Gentransfer und Transfektion in humanen Pankreaskarzinom-Zellen mit Epidermal Growth Factor Gelatin-Based Engineered Nanovektoren Rezeptor-gezielte

Zusammenfassung

Typ B-Gelatine-Basis entwickelt Nanovektoren System (gens) wurde für die systemische Gentransfer und Transfektion in der Behandlung von Bauchspeicheldrüsenkrebs entwickelt. Durch Modifikation mit epidermal growth factor receptor (EGFR) spezifische Peptid auf der Oberfläche der nanparticles, konnten sie auf EGFR-Rezeptor-Target und Freigabe unter reduzierenden Umgebung, z. B. hohe intrazelluläre Glutathion-Konzentrationen Plasmid.

Zusammenfassung

Mehr als 32.000 Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebs in den USA pro Jahr diagnostiziert, und die Krankheit ist mit einer sehr hohen Sterblichkeit ¹ verbunden. Dringender Bedarf besteht, neuartige klinisch übersetzbaren therapeutische Strategien, die auf dem düsteren Überleben Statistiken von Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebs verbessern entwickeln kann. Obwohl die Gentherapie bei Krebs eine enorme Versprechen gezeigt hat, ist die größte Herausforderung bei der Entwicklung von sicheren und wirksamen Zustellung System, das eine nachhaltige Transgenexpression führen kann.

Gelatine ist eine der vielseitigsten natürliches Biopolymer, weit in Nahrungsmitteln und pharmazeutischen Produkten verwendet. Frühere Studien aus unserem Labor haben gezeigt, dass Typ B-Gelatine konnte physische kapseln DNA, die die supercoiled Struktur des Plasmids und verbesserte Transfektionseffizienz auf intrazelluläre Abgabe erhalten. Durch Thiolierung von Gelatine, konnte die Sulfhydrylgruppen in das Polymer eingeführt werden und würde form Disulfidbrücke innerhalb Nanopartikel, die den gesamten Komplex und einmal Disulfidbrücke stabilisiert durch die Anwesenheit von Glutathion in Cytosol gebrochen ist, würde Nutzlast ^2-5 freigegeben werden. Poly (ethylenglycol) (PEG)-modifizierten Gens, wenn sie in die systemische Zirkulation verabreicht wird, bietet lange Umlaufzeiten und bevorzugt Ziele, um die Tumormasse durch die hyper-Durchlässigkeit der Neovaskulatur durch die erhöhte Permeabilität und Retention Effekt ^6. Studien haben Überexpression des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) auf Panc-1 menschlichen Pankreaskarzinom-Zellen ⁷ gezeigt. Zur aktiven Ziel Bauchspeicheldrüsenkrebs Zelllinie wurde EGFR spezifischen Peptid konjugiert auf der Partikeloberfläche durch eine PEG-Spacer. ⁸

Die meisten Anti-Tumor-Gen-Therapien sind auf die Verwaltung des Tumorsuppressor-Gene, wie Wildtyp-p53 (wt-p53), die pro-apoptotische Funktion in den Zellen ⁹ wieder konzentriert 10. In Bauchspeicheldrüsenkrebs, haben die meisten Zellen Mutationen im p53-Protein, was den Verlust der apoptotischen Aktivität. Mit der Einführung von wt-p53 könnte die Apoptose repariert und weiter auslöst Zelltod in Krebszellen ^11.

Basierend auf den obigen Begründung haben wir konstruiert EGFR-Targeting-Peptid-modifizierten thiolierten Gelatine-Nanopartikel für wt-p53-Gen Lieferung und ausgewertet Lieferung Effizienz und Transfektion in Panc-1-Zellen.

Protokoll

1. Präparation von Plasmid-DNA Encapsulated EGFR-Targeted Gelatine-Nanopartikel

1. Synthese von Thiol-Gelatine
   1. Thiolierten Gelatine wurden als bisherige Methode ^2-5, durch kovalente Konjugation mit 2-Iminothiolan auf primäre Aminogruppen vom Typ B-Gelatine hergestellt. 1 Gramm Gelatine in 100 ml deionisiertem Wasser gelöst und inkubiert mit 20 mg 2-Iminothiolan Hydrochlorid bei Raumtemperatur für 15 Stunden.
   2. Nicht umgesetzte Reagenz wurde durch Dialyse gegen 5 mM HCl-Lösung, um 1 mM HCl-Lösung für je 3 Stunden entfernt, gefolgt. Gereinigtes thiolierten Gelatine wurde gefriergetrocknet und bei 4 ° C für die weitere Verwendung gespeichert.
2. Herstellung von DNA-Nanopartikel-haltigen
   1. 200 mg thiolierten Gelatine in Wasser und pH-Wert von Lösung gelöst wurde auf 7 durch Zugabe von 0,2 M NaOH-Lösung eingestellt. 1mg DNA zugegeben und vorsichtig gemischt mit Gelatine-Lösung.
   2. Chilled Ethanol wurde langsam in die Mischung gegeben, währendgerührten Lösung mit hoher Geschwindigkeit. Nanopartikel wurden gebildet, als Lösungsmittel Zusammensetzung verändert, um 75% hydro-alkoholische Lösung.
   3. Nanopartikel wurden durch langsame Zugabe von 0,1 ml 8% (v / v) Glyoxal-Lösung vernetzt. Nicht umgesetzte Reagenzien wurden mit 0,5 ml 0,2 M Glycin-Lösung gequencht.
   4. Nanopartikel wurden ultra-zentrifugiert bei 16.000 rpm für 30 Minuten. Die Pellets wurden mit entionisiertem Wasser zweimal gewaschen und gereinigt Nanopartikel wurden gefriergetrocknet und bei 4 ° C.
3. Oberflächenmodifizierung von Nanopartikeln
   1. Nanopartikel wurden in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) mit einer Konzentration von 10 mg / ml suspendiert und mit 2 mal Gewicht von Methoxy-PEG-Succinimidyl Carboxy-Methylester (mPEG-SCM, MW 2.000 Da) oder Maleimid-PEG-Succinimidyl carboxy Methylester (MAL-PEG-SCM, MW 2.000 Da) für 2 Stunden bei Raumtemperatur unter langsamem Rühren.
   2. PEGylierte Nanopartikel wurden mit Ultrazentrifugation bei 16.000 rpm für 30 Minuten gesammelts. Die Pellets wurden mit entionisiertem Wasser zweimal gewaschen und gereinigt Nanopartikel wurden gefriergetrocknet und bei 4 ° C.
   3. MAL-PEG-SCM Nanopartikel wurden in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,5) mit einer Konzentration von 10mg/ml suspendiert und inkubiert mit 10% Gewicht von EGFR spezifischen Peptid (YHWYGYTPQNVI-GGGGC) für 6 Stunden bei Raumtemperatur unter langsamem Rühren.
   4. Peptide Nanopartikel wurden mit Ultrazentrifugation bei 16.000 rpm für 30 Minuten gesammelt. Die Pellets wurden mit entionisiertem Wasser zweimal gewaschen und gereinigt Nanopartikel wurden gefriergetrocknet und bei 4 ° C.

2. Charakterisierung von EGFR-Targeted-Nanopartikel

1. Partikelgröße und Zetapotential-Messung
   Nanopartikel wurden in Wasser mit einer Konzentration von 1mg/ml eingestellt. Suspension wurde mittels Zetasizer Nano (Malvern Inc). Partikelgrößenanalyse wurde bei einem Streuwinkel von 90 Grad bei 25 °C. Zeta-Potential wurde auf Standard-Parameter der Dielektrizitätskonstante, Brechungsindex und die Viskosität von Wasser bei 25 ° C gemessen
2. Scanning Electron Microscopy
   Lyophilisierte Nanopartikel wurden auf Aluminium-Probenträger befestigt und Sputter-Beschichtung mit Palladium zur Erhöhung der Leitfähigkeit und minimieren Aufbau von Gebühren. Die Proben wurden zur Oberflächenmorphologie unter einem Hitachi 4800 Feldemission Rasterelektronenmikroskop bei 3 kV beobachtet.
3. Electron Spektroskop für die chemische Analyse (ESCA)
   Gefriergetrocknete Formulierung Kontrolle wurden PEGylierte und Peptid-modifizierten Nanopartikel durch ESCA analysiert. Es war an der National ESCA and Surface Analysis Center für Biomedizinische Probleme (NESAC / BIO), University of Washington (Seattle, WA) durchgeführt.
   1. Die Proben wurden im Ultrahochvakuum gelegt und Niedrig-Energie-Röntgenstrahl, die eine Emission von sekundären Photoelektronen von der Oberfläche induziert.
   2. Durch Auftragen Anzahl der detektierten Elektronen als Funktion der binding Energie, beobachtete Spektrum Peaks wurden zu jedem chemischen Komponenten zugeordnet.
   3. Hochauflösende Analyse der C1s-Spektren wurde durchgeführt, um genaue chemische Zusammensetzung von Kohlenwasserstoff-(CC-oder CH bei 285mV), Ether (CO) bei 286.4mV) und Carbonyl (C = O bei 288,1 mV), und die relative Zusammensetzung der einzelnen Funktionen bestimmen wurde von Fläche unter der Kurve bestimmt.
4. Die Stabilität der verkapselten Plasmid
   Die Stabilität der eingekapselten Plasmid-DNA wurde durch Ausführen der extrahierten DNA auf Fertiggele bestätigt. Die Nanopartikel wurden mit 0,2 mg / ml Protease mit PBS (30 min bei 37 ° C) und 0,2 U / ml DNAse (10min bei Raumtemperatur) getrennt verdaut, gleichzeitig oder nacheinander. Die Proben wurden dann auf 1,2% Agarosegel (GP) (E-Gel, Invitrogen, CA) in einer Konzentration von 100ng/well in einem 18μL Volumen pro Well geladen. Naked Plasmid wurde als Kontrolle beladen und Gel wurde bei 75 V für 30 Minuten laufen. Kodak Digital X-ray Specimen (DXS) System wurde verwendet, um b visualisierenands mit UV transluminescence.
5. Bestimmung von Plasmid-loading
   Plasmide gekapselte Nanopartikel wurden 1mg/ml suspendiert und verdaut mit 0.2mg/ml Protease bei 37 ° C für 30 Minuten. Die Lösung wurde bei 13.000 rpm für 10 Minuten zentrifugiert und Überstand wurde gesammelt und für die Plasmid-Konzentration mit PicoGreen Assay (Invitrogen) getestet. Encapsulation-Verhältnis wurde durch Division der eingekapselten Plasmid-Konzentration mit dem ersten Laden 0,5% (w / w) berechnet.

3. In-vitro-Transfektion Studies in Panc-1 Bauchspeicheldrüsenkrebszellen

1. Zellkultur-Bedingungen
   Panc-1 und Capan-1 Pankreaskarzinom-Zelllinien wurden SKOV3 Eierstock-Adenokarzinom-Zelllinie und NIH-3T3 Maus-Fibroblasten-Zelllinie von ATCC erworben. Panc-1 und NIH-3T3 wurden mit DMEM mit L-Glutamin, Pen-Strep und 10% fötalem Rinderserum bei 37 ° C geliefert und 5% CO _2, während Capan-1 erforderlich DMEM 20% fötalem Rinderserum geliefert. ZugenommenSKOV3 wurde in RPMI-1640 mit 10% fötalem Rinderserum geliefert gewachsen.
2. Western-Blot-Analyse für EGFR-Expression
   1. Zelllysate wurden von 2 Millionen Zellen gesammelt und analysiert für die gesamte Proteinkonzentration mit BCA-Assay (Pierce). NIH-3T3 wurde als negative Kontrolle und SKOV3 wurde als positive Kontrolle für EGFR-Expression verwendet.
   2. 10 ug Gesamt-Proteinextrakt wurde auf pre-cast Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)-System bei 135V für 90 Minuten laufen.
   3. Anschließend wurde Gel auf PVDF-Membran durch iBlot Dry Blotting System (Invitrogen) übertragen.
   4. Membran wurde mit 5% fettfreier Milch in Tween-haltiger Tris-Puffer-Kochsalzlösung (TBS-T) für 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert.
   5. Membrane wurde geschnitten und mit 1:1000 Verdünnung des primären Kaninchen beta-Aktin-Antikörper und 1:1000 Verdünnung des primären Kaninchen EGFR-Antikörpern getrennt über Nacht bei 4 ° C.
   6. Membran wurde dann zweimal mitTBS-t und mit 1:2000 Verdünnungen der sekundären Anti-Kaninchen-Meerrettichperoxidase-konjugierten IgG in TBS-T für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
   7. Nach dem Spülen überschüssige Antikörper mit TBS-T und Wasser wurden 4 ml ECL-Substrat (Pierce, Rockford, IL, USA) zugegeben und mit Membranen für 5 Minuten.
   8. Chemilumineszenz-Banden wurden dann visualisiert Kodak Digital X-ray Specimen (DXS) System.
3. Die Lebensfähigkeit der Zellen-Studien mit verschiedenen Formulierungen
   1. Panc-1-Zellen wurden in 96-Well-Platten mit 10.000 Zellen pro Well in 200 ul von DMEM ergänzt Nacht gewachsen.
   2. Growth-Medium wurde mit serumfreiem Medium mit verschiedenen Konzentrationen von Nanopartikeln mit 0, 0,5, 1, 2, 4, 6 mg / ml ersetzt. 1mg/ml PEI, einem bekannten zytotoxischen kationisches Polymer, wurde als positive Kontrolle verwendet.
   3. Die Zellen wurden mit 200 ul Nanopartikel für 6 Stunden behandelt und dann ersetzt mit 20 &mgr; l MTS-Reagenz und 100 &mgr; kompletteKulturmedien.
   4. Im Anschluss an die Inkubation für 3 Stunden bei 37 ° C in 5% CO _2, die Absorption des Formazan-Produkt wurde auf 490nm mit Biotek SynergyHT Plattenlesegerät (Winooski, VT) gemessen.
   5. Der prozentuale Lebensfähigkeit der Zellen wurde als das Verhältnis der Absorption von Polymer-behandelten Zellen gegenüber negativen Kontrolle (0mg/ml) mit 100 multipliziert und aufgetragen als Funktion der Polymer-Konzentrationen.
4. Zell-Handel Studien
   1. Rhodamin B-Isothiocyanat (RBITC) wurde verwendet, um auf thiolierten Gelatine durch die Reaktion mit Amin-Gruppe konjugiert. Nach Dialyse und Gefriertrocknung, beschriftet RBITC thiolierten Gelatine-Nanopartikel-Präparation wurde eingesetzt.
   2. Vor Desolvatation wurde 25 &mgr; l PicoGreen mit 1mg Plasmid für 1 Minute gemischt und beschriftet Plasmide wurden zu Gelatine-Lösung gegeben. Verschiedene Formulierungen wurden nach der bisherigen Methode gemacht.
   3. Panc-1-Zellen wurden in 6-well-Platten kultiviert, die Glas-Deckgläschen mit 200.000 Zellen per gut. Nach Wachstum über Nacht wurden 2 ml des markierten Nanopartikeln in jedes Well mit einer Konzentration von 1mg/ml in serumfreiem Medium behandelt.
   4. Nach verschiedenen Zeitpunkten ab 15 Minuten bis 6 Stunden wurde das Medium mit Kulturmedium mit 1μg/ml der Hoest 33342 (Invitrogen) für 15 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur ersetzt. 2ml 4% Paraformaldehyd-Lösung in jede Vertiefung ersetzt werden, um Zellen zu fixieren. Die Zellen wurden dann mit PBS zweimal gewaschen.
   5. Coversilps wurden auf Glasträger montiert. Laser-Scanning-konfokalen Fluoreszenzmikroskopie wurde verwendet, um Bilder von fixierten Zellen zu nehmen.
5. Qualitative Bestimmung der Transfektionseffizienz durch Fluoreszenz-Mikroskopie mit pEGFP-N1 gekapselte Nanopartikel
   1. pEGFP-N1 Plasmide wurden in Nanopartikeln verkapselt und suspendiert in serumfreiem Medium mit der Konzentration entspricht 10 ug Plasmide pro ml für weitere Behandlungen.
   2. Panc-1-Zellen wurden über Nacht in 6-well Platten Contai gewachsenPlanung Glas Deckgläschen mit 200.000 Zellen pro Vertiefung. 2ml pEGFP-N1 Plasmide gekapselte Nanopartikel wurden in jede Vertiefung behandelt. 20mg von Plasmiden wurden mit 20 &mgr; l Lipofectin, kationische Lipid-Transfektionsreagenz gemischt, und es wurde als positive Kontrolle verwendet, während unbehandelte Zellen als negative Kontrolle verwendet wurden.
   3. Die Zellen wurden mit verschiedenen Formulierungen für 6 Stunden inkubiert.
   4. Das Medium wurde mit Kulturmedium und die Zellen wurden post-transfizierten für 24, 48, 72 und 96 Stunden ersetzt.
   5. Nach nach der Transfektion wurde das Medium mit Kulturmedium mit 1μg/ml der Hoest 33342 (Invitrogen) ersetzt und inkubiert mit Zellen für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
   6. Deckgläser wurden auf Glas-Objektträger aufgebracht und die Expression von GFP in den Zellen wurde mittels Fluoreszenz-Mikroskop beobachtet. Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) und Fluoreszenz-Bilder aufgenommen mit Olympus BX61 Mikroskop und digitalen Bilder wurden mit Image J-Software verarbeitet.
6. Quantitative Bestimmung der Transfektionseffizienz durch ELISA mit pEGFP-N1 gekapselte Nanopartikel
   1. pEGFP-N1 Plasmide wurden in Nanopartikeln verkapselt und suspendiert in serumfreiem Medium mit der Konzentration entspricht 10 ug Plasmide pro ml für weitere Behandlungen.
   2. Panc-1-Zellen wurden über Nacht in 6-well Platten mit 200.000 Zellen pro Vertiefung gewachsen. 2ml pEGFP-N1 Plasmide gekapselte Nanopartikel wurden in jede Vertiefung behandelt. 20mg von Plasmiden wurden mit 20 &mgr; l Lipofectin, kationische Lipid-Transfektionsreagenz, die als positive Kontrolle und unbehandelten Zellen wurden als negative Kontrolle verwendet wurde gemischt.
   3. Die Zellen wurden mit verschiedenen Formulierungen für 6 Stunden inkubiert.
   4. Das Medium wurde mit Kulturmedium und die Zellen wurden nach Inkubation für 24, 48, 72 und 96 Stunden ersetzt.
   5. Im Anschluss an die Transfektion wurden Zelllysate aus jeder Vertiefung gesammelt und analysiert für die gesamte Proteinkonzentration mit BCA-Assay (Pierce).
   6. Well-Platte wurde coaTed mit 100 &mgr; l von 1:1000 Verdünnungen von monoklonalen anti-GFP Antikörper in jede Vertiefung. Nach 2 Stunden Inkubation wurde Platte mit PBS-0.5% (w / v) Tween-80 für 4-mal gewaschen.
   7. 300μl TBS blockiert Puffer wurden in jedes Well zugegeben und für 2 Stunden. Dann Platte wurde dann mit PBS-0.5% (w / v) Tween-80 für 4-mal gewaschen.
   8. 30 &mgr; g von Proteinen aus jeder Gruppe wurden in die Platte gegeben und über Nacht bei 4 °. Dann Platte wurde dann mit PBS-0.5% (w / v) Tween-80 für 4-mal gewaschen.
   9. 100 &mgr; l von 1:2400 Verdünnungen der sekundären anti-GFP Antikörper gegenüber alkalischen Phosphatase wurden in jede Vertiefung gegeben und für 1 Stunde. Dann Platte wurde dann mit PBS-0.5% (w / v) Tween-80 für 4-mal gewaschen.
   10. 100 &mgr; l alkalische Phosphatase-Substrate wurden in jede Vertiefung gegeben und inkubiert für 30 Minuten bis 1 Stunde. Platte wurde mit BioTek Synergy HT-Reader für Absorption bei 405nm gemessen.
   11. Ausgedrückt GFP-Konzentration wurde als Nanogramm pro mi gemeldetlligrams des gesamten Proteins.
7. Qualitative Bestimmung der Transfektionseffizienz durch RT-PCR mit wt-p53-Plasmid gekapselte Nanopartikel
   1. Wt-p53 Plasmide wurden in Nanopartikeln verkapselt und suspendiert in serumfreiem Medium mit der Konzentration entspricht 10 ug Plasmid pro ml für weitere Behandlungen.
   2. Panc-1-Zellen wurden über Nacht in 6-well Platten mit 200.000 Zellen pro Vertiefung gewachsen. 2ml wt-p53 Plasmide gekapselte Nanopartikel wurden in jede Vertiefung behandelt. 20mg von Plasmiden wurden mit 20 &mgr; l Lipofectin, kationische Lipid-Transfektionsreagenz, die als positive Kontrolle und unbehandelten Zellen wurden als negative Kontrolle verwendet wurde gemischt.
   3. Die Zellen wurden mit verschiedenen Formulierungen für 6 Stunden inkubiert.
   4. Das Medium wurde mit Kulturmedium und die Zellen wurden nach Inkubation für 48 Stunden ersetzt.
   5. mRNA wurden aus jeder Vertiefung mit High Pure RNA Isolation Kit (Roche, Indianapolis, IN) extrahiert und gemessen mit Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, Wilminton, DE).
   6. RT-PCR wurde unter Verwendung von QIAGEN durchgeführt One-Step RT-PCR Kit (QIAGEN, Valencia, CA). Primer für p53, Bax, Bcl-2, Beta-Aktin, DR5, Apaf-1, PUMA, wurden Survivin von Eurofins MWG Operon (Huntsville, AL) synthetisiert.
   7. PCR-Produkte wurden mit Gelelektrophorese ausgewertet und die Pixel der cDNA-Banden wurden mit ImageJ-Software analysiert.
8. Quantitative Bestimmung der therapeutischen Effizienz mit wt-p53 palsmid gekapselte Nanopartikel
   1. Wt-p53-Plasmid wurde in Nanopartikeln verkapselt und suspendiert in serumfreiem Medium mit der Konzentration entspricht 10 ug Plasmide pro ml für die weitere Behandlung.
   2. Panc-1-Zellen wurden über Nacht in 6-well Platten mit 200.000 Zellen pro Vertiefung gewachsen. 2ml wt-p53 Plasmide gekapselte Nanopartikel wurden in jede Vertiefung behandelt. 20mg von Plasmiden wurden mit 20 &mgr; l Lipofectin, kationische Lipid-Transfektionsreagenz, die als positive Kontrolle und unbehandelten Zellen wurden gemischtverwendet als negative Kontrolle.
   3. Die Zellen wurden mit verschiedenen Formulierungen für 6 Stunden inkubiert.
   4. Das Medium wurde mit Kulturmedium und die Zellen wurden nach Inkubation für 24, 48, 72 und 96 Stunden ersetzt.
   5. Chromatin-Kondensation / Membranpermeabilität / Dead Cell Apoptosis Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) wurde verwendet, um apoptotische Zellen, nekrotische Zellen und lebende Zellen mit verschiedenen Farbstoffen Etikett.
   6. iCys Research Imaging Cytometer aus CompuCyte (Westwood, MA) wurde verwendet, um zu analysieren und zu vergleichen Apoptose Ebenen nach der Behandlung. Basierend auf der Fluoreszenz-mikroskopischen Aufnahmen wurde die Intensität aller Farben erfasst und aufgetragen gegen zählt und die Prozentsätze für die verschiedenen Populationen wurden berechnet.
   7. Im Vergleich zu den Negativ-Kontrolle, die es keine Behandlung für die Zellen bedeutet, wurden die apoptotischen Zellen falten Veränderungen aus und berechnet gelistet in der Grafik.
   8. 3.8.8 Apo-ONE Homogene Caspase-3 / 7 Assay Kit (Promega, Madison, WI) wurde verwendet, um die p zu untersuchenro-apoptotische Aktivität nach Transfektion von wt-p53-Plasmid. 1mg/ml PEI wurde als negative Kontrolle verwendet, um alle apoptotische Aktivität zu eliminieren. Nach post-Transfektion, Zellen mit Rhodamin 110 behandelt wurden, Bis-(N-CBZL-Aspartyl-L-Glutamyl-L-Valyl-L-Asparaginsäure Amid; Z-DEVD-R110), welches ein Substrat von Caspase 3 / 7, für bis zu 18 Stunden.
   9. Platte wurde mit BioTek Synergy HT-Reader für Fluoreszenz bei 490/520 nm gemessen. Basierend auf die Intensität der grünen Fluoreszenz, könnten pro-apoptotische Aktivität ausgewertet werden.

4. Repräsentative Ergebnisse

1. Synthese und Chatacterization von EGFR gezielte Nanopartikel

EGFR-Targeting-Peptid-Nanopartikel wurden synthetisiert, wie das Schema zeigt in Abb. 1 dargestellt. Die Nanopartikel von Desolvatation bereit waren für die Partikelgröße und Zeta-Potential aus. Die durchschnittliche Größe und Oberfläche der Partikel aus thiolierten Gelatine vorbereitetmit unterschiedlichen Graden der Thiolierung sind in Tabelle 1 aufgelistet. Die mittleren Teilchendurchmesser der verschiedenen Nanopartikel wurden zwischen 150-250 nm. Thiolierten Nanopartikel kleiner im Vergleich zu Gelatine-Nanopartikel könnten aufgrund der Disulfidbrückenbildung innen Partikel. Mit verschiedenen Oberflächenmodifikationen, haben Größen von Nanopartikeln erhöht. Die Zeta-Potentiale der verschiedenen Formulierungen wurden etwa -20 mV. Mit SEM-Analyse wurden die Größen Oberflächenmorphologie und Kugelform von Nanopartikeln beobachtet und entsprechend Zetasizer führen. DNA loading Effizienzen in Gelatine-Nanopartikel und thiolierten Gelatine-Nanopartikel wurden mehr als 95% (Tabelle 1).

Abbildung 1. REAKTIONSSCHEMA illustriert Oberflächenmodifizierung von thiolierten Gelatine-Nanopartikel mit epidermal growth factor-Rezeptor (EGFR) bindende Peptid durch eine Poly (ethylenglycol) (PEG)-Kette.

Charakterisierung von Nanopartikeln

Formulierung	Nanopartikel Durchmesser (nm)	Zeta Potential (mV)	Plasmid-DNA Loading Wirkungsgrad (%)
Gel NP	151,4 ± 23,5	-17,1 ± 5,23	95,6 ± 2,2
SH-Gel NP	132,6 ± 17,9	-24,6 ± 5,16	97,0 ± 3,8
SH-Gel-PEG	179,0 ± 30,9	-22,3 ± 9,50	95,8 ± 6,5
SH-Gel PEG-Peptid	230,8 ± 41,5	-18,1 ± 4,02	94,8 ± 5,1

Tabelle 1. Partikelgröße, Oberflächenladung, und Plasmid-DNA Verkapselungseffizienzen Steuerung und EGFR gerichtete Gelatine und thiolierten Gelatine-Nanopartikel.

Hochauflösende C _1S-Scans von Elektronen-Spektroskopie für die chemische Analyse (ESCA) wurde verwendet, um Oberflächen Bestandteil thiolierten Gelatine (SH-Gel NP), PEG-modifizierte thiolierten Gelatine (SH-Gel PEG) und EGFR-Targeting-Peptid-modifizierten thiolierten Gelatine analysieren Nanopartikel (SH-Gel PEG-Peptid). Die Ergebnisse in Tabelle 2 gezeigt Peakintensitäten der CH (Kohlenwasserstoff), CO (Äther), und C = O (Carbonyl)-Gruppen auf 285,0, 286,3 und 288,1 eV. Der Äther CO-Signal nach PEG-Modifizierung erhöht und verringert nach Peptid-Konjugation. Während die Stickstoff-Zusammensetzung nach der PEG-Modifizierung zurück und stieg nach Peptid-Modifikation, die das Vorhandensein von EGFR-Targeting-Peptid auf den Nanopartikeln bestätigt. ESCA-Analyse hat weitere PEG-und Peptid-Oberflächenmodifizierung bestätigt.

Electron Spectroscopy for Chemical Analysis von Nanopartikeln Zusammensetzung der Oberfläche

Formulierung	C 1s (%)	O 1s (%)	N 1s (%)
SH-Gel NP	59,3 ± 0,8	22,9 ± 0,5	12,9 ± 0,1
SH-Gel-PEG	58,2 ± 0,6	28,0 ± 1,2	9,5 ± 0,7
SH-Gel PEG-Peptid	56,7 ± 0,8	25,9 ± 0,7	12,3 ± 0,6
Formulierung	CC (%)	CO, N (%)	C = O (% )
SH-Gel NP	51,5	26,6	21,9
SH-Gel-PEG	17,1	63,1	19,8
SH-Gel PEG-Peptid	33,1	42,8	24,1

Tabelle 2. C _1S hochauflösende Scans von Elektronen-Spektroskopie für die chemische Analyse (ESCA)

Um die Stabilität der verkapselten Plasmid untersuchen, wurden Nanopartikel mit Protease oder DNAse getrennt behandelt, simuntaneously oder nacheinander. Nach der Elektrophorese wurden die Ergebnisse in Abbildung 2 gezeigt, dass Plasmid-DNA in allen Nanopartikeln verkapselt durch Nanopartikel und stabil, vergleichbar nackte Plasmid-DNA geschützt sind. Diese studiert haben gezeigt, dass all diese Nanopartikel könnten kapseln und die Erhaltung der Plasmid-Struktur nach der Verkapselung.

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Abbildung 2. Stabilität von Plasmid-DNA in thiolierten Gelatine verkapselt, thiolierten PEG-modifizierte Gelatine und EGFR thiolierten Gelatine-Nanopartikel durch Agarosegelelektrophorese Peptid-modifizierten. Die Nanopartikel wurden mit 0,2 mg / ml Protease behandelt, um Plasmid-DNA Kapselung innerhalb der Nanopartikel Matrix beweisen

2. Baseline EGFR Expression in Pankreas-Krebszellen

Zwei menschliche Pankreas-Adenokarzinom-Zelllinien (Panc-1 und Capan-1) wurden mittels Western Blot für EGFR-Expression analysiert. Menschliche Eierstock-Adenokarzinom (SKOV3) und murine Fibroblasten ((NIH-3T3-Zellen) wurden als positive und negative Kontrollen ausgewählt, bzw.. Beta-Aktin wurde als Protein Ladekontrolle analysiert. Panc-1-Zellen haben gezeigt, höhere EGFR-Expression im Vergleich zu Capan-1 und diese Zelllinie wurde dann für die folgenden in-vitro-Studien verwendet

3. Zytotoxizität von Steuerungs-und Surface-Modified thiolierten Gelatine-Nanopartikel

Um die zellulären Wechselwirkungen von Nanopartikeln zu bewerten, wurden Zytotoxizitätsassays out nach der Behandlung mit Nanopartikeln durchgeführt. Basierend auf den Ergebnissen in Abbildung 3, die beide die Kontrolle und die Oberfläche Nanopartikel waren relativ gefahrlos und biokompatibel in Panc-1-Zellen selbst bei hohen Konzentrationen, mit Vergleich zu PEI. Die folgenden Untersuchungen wurden mit 1mg/ml Nanopartikeln durchgeführt.

Abbildung 3. Percent die Lebensfähigkeit der Zellen in Abhängigkeit von Nanopartikel-Formulierung Konzentrationen in Panc-1-Zellen durch Tetrazoliumfarbstoff (MTS)-Assay ausgewertet

4. Rezeptor-vermittelte Zellaufnahme in Panc-1-Zellen

Um zu bestätigen, Oberfläche Zugänglichkeit der EGFR-Targeting-Peptid und Rezeptor-vermittelte Endozytose Aufnahme von Nanopartikeln wurde ein System durch Kennzeichnung jedes co entwickeltmponent mit unterschiedlichen Fluoreszenz für die Visualisierung von Nanopartikeln Aufnahme und-handel in den Zellen. Mit diesem Kennzeichnungssystem könnte Plasmid-DNA, Nanopartikel und Zellkern identifiziert werden. Laser-Scanning-konfokalen Fluoreszenzmikroskopie wurde verwendet, um Bilder zu verschiedenen Zeitpunkten zu nehmen, von 15 Minuten bis 6 Stunden. Durch Vergleich der Bilder von unterschiedlichen Formulierungen zeigte Peptid konjugiert Gelatine-Nanopartikel die schnelle Aufnahme und Plasmid-Freisetzung innerhalb von 30 Minuten. Dieses Ergebnis weiter bewiesen, dass EGFR-Peptid-konjugierten Nanopartikel erleichtert Endozytose unterzog sich mit schnellen Interaktion zwischen den EGFR spezifischen Peptid-und EGFR-Rezeptoren auf der Zelloberfläche, die viel schneller war, im Vergleich zu anderen Nanopartikel, die nicht-spezifische Endozytose unterzogen.

Zell-Trafficking-Studie

Abbildung 4. Konfokale Fluoreszenzmikroskopie einAlysis von DNA-Nanopartikel verkapselt Aufnahme und-handel in Panc-1-Zellen. (Rot = Rhodamin-markierte Nanopartikel, grün = PicoGreen-markierten Plasmid-DNA und blau = DAPI-markierten Nucleus). Die Laserleistung wurde 7 mal weniger in den letzten vier Zahlen der unteren Platte.

5. Qualitative und Quantitative In-vitro-Transfektion mit Enhanced Green Fluorescent Protein

ELISA in Abb. 5 und Fluoreszenz-mikroskopischen Analyse in Abbildung 6 wurden verwendet, um qualitative und quantitative GFP tranfection Effizienz in Panc-1-Zellen bei der Verabreichung von unmodifizierten, PEG-modifizierte und EGFR-Peptid-modifizierten thiolierten Gelatine-Nanopartikel messen. Plasmide von EGFR gerichtete Nanopartikel geliefert resultierte in der höchsten GFP-Expression nach 48 Stunden im Vergleich zu anderen Steuerungen, darunter Lipofectin-komplexierte DNA.

Abbildung 5. GFP Ausdruck einnalyzed durch ELISA aufgetragen als Funktion der Zeit nach der Verabreichung von Plasmid-DNA in Steuer-und EGFR-Nanopartikeln.

Fluoreszenz Mikroskopische Analyse für GFP Transfektion

Abbildung 6. Qualitative Analyse des grün fluoreszierenden Protein-Expression in Panc-1-Zellen durch epifluoresence Mikroskopie nach 24, 48, 72 und 96 Stunden nach der Transfektion mit EGFP-N1. Lipofectin-DNA-Komplex wurde als positive Kontrolle verwendet.

6. In Vitro Tranfection mit Wildtyp-p53 Plasmid in Panc-1-Zellen

Wildtyp-p53-Plasmide Porf-HP53 mit EF-1α / HTLV Hybrid-Promotor wurden von E. extrahiert coli und eingekapselt in Nanopartikel auf die apoptotische therapeutischen Effekt zu studieren. Panc-1-Zellen wurden mit Partikeln für 6 Stunden und für weitere 24 Post-transfiziert, 48, 72 und 96 behandelt Stunden.

Da p53 Apoptose in Zellen induzieren könnten, und um diese Funktion zu erreichen, würden viele nachgeschalteten Transkriptionsfaktoren beteiligt werden und direkt durch die Expression von wt-p53 reguliert. Unter ihnen würden Bax, Caspase-3, Caspase-9, DR5, PUMA und Apaf-1 werden hochreguliert durch die Expression von p53 und während Bcl-2, Survivin wäre herunter reguliert. Um die Höhe dieser Transkriptionsfaktoren zu untersuchen, wurde mRNA von Panc-1-Zellen nach 48 Stunden nach der Transfektion entnommen und für RT-PCR. Die Produkte wurden mit Gelelektrophorese ausgewertet und Bands wurden mit ImageJ analysiert. Basierend auf den Ergebnissen zeigte sich in Abbildung 7, Survivin signifikant verringerte sich mit der Behandlung von EGFR gezielte thiolierten Gelatine-Nanopartikel im Vergleich zu anderen Behandlungen wurde keine deutliche Veränderung der Bcl-2 gesehen, Bax und die Expression von Caspase-3, Caspase-9, DR5, PUMA und mit gezielten Nanopartikel Behandlung Apaf-1increased.

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Abbildung 7. Die mRNA-Spiegel von nachgelagerten Faktoren der wt-p53-Expression wurden mittels RT-PCR nach 48 Stunden nach der Transfektion verglichen.

Nach wt-p53 Transfektion wurde Chromatinkondensation / Membranpermeabilität / Dead Cell Apoptosis Kit verwendet, um apoptotische Zellen, nekrotische Zellen und lebende Zellen mit verschiedenen Farbstoffen unterscheiden. iCys Research Imaging Cytometer aus CompuCyte (Westwood, MA) wurde verwendet, um zu analysieren und zu vergleichen Apoptose Ebenen nach der Behandlung. Im Vergleich zu den negativen Kontrolle wurden apoptotische Zellen falten Veränderungen aus und berechnet gelistet in Abbildung 8. EGFR gezielte thiolierten Gelatine nanopaticles haben die höchsten apoptotischen Zellpopulation nach post-Transfektion. Die Analyse der Caspase 3 / 7 Aktivität zeigten auch, dass EGFR-gezielte Nanopartikel schnelle Verinnerlichung und höchste apoptotische Aktivität in Panc-1-Zellen hatte.

Abbildung 8. Durchflusszytometrische Analyse von pro-apoptotische Aktivität in Kontrolle wt-p53 Panc-1-Zellen mit iCys · Imaging Cytometer transfizierten

Diskussion

Steuer-und EGFR gezielte thiolierten Gelatine-Nanopartikel wurden mit effizienten DNA-Kapselung und Stabilität vorbereitet. Die Teilchengrößen aller dieser Systeme lagen im Bereich von 150-250 nm im Durchmesser. Zeta-Potential hat bewiesen, dass dieses System ein leicht negatives ist. Mit SEM-Analyse wurden die Größen der Nanopartikel das gleiche mit Zetasizer führen. ESCA-Analyse bestätigen könnten PEG-und Peptid-Oberflächenmodifizierung.

Western-Blot-Analyse zeigte, dass Panc-1-Zellen eine hohe EGFR-Expression Ebenen hatte und diese Zelllinie wurde für die in-vitro-Studien eingesetzt. Sowohl die Steuerung und die Oberfläche Nanopartikel waren relativ weniger zytotoxisch in Panc-1-Zellen zu PEI verglichen.

Zell-Handel Studien zeigten eine schnelle Aufnahme und Freisetzung von Plasmid-EGFR-gezielte Nanopartikel in Panc-1-Zellen. Lieferung von Reporterplasmide DNA Ausdruck mit EGFR-Ziel-Nanopartikeln führte in höchsterGFP-Expression im Vergleich zu anderen Steuerungen, darunter Lipofectin-komplexierte DNA. Mit dem gleichen System, ausgelöst Transfektion mit wt-p53-Plasmid der nachgelagerten Apoptoseweg und induziert Apoptose in schnellen Panc-1-Zellen.

Diese vorläufigen Ergebnisse deuten darauf hin, dass der EGFR gerichtete thiolierten Gelatine-Nanopartikel können als eine sichere und effiziente DNA Abgabesystem für die Gentherapie zur Behandlung von Bauchspeicheldrüsenkrebs zu dienen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Typ B Gelatine, Bloom 225	Sigma-Aldrich	G9391
2-Iminothiolan Hydrochlorid	Sigma-Aldrich	I6256
pEGFP-N1-Plasmid	Elim Biopharm	N / A
Porf-HP53 E. coli	Invivogen	Porf-HP53
Glyoxal-Lösung (40wt.% in H 2 O)	Sigma-Aldrich	128465
Glycine	Sigma-Aldrich	410225-250G
QIA Filter Plasmid Mega Kit	Qiagen	12281
Beckman LE 80K Ultrazentrifuge	Beckman	N / A
FreeZone 6 Liter Console Freeze Dry-Systeme	Labconco	7753020
mPEG-SCM, MW 2.000 Da	Laysan	mPEG-SCM-2K-1g
MAL-PEG-SCM, MW 2.000 Da	Jenkem Technologie	A5001-1
Zetasizer Nano	Malvern	Zetasizer Nano ZS
Hitachi 4800 Feldemission Rasterelektronenmikroskop	Hitachi	S-4800 UHR FE-SEM
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagenzien und Kits	Invitrogen	P7589
Lipofectin Transfektionsreagenz	Invitrogen	18292011
DMEM	Mediatech CellGro	10 013 CM
RPMI	Mediatech CellGro	50 020 PB
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
iBlot Dry Blotting-System	Invitrogen	IB1001
XCell SureLock Mini-Cell und XCell II Blot Module Kit CE Mark	Invitrogen	EI0002
Pierce ECL Western Blotting Substrate	Thermo Scientific	32109
Kodak Digital X-ray Specimen (DXS) System	Kodak	N / A	;
CellTiter 96 AQ ueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)	Promega	G3580
BioTek SynergyHT Plattenlesegerät	BioTek	N / A
Nanodrop 2000	Thermo Scientific	N / A
One-Step RT-PCR Kit	Qiagen	210212
Chromatin-Kondensation / Membranpermeabilität / Dead Cell Apoptosis Kit	Invitrogen	V23201
Apo-ONE Homogene Caspase-3 / 7 Assay Kit	Promega	G7790
Hybaid PCR Sprint Thermocycler	Thermo Scientific	N / A
EGF-Rezeptor-Antikörper	ZelleSignalisierung	2232
β-Aktin Antikörper	Zelluläre Signale	4967
Anti-Kaninchen-IgG, HRP-gekoppelten Antikörper	Zelluläre Signale	7074
Monoklonalen Maus-Antikörper GFP	Novus Biologicals	NB600-597
Polyklonaler Ziege GFP-Antikörper (alkalische Phosphatase)	Novus Biologicals	NB600-1502
Phosphatase Substrate Kit	Thermo Scientific	37620