Magnet-Resonanz-Elastographie Methodik für die Beurteilung von Tissue Engineering gewonnenen Konstrukts Wachstum

Zusammenfassung

Das Verfahren zeigt die Methodik der Magnet-Resonanz-Elastographie zur Überwachung der gentechnisch Ergebnis der Fett-und osteogene Gewebezüchtungen Konstruktionen, die durch nicht-invasive lokale Beurteilung der mechanischen Eigenschaften mit mikroskopischen Magnetresonanz-Elastographie (μMRE).

Zusammenfassung

Traditionelle mechanische Tests führt häufig zur Beseitigung der Probe, und im Fall der langfristigen Tissue Engineering gewonnenen Konstrukts Studien, ist die Verwendung von zerstörungsfreie Bestimmung nicht akzeptabel. Eine vorgeschlagene Alternative ist die Verwendung von einem bildgebenden Verfahren Magnetresonanz-Elastographie genannt. Elastographie ist ein zerstörungsfreies Verfahren zur Bestimmung der technisch Ergebnis durch Messen lokalen Werte der mechanischen Eigenschaften (dh komplexe Schermodul) als wesentliche Marker zur Identifizierung der Struktur und Funktion eines Gewebes sind. Als nichtinvasives Mittel zur Auswertung, wurde die Überwachung von technischen Konstrukte mit bildgebenden Verfahren wie Magnetresonanztomographie (MRT) zunehmend Interesse in der letzten Dekade ^{1 zu} sehen. Zum Beispiel wurden die magnetischen Resonanz (MR) der Diffusion und Relaxometrie der Lage, die Veränderungen in der chemischen und physikalischen Eigenschaften während gezüchteten Gewebe Entwicklung ² charakterisieren. Verfahren vorgeschlagendas folgende Protokoll verwendet mikroskopischen Magnetresonanz Elastographie (μMRE) als nichtinvasive MR Technik zur Messung der mechanischen Eigenschaften von kleinen weichen Gewebe ^3. MRE wird durch Kopplung eines akustischen mechanischen Antrieb mit dem Gewebe von Interesse und Aufzeichnen der Scherwelle Fortpflanzung mit einem MR-Scanner ⁴ erreicht. Vor kurzem hat μMRE im Tissue Engineering angewendet worden, um wesentliche Informationen, die traditionell Wachstum gemessen wird mit zerstörerischen mechanischen makroskopischen Techniken ⁵ zu erwerben. In der folgenden Prozedur wird Elastographie durch den Abbildungsbereich von technischen Konstrukte mit einer modifizierten Hahn-Spin-Echo-Sequenz mit einem mechanischen Aktuator gekoppelt erreicht. Wie in 1 gezeigt ist, synchronisiert die modifizierte Sequenz Bildaufnahme mit der Übertragung von externen Scherwellen, anschließend wird die Bewegung sensibilisiert durch die Verwendung von bipolaren schwingenden Paaren. Nach Sammlung von Bildern mit positiven und negativen Bewegung sensitization, komplexe Aufteilung der Daten erzeugen eine Scherwelle Bild. Dann wird das Bild bewertet unter Verwendung eines Inversionsalgorithmus, um eine Schubsteifigkeit Karte ^{6 zu} erzeugen. Die resultierenden Messungen in jedem Voxel haben gezeigt, dass stark korrelieren (R ^2> 0,9914) mit Daten unter Verwendung von dynamisch-mechanischen Analyse ^7. In dieser Studie wird die Elastographie in das Gewebe ein Entwicklungsprozess für die Überwachung von humanen mesenchymalen Stammzellen (MSC h) Differenzierung in osteogene adipogene und Konstrukte wie in Abbildung 2 dargestellt integriert.

Protokoll

1. Gewebekonstrukt Vorbereitung

Das Gewebe konstruieren Vorbereitung Prozess besteht aus drei Phasen: Ausbau der Zellpopulation, Auspflanzung von Zellen auf einem Biomaterial Schafott, und Differenzierung durch den Einsatz chemischer Signalmoleküle. Das Verfahren für die Vorbereitung Konstrukt basiert auf Methoden von Dennis et al., Hong et al., Und Marion und Mao ^8,9,10 durchgeführt wurden.

1. Nach der Kultivierung und Expansion der Zelllinie, Saatgut die humanen mesenchymalen Stammzellen (MSCs h) auf eine Gelatineschwamm (Durchmesser 4 mm, Dicke 3,5 mm) bei einer Dichte von 1x10 ⁶ Zellen / ml für Knochen und 3x10 ⁶ Zellen / ml für Fettgewebe Bildung.
2. Zur Differenzierung von MSCs in Fettgewebe h, wenden Sie die adipösen Induktion Medien, bestehend aus 1 uM Dexamethason, 0,5 uM Isobutyl-Methylxanthin, 10 mu g / ml humanes rekombinantes Insulin-und 200 uM Indomethacin in Zellexpansion Mediumeinmal konfluenten Zellen erscheinen auf dem Schafott. Nach drei Tagen, tauschen Sie den Datenträger mit 10 pg / ml humanem rekombinantem Insulin-Erweiterung in Medien für 24 Stunden dann auf eine Induktionstherapie Medien zurück. Wiederholen Sie den Zyklus dreimal und dann tauschen nur in Medien Wartung alle zwei Tage.
3. Um Osteogenese induzieren, herzustellen osteogener Induktion Medien, indem eine Endkonzentration von 0,1 pM Dexamethason, 50 uM von L-Ascorbinsäure-2phosphate und 10 mM β-Glycerophosphat in Zellexpansion Medium. Ersetzen Sie mit frischen osteogenen Medien alle zwei Tage.

2. Actuator Charakterisierung

Charakterisierung des Antriebs ist ein wichtiger Schritt für die MRE-Experiment. MRE beruht auf der Ausbreitung von mechanischen Scherwellen um die lokalen Werte der mechanischen Eigenschaften zu bewerten, daher müssen diese mechanischen Schwingungen zu erzeugen und in das Gewebe von Interesse unter Verwendung eines piezoelektrischen Aktors charakterisiert werden. Eine illustrierte example der Charakterisierung wird in 3 gezeigt. Das Ziel dieses Verfahrens ist, um die Bewegung des Aktuators zu optimieren, um harmlose Scherwellen mit signifikanten Amplituden (~ 250 Mikron) zu erzeugen.

1. Vor dem Experiment, gelten 0,5% Agarosegel, das Konstrukt in einem 10 mm-Teströhrchen zu umschließen. Die Temperatur des Gels sollte etwa 37 ° C, um eine Beschädigung des Konstrukts zu minimieren.
2. Nachdem sich die Agarosegel 5 Minuten bei Raumtemperatur eingestellt, legen Sie die Spitze des piezoelektrischen Biege-Motor in die Oberfläche des Gels.
3. Befestigen Sie das Röhrchen mit der Probe und den Antrieb auf eine feste Unterlage und richten den Strahl der Laser-Doppler-Vibrometer zur Spitze des mechanischen Antriebs. Stellen Sie die Positionierung des Systems, um das reflektierte Signal zu optimieren, verwenden Reflexfolie, falls erforderlich.
4. Auf Basis der erwarteten Resonanzfrequenz des mechanischen Aktuator, stellen Sie den Funktionsgenerator, um die d fegenesired Frequenzbereich (dh 20 bis 2000 Hz in diesem Experiment) mit einer Betriebsspannung von 20 Vpp mit einem weißen Rauschsignal.
5. Sehen Sie sich die gekennzeichnet Spektrum auf der Polytec Vibrosoft Programm, um die Resonanzfrequenz des Systems zu identifizieren und das Programm so einstellen FFT und Geschwindigkeit als die y-Achse.
6. Für die Wegmessung, stellen Sie den Antrieb, um eine kontinuierliche Sinuskurve bei der angegebenen Resonanzfrequenz mit einer Betriebsspannung von 200 Vpp liefern, und notieren Sie die erzeugte Verschiebung auf die Oberfläche des Gels geliefert. Set Vibrosoft die FFT mit einer Verschiebung auf der y-Achse dargestellt.

3. Image Acquisition

1. Nach Abschluss Antrieb Charakterisierung, legen Sie die Probe und Antrieb in der Mitte des MRI-Scanner. Für Gewebekonstrukt Versuche mit einem kleinen und empfindlichen RF-Spule (dh 10 mm in diesem Experiment) für die Übertragung und den Empfang des HF-Signals. (Das Verfahren gezeigt, verwendet einen 9,4 Tvertikale Bohrung Magnet mit dreifacher Achse Steigungen, 100 g / cm) ausgestattet.
2. Eignen Sie sich ein Scout die Grafik für eine Identifizierung des Konstrukts Lage.
3. Stellen Sie die Parameter für den Erwerb. Eine typische In-vitro-Sagittalschnitt wird eine Wiederholung der Zeit von 1000 ms, Echozeit von 20-40 ms, Schichtdicke von 0,5-1,0 mm, und Sichtfeld von 12x10 mm ² mit einer Matrix von 128x128 Pixel Größe.
4. Für die Elastographie Parameter, stellen Sie den Antrieb Frequenz auf den Wert von der Laser-Doppler-Vibrometer Charakterisierung festgelegt. In der aktuellen Studie wurde ein bipolares Paar mit einem Gradienten Amplitude von 50 g / cm erforderlich. Weitere Parameter zur Einstellung gehören die Verzögerung, die auf Null Millisekunden für die erstmalige Übernahme gesetzt werden soll.
5. Ändern Sie den Funktionsgenerator zu platzen Modus und stellen Sie die Parameter der Funktion Generator zu den in den Elastographie Aufnahme-Parameter einschließlich der Häufigkeit und Anzahl der Zyklen entsprechen. Auch, stellen Sie die Funktiontion Generator extern getriggert werden.
6. Für eine sagittale Bild, stellen Sie den Antrag auf eine Sensibilisierung in der positiven Richtung Scheibe sein und starten den Scan. Nach Erwerb, überprüfen Sie das Bild und ändern Sie die Sensibilisierung auf die negative Richtung Scheibe.
7. Führen Sie den MATLAB-Programm, das die komplexe Division zur Erzeugung der Scherwellen-Bild führt.
8. Beurteilen Sie das Bild auf das Vorhandensein von Scherwellen und mögliche Artefakte wie Phase Verpackung.
9. Wenn keine Einstellungen am Bild erforderlich sind, stellen Sie Parameter Array-Größe zu acht äquidistanten Werten im Bereich von null Sekunden, um eine volle Periode der Resonanzfrequenz gekennzeichnet.
10. Erwerben Sie einen Scan sowohl in den positiven und negativen Schichtorientierungen.
11. Sobald die Bilder erworben werden, verwenden Sie ein MATLAB-Programm zur Erzeugung der Scherwellen-Daten aus einem Array von Bildern konzipiert.

4. MRE Experiment Bildverarbeitung

1. The letzte Schritt der MRE ist es, die Schubsteifigkeit aus den Scherwellen Bilder zu berechnen. Die Platzierung der Daten in den MATLAB-Programm, das den dreidimensionalen Datensatz (2 räumliche, zeitliche 1) bewertet wird.

Hinweis: Mit der Übernahme einer ebenen Transversalwelle, die Bewegungsgleichungen entkoppeln so dass die Schätzung der komplexwertigen Schubmodul in Abhängigkeit von der Verschiebung und der Laplace. Der Algorithmus nähert räumliche zweite Ableitung mit endlichen Differenz und berechnet den Schubmodul auf einer Pixel-für-Pixel-Basis. Von dieser komplexen Zahl, viele mechanische Parameter wie Geschwindigkeit der Scherwelle, Wellendämpfung, Schubsteifigkeit, Scherelastizität, Scherviskosität usw. abgeleitet werden Der Algorithmus erlaubt die Auswahl von interessierenden Bereichen für welche der Mittelwert und die Standardabweichung der Jeder Parameter wird berechnet.

2. Die Bildgebungsparameter müssen zu Beginn des Programms festgelegt werden. Zusätzlich the obere Grenze des Elastogramm eingestellt, um den Kontrast in der Probe zu optimieren.

Hinweis: Das Programm bietet Zwischenergebnisse (Welle nach Tiefpassfilter, Welle nach direktionale Filterung, zeitlicher FFT-, Linien-Profile, etc.), die dem Benutzer schätzen die Treue der Genesung helfen.

3. Einige Parameter können basierend auf diesen Informationen, z. B. die Werte von Tiefpass-Filter, die zeitliche Frequenz der Bewegung, die Ausbreitungsrichtung der Welle, etc. Die Standardabweichung eines Parameters in einer bestimmten Region von Interesse ist, eingestellt werden auch ein Indikator für die Qualität der Berechnung.

5. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 4 stellt fest, die Veränderung der mechanischen Eigenschaften im gesamten vier Wochen der osteogenen und adipogene Konstrukt Entwicklung. MRE wurde bei 730-820 Hz durchgeführt. Während beide seeded Schwämme begann um etwa 3 kPa, osteogenic directed Geweben führte zu einer Steifigkeit von 22 kPa; der Erwägung, dass adipöse Gewebe gerichtet in der Steifigkeit um 1 kPa gesunken. Außerdem zeigten die osteogene Konstrukte eine bemerkenswerte Abnahme der Größe im Vergleich vom Anfang bis zum Ende der Studie. Weitere Objekte Elastographie Studie abgeleitet sind in Tabelle 1 gezeigt.

Abbildung 1. Die Bildaufnahme-Prozess für die Magnetresonanz-Elastographie. Während der Akquisition, steuert eine Impulsfolge (a) die Synchronisation (b) des Funktionsgenerators mit der bipolaren Gradienten Impulse des MRI-Scanner. Nach Erwerb der bipolaren Gradienten in positive und negative Orientierungen umgeschaltet, (c) eine Scherwelle Bild erzeugt mit Hilfe komplexer Division.

Abbildung 2. Flussdiagramm des MRE-Verfahren für das Tissue-EngineEred Konstrukte. Zuerst werden Zellen (a) eine erste gewachsen und die Populationsgröße wesentlich für die gestaltete Projekt. Anschließend werden die Zellen ausgesät (b) auf eine von Biomaterialien und chemische Reagenzien angewendet werden, um die Differenzierung zu signalisieren. Gerüste mit MRE, dessen erste Stufe (c) ist die Bestimmung der Resonanzfrequenz des Aktuators gekoppelt ist, um das Konstrukt ist. Weiter, MRI-Bilder (d) erfasst, um ein Scherwelle Bild (e) zu erzeugen. Schließlich wird ein Algorithmus angewendet, um ein Elastogramm zu ergeben (f) bildet die Steifigkeit des Konstrukts. Gleichzeitig sind Konstrukte für die histologische Beurteilung (g) geschnitten, um die Differenzierung zu validieren.

Abbildung 3. Antrieb Charakterisierung Prozedur. Die Gelatine Gerüst durch ein 0,5% Agarose Gel eingeschlossen. Um die Bewegung in die Probe überführt charakterisieren ein weißes Rauschen wird zuerst in das System gesendet(1a) und die daraus resultierende Bewegung erkannt wird mit Hilfe eines Laser-Doppler-Vibrometer (1b). Wenn die Resonanzfrequenz bestimmt wird, eine kontinuierliche Sinussignal bei Resonanz (2a) an der Verlagerung (2b) übertragen, um die Gelatine Umgebung zu bestimmen.

Abbildung 4. Konstruieren Entwicklung Karte über vier Wochen. Adipogenen (A) und des osteogenen (O)-Konstrukte werden von links nach rechts mit entsprechenden Größe und Scherwelle Bilder, Elastogramm, und die durchschnittliche Schubsteifigkeit gezeigt. Die Farbtabelle für die Elastogramm entspricht dem Farbschema des Balkendiagramms und Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung innerhalb jedes Konstrukt der Region von Interesse.

Tabelle 1. Mechanische Eigenschaften von Fett-und Osteo-Konstrukte über einen Zeitraum von vier Wochen des Wachstums.

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Diskussion

In diesem Verfahren wird das Verfahren der MRE für Tissue Engineering Konstrukte Zellpräparat zur Erzeugung von Elastogramm gezeigt. Durch Anlegen einer mechanischen zerstörungsfreien Prüfung Verfahren zum Tissue Engineering-Pipeline, ist es nun möglich, Änderungen in Engineered Constructs über mehrere Phasen der Entwicklung zu bewerten. Darüber hinaus ergänzt die MRE andere MR-Methoden für die Überwachung mittels Tissue Engineering Konstrukte wie Diffusion, Magnetisierungstransfer und chemische Verschiebung ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material Name	Typ	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
MSCGM-Bullet Kit	Reagens	Lonza	PT-3001	Lagerung bei 4 ° C
1X DPBS	Reagens	Invitrogen	21600-010
0,05% Trypsin-EDTA	Reagens	Gibco, Invitrogen	25300-054	Lagerung bei -20 ° C
Dexamethason	Reagens	Sigma-Aldrich	D2915
3-Isobutyl-1-methylxanthin	Reagens	Sigma-Aldrich	I5879	Lagerung bei -20 ° C
Insulin-Rinderpankreas	Reagens	Sigma-Aldrich	I6634	Lagerung bei -20 ° C
Indomethacin	Reagens	Sigma-Aldrich	I7378
Β-Glycerophosphat	Reagens	Sigma-Aldrich	G9891
L-Ascorbinsäure-2-Phosphat	Reagens	Sigma-Aldrich	A8960
Gelfoam	Gerüst	Pharmacia & Upjohn Co.	09-0315-08
Humanen mesenchymalen Stammzellen	Cell Line	Lonza	PT-2501
9,4 T MR-Scanner	Ausrüstung	Agilent		400MHz WB
10mm Litz Coil	Ausrüstung	Doty Scientific
Laser-Doppler-Vibrometer	Ausrüstung	Polytec	PDV-100
Vibrosoft (20)	Software	Polytec
Funktionsgenerator	Ausrüstung	Agilent	AFG 3022B
Verstärker	Ausrüstung	Piezo-inc	EPA-104 bis 115
Piezo-Bending-Motor	Ausrüstung	Piezo-Inc.	T234-A4Cl-203x
Computer-Linux	Ausrüstung	Prozessor: Intel Core 2 Duo E8400 Speicher: 2G
Computer-Windows-	Ausrüstung	Prozessor: Intel Core 2 Duo E8400 Speicher: 2G
MATLAB	Software	Mathworks, Inc.		2009b