Auslaufen verhindert festzuklemmen. Mit Iris Schere einen kleinen Einschnitt zu dem hinteren Ende des linken Ventrikels.

Abbildung 7. Perfusion mit Pufferpumpe das Manometer Glühbirne zu Druck in der Leitung zu schaffen. Öffnen Sie das Ventil (1) und heften sich an der Nadel-Hub. Es ist entscheidend, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen eingeführt werden. Pump up the Manometer Glühbirne zu einem Druck von 80 mm Hg und pflegen diesen Druck während der Puffer Infusionsdauer.

Abbildung 8. Perfusion mit Fixativ Sobald Puffer ist fast fertig (200 ml) schalten Sie den Puffer Ventil (1), um für das Fixativ fließen zu lassen. Der Druck kann allmählich bis zu einem erhöht werdenmaximal 130 mm Hg beträgt.

Abbildung 9. Dissection I. a) entfernen Sie den Kopf mit einem Paar Scheren. b) Einen Einschnitt in der Haut entlang der Mittellinie vom Hals bis zur Nase und setzen den Schädel. c) schneiden Sie die restlichen Nackenmuskulatur so dass die Basis des Schädels ausgesetzt ist. Halten Sie den Kopf, so dass die große Öffnung in der Schädeldecke Oberfläche (Foramen magnum) zugänglich ist. Schieben Sie das spitze Ende eines Paares von Iris Schere in das Foramen magnum und machen einen Schnitt. Wiederholen Sie das gleiche Manöver für die Gegenseite. Verwenden Sie die Rongeure dem Weg zu räumen um den Schädel des Kleinhirns.

Abbildung 10. Dissection II. a) Schieben Sie die Schere entlang der Innenfläche des Schädels. Heben Sie an der Spitze, wie Sie schneiden, um Schäden am Gehirn zu verhindern. Wiederholen Sie das gleiche fürgegenüberliegenden Seite. Verwenden Sie Rongeure schälen dem Schädel entfernt vom Gehirn. b) Illustration mit dem Schädel entfernt und das Gehirn ausgesetzt. c) Mit einem Spatel die Riechkolben und Nervenverbindungen an der vordersten Stelle des Gehirns zu trennen. Führen Sie das Spatelspitze entlang der Unterseite des Gehirns, um Verbindungen zu erleichtern entfernen zu trennen. Entfernen Sie das Gehirn und legen es in das Fläschchen mit Fixativ.

Diskussion

Zusätzliche Hinweise für eine erfolgreiche Operation:

1. Sobald die Membran verletzt wird, vorausgehen schnell wie Hypoxie und Hyperkapnie wird irreversiblen physiologischen Veränderungen, die anschließende Analyse verfälschen können zu initiieren.
2. Wenn die Nadel eingeführt wird und eingespannt wird der Restdruck Blut der Basis der Nadel (Rückblende) zu drücken. In der Tat können größere Tiere zu vertreiben kräftig Blut. Es ist wichtig, dass Blut mindestens bis die Basis der Nadel zu vermeiden Einbringen von Luftblasen, die schädlich für Perfusion abzuschließen präsentieren. Wenn kein Blut an der Nadel Basis beobachtet wird, entfernen Sie die Nadel ab und füllen mit Puffer, indem Sie es mit der Auslassöffnung der Perfusion rig. Sobald Puffer hat durch die Spitze ausgeführt wurde, kann die Nadel in das Herz wieder eingesetzt werden.
3. Die richtige Platzierung der Nadel innerhalb der Aorta ist kritisch, sollte es nicht so weit wie der Aortenbogen erreichen.
4. Wenn mehrere Infusionen stattfinden ist es nicht notwendig to Einrichtung von Anfang an jedes Mal, wenn. Der Benutzer muss das richtige Volumen sowohl für den Puffer und Fixiermittel bei jeder Flasche (200 ml Tier / Lösung). Die Flaschen können auch wieder aufgefüllt, wenn nötig. Der wichtigste Aspekt ist Ausspülen der Perfusion Linie, die vom Setup für das Tier (Auslassventil) läuft. Nach dem Abschluss einer Perfusion, wird diese Zeile 4% Paraformaldehyd in ihm haben. Entfernen Sie den Schlauch von der Flasche Puffer und verwenden Sie eine 50 ml Spritze mit Wasser gefüllt zu spülen, das Fixativ. Stellen Sie sicher, das Auslassventil in einem Becherglas Abfallsammlung für die ordnungsgemäße Entsorgung des Paraformaldehyd platziert wird. Wiederholen Sie dies dreimal. Refill mit Puffer mit der gleichen Methode in 2.3 dargestellt.
5. Dieses Verfahren zur Fixierung ist sehr anpassungsfähig mit der Fähigkeit, sowohl Puffer und Fixiermittel auch andere Fixierungsmittel (z. B. für EM verwendet) entsprechend den Anforderungen des Experiments zu ändern.
6. Das System wird auch häufig für die Extraktion von lebendem Gewebe verwendet. DazuVerfahren benutzt man einfach die Lieferung von Puffer nur (der Puffer Flasche, während immer noch auf ganze System angeschlossen ist in einem Eiskübel gestellt und das Fixativ Flasche ist leer, aber Setup als versiegelt). Dies gewährleistet eine kalte Perfusion Puffer an der optimalen Druck. Von hier aus kann das System zur Infusion von fixierbar Farbstoffe entweder durch Hinzufügen der Farbstoff direkt in den Zwischenspeicher (wenn die Menge kein Problem ist) oder eine Spritze mit einer minimalen Menge an Puffer / Farbstofflösung zwischen dem Puffer angepasst werden - Fixiermittel Schritt.
7. Bei vaskulären Gießen, ist die Drucküberwachung Puffer Schritt jedoch von entscheidender Bedeutung aufgrund der Viskosität und Verfestigen der Natur der Gießlösung entweder ein 50ml Spritze zur unmittelbaren Lieferung oder eine Einweg zweiten Befestigung der Vorrichtung verwendet werden (Schlauch, Ventil und hält Behälter) hat eine Schnittstelle mit dem aktuellen System verwendet werden. Unsere Labors "vaskuläre Casting ging der Konstruktion und Fertigung des Perfusionsapparatur. Deshalb können wir nicht STgegessen, daß die Druckmessungen eine genaue Messung der Liefer-Site sein. Die Zahlen müssen eventuell angepasst, um eine erfolgreiche Bereitstellung von viskosen Flüssigkeiten zu erreichen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ausrüstung	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
			Betäubungsmittel:
Ketamin / Xylazin-Mischung (Betäubungsmittel können je nach Labor / Institution variieren)	Ketaset	NDC 0856-2013-01	10 ml Fläschchen
			Chirurgie:
Nadelspitze, 27 GA x 1,25 "	Materiel Dienstleistungen	25251
Große stumpf / stumpf gebogenen Schere (~ 14,5 cm)	Fine Science Tools	14519-14
Gerade Iris Schere	Fine Science Tools	14058-11
Standard Pinzette	Fine Science Tools	11027-12
Paar schöne (Graefe) Pinzette	Fine Science Tools	11050-10
1 große Gefäßklemme Pinzette - gebogen oder gerade (~ 19 cm)	surgicaltools.com	17.21.51
2-Standard Gefäßklemme Pinzette - gerade verzahnte (14 cm)	Fine Science Tools	13013-14
1 modifiziert Gefäßklemme (mit 15-Gauge-Loch durch die Spitze gestellt)	Fine Science Tools	13013-14
15-Gauge-stumpf oder oliv-bestückte Nadel (Perfusion Nadel)	Fisnar	5601137
			Perfusion:
Hyperfusion System oder eine gleichwertige
Phosphat-gepufferte Salzlösung, pH 7,4
4% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4
Flache Schale aus Glas oder Kunststoff, ca. 10 "x 10"
Crushed Eis
Wasserbad (37 ° C)
Timer
50 ml Spritze	Medline Industries	NPMJD50LZ
			Dissection:
Pair von Standard spitz / stumpf gerade Schere (~ 12 cm)	Fine Science Tools	14054-13
Mittlere gebogen oder gerade Rongeure (14-16 cm) oder Schädelknochen Entfernung Zange	Fine Science Tools	16020-14
Gerade Iris Schere (~ 9 cm)	Fine Science Tools	14058-11
Mikro-Spatel (Doppel 2 "flachen Enden, ein abgerundet, abgeschrägt, um ein 1/8")	Fine Science Tools	10091-12
			Postfixierung & Lagerung:
50 ml Glasfläschchen
40 ml HEPES-gepufferte Hanks-Lösung (HBHS) mit Natriumazid (90 mg / l)