Isolierung und Kultivierung von Neuronen im Hippocampus von Mäusen Pränatale

Zusammenfassung

Wir stellen ein Protokoll für die Kultur von hoch gereinigten hippocampalen Neuronen von der pränatalen Mäusehirn ohne die Verwendung eines Abzweiges Gliazellen Schicht.

Zusammenfassung

Primäre Kulturen von Ratten-und Mäuse-Neuronen im Hippocampus werden häufig eingesetzt, um zelluläre Mechanismen in der Neurobiologie zu offenbaren. Durch die Isolierung und wachsenden einzelnen Neuronen, sind Forscher in der Lage, Eigenschaften im Zusammenhang mit zellulären Transports, Zellstruktur und individuelle Protein-Lokalisierung mit einer Vielzahl von biochemischen Techniken zu analysieren. Die Ergebnisse solcher Experimente sind entscheidend für die Überprüfung von Theorien Adressierung die neuronalen Grundlagen von Gedächtnis und Lernen. Allerdings sind eindeutige Ergebnisse aus diesen Formen von Experimenten auf die Fähigkeit, neuronale Kulturen mit mindestens Kontamination durch andere Zelltypen Gehirn wachsen prädiziert. In diesem Protokoll, nutzen wir Medien für Neuron Wachstum und vorsichtige Präparation von embryonalen hippocampalen Gewebe ausgebildet ist, um das Wachstum von gesunden Neuronen optimiert werden, kontaminierenden Zelltypen (zB Astrozyten). Embryonale Maus hippokampalen Gewebe kann schwieriger zu isolieren als vergleichbare Nagetier Gewebe aufgrund der Größe der Stichprobe für dissection. Wir zeigen detaillierte Analyse Techniken des Hippocampus aus embryonalen Tag 19 (E19) Maus Welpen. Sobald hippocampalen Gewebe isoliert wird, wird sanft Dissoziation von neuronalen Zellen mit einer verdünnten Konzentration von Trypsin und mechanische Zerreißen zur Trennung von Zellen aus dem Bindegewebe erreicht werden, während nur ein Minimum an Schädigung einzelner Zellen. Eine detaillierte Beschreibung, wie Pipetten vorzubereiten, in der Störung verwendet werden soll, enthalten. Optimale Beschichtung Dichten werden für Immun-Fluoreszenz-Protokolle, um erfolgreich Zellkultur zu maximieren. Das Protokoll ermöglicht einen schnellen (etwa 2 Stunden) und effiziente Technik für die Kultur von neuronalen Zellen aus Maus hippocampalen Gewebe.

Protokoll

1. Set-up vor der Ernte

1. Um pränatale Welpen für Neuron Ernte zu erzeugen, planen Zucht zwischen erwachsenen Mäusen 19 Tage vor dem Tag des Neurons Isolation. (C57BL / 6 Mäusen im Alter von 2-8 Monaten wurden in Paarungen für die Zwecke der Entwicklung dieses Protokolls verwendet). Erfolgreiche Paarung durch Nachweis einer vaginalen Stecker kann in der weiblichen, Herzklopfen oder visuelle Bestätigung einer Schwangerschaft bestätigt werden.
2. Der Tag vor dem Neuron Trennung:
   1. Für Anwendungen Immunfluoreszenz, Beschichtung von Glas-Deckgläschen in einer 24-Well-Platte mit einer leichten Beschichtung von 3:1 Kollagen 1, Rat Tail: Poly-D-lysin-Lösung.
   2. Für die Zellkultur-Anwendungen, Mantel geeigneter Größe Gewebekultur Plastmetall mit einer leichten Beschichtung von 3:1 Kollagen 1, Rat Tail: Poly-D-Lysin-Lösung.
3. Seien Sie der Platten in einer Gewebekultur Haube aufgedeckt unter UV-Licht über Nacht.
4. Waschen der Platten mit sterilem Hank-Saldo Salzlösung (HBSS) vorzu verwenden. Beschichtete Platten können mit HBSS gefüllt und bis zu einer Woche bei 4 ° C im Dunkeln gelagert.

2. Tissue Ernte

1. Sterilität ist immer ein Faktor beim Anbau von primären Zellkulturen und als solche, die größte Vorsicht geboten, um sicherzustellen, das die meisten sterilen Umgebung ermöglicht werden. Mit viel Liebe zum sterilen Technik, können anfängliche Dissektion und Ernte von Nervengewebe für dieses Protokoll außerhalb einer sterilen Werkbank mit minimalem Risiko einer Kontamination abgeschlossen sein. Nach ersten Ernte, sollten alle nachfolgenden Schritte unter sterilen Bedingungen maximal innerhalb einer Haube für die Zellkultur bewertet geführt werden.
2. Euthanize eine schwangere Maus bei ca. 19 Tage nach der Befruchtung durch Enthauptung. Anwendung von Betäubungsmitteln, um die schwangere Frau Sterbehilfe wird nicht empfohlen, da Narkose ist bekannt, dass Gehirn Zelltod (Stratmann et al., 2010). Mit einer sterilen Pinzette Dissektion und schaffen eine Öffnung in der Mitte der Bauchseite desMaus, um vollständig offenbaren Körperhöhle. Instrumente können mit Alkohol sterilisiert und eine offene Flamme sein.
3. Pränatale Welpen werden sich zum hinteren Ende der Maus Körperhöhle befinden und gut sichtbar in der Gebärmutter. Mit autoklavierten sterilen Pinzette, öffnen Sie die Gebärmutter zu entfernen und Welpen. Enthaupten Welpen mit frischem sterilen Schere und Ort entfernt Kopf auf steriler Gaze unter einem Binokular. Sterile, autoklaviert Instrumenten kann mit den gleichen Reinigung mit Alkohol und einer offenen Flamme vor und während des Gebrauchs.
4. Mit einer sterilen Schere oder Skalpell, offene Schädel Welpe von Nacken bis zur Nase. Dieser Vorgang ist in der Regel durch Einsetzen einer Spitze der Schere in die Wirbelloch und dann weiter nach vorn abgeschlossen sein. Entfernen Sie vorsichtig das gesamte Gehirn mit einer Pinzette. Platzieren Sie das Gehirn auf steriler Gaze. Mit einem sterilen Skalpell, entfernen Sie das Kleinhirn und einzuschneiden Sie die Mittellinie des Gehirns, um es in zwei Hemisphären (Abbildung 1) trennen .
5. Fassen Sie einen kleinen Ausschnitt aus den Hippocampus umgebenden Hirnhäute mit einer sterilen Pinzette und ziehen Sie sie vorsichtig weg. Obwohl es nicht unbedingt erforderlich ist, um die Hirnhaut vor Isolierung des Hippocampus zu entfernen, kann das Vorhandensein der Hirnhäute machen die Präparation des Hippocampus schwieriger wegen der Zähigkeit der Membran. In jedem Fall wird der Hippocampus deutlicher sichtbar, nachdem die Meningen entfernt wurden. Der Hippocampus eine gekrümmte Struktur, die im distalen Teil der Halbkugel und biegt ventral (2) beginnt. Wenn die innere, konkave, Seite (kaudale) vor einer Herzkammer, ist es bereits frei. Um daher die Hippocampus isolieren, muss man entlang der konvexen Außenseite geschnitten. Nach der Präparation, heben einander hippocampi mit einer sterilen Pinzette und Überführung in eine kleine Gewebekulturschale mit erwärmten (37 ° C) HBSS unter einer Zellkultur Kapuze. Hirngewebe kann aus mehreren Welpen kombiniert werden.

"> 3. Gewebedissoziation

1. Mit einem sterilen Skalpell, sanft Blatt Gehirngewebe in 3 ml steriler HBSS in einer 100 mm Gewebekulturplatten.
2. Übertragen des zerkleinerten Gewebes und HBSS in ein 15 ml konischen Röhrchen. 1,5 ml HBSS und 0,5 ml 0,25% Trypsin-Lösung auf ein Gesamtvolumen von 5 ml.
3. Cap und Das Röhrchen vorsichtig 4-5 mal zu mischen. Vermeiden Sie Blasen entstehen, wie DNA aus dem Gewebe freigesetzt verdaut, um die Blasen haften wird und das zerkleinerte Gewebe führen, anstatt zu schweben der sich am Boden des Rohres (3).
4. Inkubieren hippocampalen Gewebe bei 37 ° C für 15 Minuten, Umdrehen des Röhrchens wie oben alle 5 Minuten.
5. Lassen Sie die Gewebe zum Boden des Röhrchens zu regeln.
6. Vorsichtig überschüssige Lösung mit einer sterilen Pipette, so dass Gewebe ungestört am Boden des Röhrchens.
7. Waschen Gewebe Pellet mit 5 ml HBSS bei 37 ° C für 5 Minuten. Wiederholen Sie insgesamt 3-mal. Erlauben Gewebe vollständig zu begleichender Boden des Röhrchens jedes Mal, bevor zum nächsten Waschschritt.
8. Entfernen Sie die letzten Wäsche aus dem Gewebe zu ersetzen und Pellet mit 2 ml frisches HBSS.

4. Neuron Trituration

1. Vor Beginn der Verreibung Schritte, müssen Sie feuerpolierte Pasteurpipetten vorzubereiten. Mit einem Bunson Brenner, halten Sie eine sterile Pasteurpipette 9-Zoll-Spitze (Abbildung 4a) in der Flamme, bis Durchmesser der Pipette Öffnung beträgt etwa 0,5 mm groß und die Kanten der Öffnung Pipette wurden geringfügig (Abb. 4b) abgerundet. Erlauben Pipette vollständig abkühlen, bevor mit der Verreibung Prozess.
2. Mit einem normalen sterilen Pasteurpipette 9 Zoll, sanft verreiben das Gewebe insgesamt 7-mal. Größere Gewebestücke sind normal an dieser Stelle und sollte gestattet werden, an der Unterseite des Rohres vor dem Bewegen mit dem nächsten Schritt zu begleichen.
3. Übertragen Sie den Überstand in ein frisches steriles 50 ml konischen Röhrchen.
4. Wird der restliche Gewebe, 2 ml sterilem HBSS und verreiben insgesamt 5-mal mit dem Feuer poliert Pasteurpipette.
5. Zulassen, dass alle verbleibenden größeren Gewebeteile an den Boden des Röhrchens absetzen und kombinieren Überstand mit dem vorherigen Überstand für insgesamt 4 ml dissoziiert neuronalen Zellen.

5. Zellaussaatdichten

1. Zählen Sie die dissoziierten Zellen mit einer Zählkammer.
2. In der Regel, wenn die Zellzahlen bestimmt worden sind, zu subtrahieren 20% von diesem endgültige Zahl, um einen möglichen Zelltod, die nach Beschichtung auftreten können.
3. Die Zellen lassen sich veredeln mit Hilfe der nachstehenden Empfehlungen werden:
   Für Deckgläser in einer 24-Well-Platte - 6 x 10 ⁴ Zellen / Vertiefung in 0,5 ml
   Für 60 mm Gewebekulturplatten - 4 x 10 ⁵ Zellen / Platte in 3 ml
   Für 100 mm Gewebekulturplatten - 6 x 10 ⁶ Zellen / Platte in 6 ml
4. Mischen Sie entsprechende Zelle mit Zahlen angegebenen Volumen von Neurobasal Plattierungsmedien (NeurobasalMedien mit B27 Ergänzung [1 ml / 50 ml], 0,5 mM Glutamin-Lösung, 25 uM Glutamat (Herr 147,13 g / mol), Penicillin (10.000 Einheiten / ml) / Streptomycin (10.000 pg / ml) [250 ul / 50 ml] , 1 mM HEPES (Mr 238,3 g / mol), 10% hitzeinaktiviertem Donor-Pferdeserum) und fügen Sie Zellen auf Platten. Swirl Platten vorsichtig, um Zellen gleichmäßig zu verteilen. HALLO-Donor-Pferdeserum wird auf die Auflage Medien zugegeben, um die Zellen in den ersten 24 Stunden Wachstum zu bereichern. Die Zellen werden anschließend aus dem Serum entwöhnt und wieder in einer serumfreien Umgebung durch serielle Verringerung des Serum bei jedem Medienersatzeinheitenelement. Es sollte auch angemerkt, dass, während bei höheren Konzentrationen Glutamat ist giftig für neuronalen Zellkulturen, bei den niedrigeren Konzentrationen zugegeben hier wird die Anlage von nicht-neuronalen Zellen ¹¹ zu hemmen. Es sollte jedoch nur auf die Plattierungsmedien für die ersten 24 Stunden in Kultur zugegeben und anschließend nach links aus allen Zufuhr von Medien zu Neurotoxizität der Zellen zu verhindern.
5. Pschnüren Neuronen in einem 37 ° C, 5% CO _2-Inkubator über Nacht.
6. Entfernen Hälfte des Volumens der Medien aus den Zellen und ersetzen gleichen Volumen Neurobasal Zufuhr von Medien (Neurobasal Medien mit B27 Ergänzung [1 ml / 50 ml], 0,5 mM Glutamin Lösung, Penicillin (10000 Einheiten / ml) / Streptomycin (10.000 g / ml) [250 pl / 50 ml], 1 mM HEPES (Herr 238,3 g / mol).
7. Neuronen sollte gespeist alle 4 Tage durch die Beseitigung der Hälfte der alten Medien und ersetzt sie mit dem gleichen Volumen an frischem Neurobasal Zufuhr von Medien werden. Neuronale Prozesse beginnen sollte sichtbar sein am Tag 1 (Abbildung 5a) und werden häufiger von Tag 10 (Abbildung 5b).

6. Repräsentative Ergebnisse

Die Fähigkeit, zu wachsen und Kultur primärer neuronaler Zellen hat sich zu einem unverzichtbaren Bestandteil der Neurowissenschaften. Primäre Kulturen erlauben dem Forscher spezifische zelluläre Signalwege zu analysieren, chemische Modifizierung und Behandlung, Ziel-locrung und Wachstumsmuster in einer kontrollierten Umgebung. Viele dieser Verfahren nutzen ausgefeilte Methodik, um spezifische Veränderungen in Zell-Reaktionen zu visualisieren. In diesem Fall werden die Neuronen im Hippocampus verwendet, um bestimmte Nervenbahnen, die sich als schwierig erweisen, wenn nicht unmöglich, im intakten Gehirn zu analysieren wäre zu studieren. Herstellung von in der Nähe homogene Populationen von Neuronen aus bestimmten Bereichen des Gehirns ist von entscheidender Bedeutung für die Untersuchung Gehirnfunktion. Molekulare Effekte in einzelnen Neuronen können maßgeblich bei der Abgrenzung höherer Ordnung Wege, wie Gedächtnis oder Lernen. Da dieses Protokoll liefert relativ reinen Kulturen von hippocampalen Neuronen, ohne die Notwendigkeit einer Feeder-Schicht von Gliazellen, werden diese Neuronen leicht Immunfluorezenzanalysen verwendet. Doch wie bei allen primären Kultur von Organen mit mehreren Zelltypen, können einige Verunreinigungen durch weniger gewünschten Zellen auftreten. In Isolierung von neuronalen Zellen, können Verunreinigungen durch Gliazellen ein weit verbreitetes Problem zu sein. Gliazellen cein leicht auf mikroskopische Sichtbarmachung der Kultur nachgewiesen werden, da deren Morphologie unterscheidet sich deutlich von den Zielneuronen (Abbildung 6). Die Auswirkungen der Kontamination Gliazellen sind von den geplanten Einsatz der Kulturen ab. Wenn Zellen, die für Immun-Fluoreszenz-Untersuchung verwendet werden, können Gliazellen Verunreinigung nicht mehr als eine Unannehmlichkeit sein, wenn man versucht, einzelne Neuronen zu fotografieren. Allerdings, wenn die neuronalen Kulturen, um zur biochemischen Analyse verwendet werden sollen, könnte eine erhebliche Kontamination durch Gliazellen zu größeren Verschiebungen bei den Ergebnissen. Ways to Gliazelle Kontamination anzusprechen sind weiter in der Diskussion skizziert.

Wenn Neuronen wurden erfolgreich isoliert und in Kultur gezüchtet werden, ist eine typische Anwendung, zelluläre Prozesse zu prüfen Immunfluoreszenz Techniken. Wie in 7 dargestellt ist, kann Organellen, wie den Mitochondrien, gefärbt unter Verwendung Vitalfarbstoffe zugegeben, um den Kulturmedien vor fixierenation. Endogenen zellulären Proteine ​​sichtbar gemacht werden von festen Zellen unter Verwendung von Standard-Immunfluoreszenz-Techniken (8). Sobald neuronalen Zellen fixiert sind, können spezifische Antikörper für Proteine ​​von Interesse für die Zelle eingeführt werden und diese Proteine ​​kann visualisiert werden mit einem Fluoreszenzmikroskop. Kultivierten Neuronen bieten auch die Forscher mit den Mitteln, um einzelne Protein Auswirkungen auf neuronale Funktionen zu untersuchen. Mit einer Vielzahl von Techniken, einschließlich DNA-Transfektionen, Elektroporation oder virale Transduktion, können Proteine ​​in neuronalen Zellen (9) überexprimiert werden. Wie Nervenzellen zu den Auswirkungen von überexprimierten Proteinen reagieren können, haben direkten Rückschlüsse auf, wie das Gehirn reagieren kann und bietet die Möglichkeit der Identifizierung zellulärer Ziele für medikamentöse Behandlungen. Die Einzelheiten dieser Arten von Experimenten gehen über den Rahmen dieser Arbeit aber sie zeigen, dass Kulturen durch diese Technik vorbereitet für eine breite Palette von Down-s sindtream Anwendungen. Jedoch darf insgesamt Einfachheit dieses Protokolls sowie, machen den kurzen Zeitraum erforderlich, um diese neuronalen Kulturen vorzubereiten dies eine ideale Methode für den Einsatz in der heutigen Neurowissenschaften.

Abbildung 1. Präparation des pränatalen Gehirn der Maus. Der erste Schnitt ist nach unten die Mittellinie des Gehirns trennt sie in zwei Hemisphären.

Abbildung 2. Lage des Hippocampus in der pränatalen Gehirn der Maus. Das Striatum gebildet, um den Hippocampus visualisieren bewegt und durch die gekrümmte "Bohne" Struktur in dem distalen Bereich jeder Hemisphäre festgestellt.

Abbildung 3. Dissoziation von Hippocampus-Gewebe in Trypsin-Lösung.

Abbildung 4. Pasteurpipette Tipps in Verreibung von Hippocampus-Gewebe verwendet. (A) Normal Pasteurpipette Spitze. (B) Feuer-polierten Pasteur Pipettenspitze. Beachten Sie die abgerundeten Kanten und die ungefähre 50% ige Abnahme in Pipettenöffnung Größe.

Abbildung 5. Hippocampus-Neuronen isoliert mit diesem Verfahren und vernickelt in NB Media. (A) Das Wachstum der Zellen 1 Tag nach dem Ausplattieren. Neuronale Prozesse beginnen sichtbar zu sein bei Tag 1. (B) Das Wachstum der Zellen 10 Tage nach dem Ausplattieren werden Neuriten verzweigt und Überschneidungen.

6. Hippocampusneuronen mit Gliazellen für 7 Tage kultiviert kontaminiert und gefärbt mit der Organelle Marker MitoTracker Red CM-H2XRos (Invitrogen # M7515) und transfected mit GFP-LC3 Verwendung von Lipofectamin 2000 (Invitrogen # 11668019). Mitochondrien sind sichtbar in allen Zellen jedoch nur ein einzelnes Neuron wurde erfolgreich mit dem fluoreszierenden Konstrukt transfiziert. Kontamination mit Gliazellen macht Analyse der GFP-LC3-Expression in den neuronalen Prozessen schwierig zu visualisieren.

Abbildung 7. Hippocampusneuronen 7 Tage lang gewachsen und gefärbt mit der Organelle Markers MitoTracker Red CM-H ₂ Xros (Invitrogen # M7513). Dies ist ein wesentlicher Farbstoff verwendet wird, um aktive Mitochondrien in Gewebekulturzellen zu färben. Die Zellen wurden in 4% Paraformaldehyd / PBS fixiert und mit Hilfe von Fluoreszenz-Mikroskopie. Der Farbstoff selbst nicht fluoreszent ist, bis in den Mitochondrien oxidiert. Aktive Mitochondrien finden sich in den neuronalen Prozessen gesehen werden.

8. Hippocampusneuronen für 7 Tage kultiviert, mit 4% Paraformaldehyd / PBS und mit monoklonalen Anti-Tubulin-β-Antikörper (Sigma # T0198) Immuno-gefärbt befestigt. Nach der primären Antikörper, Oregon Green markierten Ziege-anti-Maus-sekundären Antikörper (Invitrogen # O11033) wurde zugegeben und die Fluoreszenz-Mikroskopie visualisiert.

9. Den neuronalen Kulturen wurden für 5 Tage kultiviert und transfiziert mit GFP-LC3β DNA-Konstrukt unter Verwendung von Lipofectamin 2000 (Invitrogen # 11.668.019). Am Tag 7 wurden die Zellen fixiert mit 4% Paraformaldehyd / PBS und Aggresomen markiert mit GFP LC3β in ihrer äußeren Membran eingebaut wurden mittels Fluoreszenz-Mikroskopie. Aggresomen sind in der gesamten Zellkörper und Neuriten und sind mit Pfeilen gekennzeichnet.

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Diskussion

Hippokampalen Kulturen haben in der Molekularbiologie seit mehr als 20 Jahren verwendet. Während im Prinzip neuronale Kulturen von jedem Teil des Gehirns vorgenommen werden können, haben hippocampalen Kulturen sich als höchst populär aufgrund der relativ einfachen Architektur des Nerven Zellpopulation im Hippocampus ⁷ sein. Hippokampuskulturen werden typischerweise aus Late-Stage-embryonalem Gewebe gefertigt. Dieses Gewebe ist leichter zu distanzieren und enthält weniger als Gliazellen tut reifen Gehirng...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenz	Verkäufer	Katalog-Zahl
Rattenschwanzkollagen 1	BD Biosciences	354236
Poly-D-Lysin-Lösung	Chemicon	A-003-E
Hanks Balanced Salt Solution	Invitrogen	14175-095
Trypsin-Lösung (1X) 0,25%, flüssiges	Invitrogen	15050-065
Neurobasalmedium (1X) Flüssigkeit	Invitrogen	21103-049
B27 Supplement (50X) Flüssigkeit	Invitrogen	17504-044
L-Glutamin 200 mM (100X) Flüssigkeit	Invitrogen	25030-149
Penicillin (10000 Einheiten / ml) / Streptomycin (10.000 g / ml)	Invitrogen	15140-148
HALLO-Donor-Pferdeserum	Atlanta Biologicals	S12150H