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Die Drosophila Ei Kammer ist ein ausgezeichnetes Modell für die Erforschung der Mechanismen der mRNA-Lokalisierung. Um die dynamische Ereignisse, die die Prozesse der Lokalisierung untermauern zu erfassen, ist eine schnelle hochauflösende Bildgebung von lebendem Gewebe erforderlich. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Präparation und Bildgebung von Live-Proben mit minimalen Unterbrechungen.
Live Cell Imaging ist eine wichtige Technik angewendet, um eine Reihe von Drosophila Gewebe als Modelle verwendet, um Themen wie Achsen-Spezifikation, die Zelldifferenzierung und Organogenese 1 zu untersuchen. Richtige Vorbereitung der experimentellen Proben ist ein wichtiger, jedoch oft vernachlässigte Schritt. Das Ziel der Vorbereitung ist es, physiologische Relevanz zu gewährleisten und optimale Aufnahmebedingungen zu schaffen. Um die Lebensfähigkeit des Gewebes zu erhalten, ist es entscheidend zu Dehydratation, Hypoxie, Überhitzung oder Verschlechterung Medium 2 zu vermeiden.
Die Drosophila-Ei Kammer ist ein gut etabliertes System zur Prüfung von Fragen im Zusammenhang, aber nicht beschränkt, um Körper Musterung, mRNA Lokalisation und Organisation des Zytoskeletts 3,4. Für Early-und Mid-Stage Ei Kammern, die Montage in Halocarbonöl ist gut für das Überleben, dass es freie Diffusion von Sauerstoff ermöglicht, verhindert das Austrocknen und Hypoxie und verfügt über hervorragende optische Eigenschaften für die Mikroskopie. ImAlterung der fluoreszierenden Proteinen besteht in der Einführung von Transgenen in das Ei Kammer oder physikalische Injektion von markierten RNA-, Protein oder Antikörper 5-7 möglich. Zum Beispiel erlaubt die Aufnahme MS2 Konstrukte in das Genom von Tieren Echtzeit-Beobachtung von mRNAs in der Eizelle 8. Diese Konstrukte können für in vivo-Markierung von mRNA durch Nutzung des MS2-Bakteriophagen-RNA-Stammschleife Interaktion mit dem Hüllprotein 9.
Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Extraktion von Eierstöcken sowie Isolierung einzelner Ovariolen und Ei Kammern aus der weiblichen Drosophila. Für eine detaillierte Beschreibung von Drosophila Oogenese siehe Allan C. Spradling (1993, neu aufgelegt 2009) 10.
1. Drosophila Vorbereitung vor für die Dissektion (nach E. Gavis, Princeton University)
Hinweis: Alternativ Vormischung eine Hefe in einem separaten Behälter Paste zermahlen und die Paste in das Fläschchen mit einem Spatel.
2. Drosophila Ovar Dissektion
3. Isolating Ovariolen
Hinweis: Jeder Eierstock enthält ca. 16 bis Ovariolen mit 6 bis 10 Eikammern der verschiedenen Stufen, wie Perlen auf einer Schnur 10 angeordnet hat.
Hinweis: Vor der Isolierung der Ovariolen, passen Sie die Lichtquelle auf der Seziermikroskop so dass das Licht angestrahlt in einem flachen Winkel auf die Probe. Man erhält Gegensatz zu der Probe und erlaubt die Visualisierung der jungen Stadium Eikammern.
Hinweis: Einzelne Ovariolen wird zwischen den jungen Stadien (Germarium bis 10-Stadium) zu brechen, wie die älteren Stadien zu groß, um aus der vollständigen Eierstock getrennt werden sollen.
Hinweis: Punktieren einer späten Phase Eizelle mit dem Sezieren Sonde wird im Zytoplasma in das auslaufende Öl führen und das Herauslösen einzelner Ovariolen sehr anspruchsvoll. Wenn ein Spätstadium Eizelle punktiert wird, zu einem frischen Eierstock bewegen.
Hinweis: Es ist ratsam, einen Eierstock jeweils aus mehreren Fliegen anstatt Sezieren beide Eierstöcke von weniger Fliegen, um die n Anzahl der Fliegen für das Experiment zu erhöhen sezieren.
Hinweis: Durch eine grobe Behandlung der Ovariole wird in ungesunden Eizellen führen und kann zu Artefakten im Experiment führen.
Hinweis: Die Oocyten beginnt phänotypische Veränderungen aufgrund bis 40 Minuten nach dem aus dem Eierstock (vergleiche 7E bis F) seziert betonen anzuzeigen.
4. Isolierung einzelner späten Stadium Ei Kammern (Nach E. Gavis, Princeton University)
Hinweis: Eine Punktion eine Eizelle während Sezieren späten Stadium Ei Kammern ist nicht so verurteilen, wie ich mit SezierenNDIVIDUELLE Ovariolen für jüngere Stadien.
Hinweis: Bei Stufe 14 Eikammern, verwenden Sie die Zange, um die dorsalen Anhänge zur Orientierung zu erfassen.
5. Injektionspräparat
Hinweis: Für die Injektion von Oozyten Mitte der Bühne, orientieren die Ovariolen senkrecht zur Längsachse des Deckglases.
6. Die Injektion von fluoreszierenden RNA
Bevor Sie beginnen: Stellen Sie die Einspritzvorrichtung und Mikro-Manipulator Kontrollen, so dass die Injektionsnadel über der Mitte des Sichtfeldes positioniert ist.
Hinweis: Bei Verwendung eines automatisierten Bühne mit Punkt Besuch Fähigkeit ist es ratsam, alle von der Bühne 8-9 Oozyten für die Injektion vor Beginn markieren. Dies ermöglicht eine einfache und besuchen Injektion von ausgewählten Oozyten.
Hinweis: Der gesamte Prozess sollte Injektion weniger als 10 Sekunden dauern, wenn richtig ausgeführt. Umfangreiche stechender oder Verweilen mit der Nadel im Inneren zu Eizelle führt zu schweren Schäden an der Ei Kammer führen.
Hinweis: Wenn ein Fehler gemacht wird während der Injektion mit dem nächsten markiert Eizelle zu bewegen. Verschwenden Sie keine Zeit auf beschädigten Eizellen.
Hinweis: Die Nadel kann verstopft werden während einer Injektion Sitzung. In diesem Fall verschieben Sie die Nadel neben dem zerbrochenen Stück Glas in der Öl-auf dem Deckglas. Witzh das Glas und die Nadel in der gleichen Bildebene, sanft rammen die Nadel in das Glas (Abb. 6H). Testen Sie, dass die Nadel, indem Sie den Injektionsknopf und zu sehen, wenn eine Flüssigkeit verlässt die Spitze der Nadel ist verstopft.
Hinweis: Wenn eine erweiterte Zeitspanne zwischen Eikammer Isolierung und Oocyteninjektion verstrichen ist, wird es schwierig Oozyten zu injizieren und phänotypischen Veränderungen aufweisen mit Stress verbunden. Ähnliche Probleme können bei grober Handhabung der Eizelle oder Injektion von überschüssigen Mengen (vergleiche die Abbildungen 6I, J, K) ergeben.
7. Live-Imaging-experimentelles Design
8. Repräsentative Ergebnisse
In vitro synthetisiert Alexa-546 GRK-RNA in einer Me31B :: GFP Eikammer (7A) injiziert. Die RNA lokalisiert an der dorsalen vorderen der Eizelle und bildet eine Kappe um den Kern (7B). Weitere Beispiele für RNA Lokalisation siehe MacDougall N., et al. (2003) 11.
Mitte und Ende der Etappe exprimierenden Oozyten fluoreszenzmarkierte Protein (Tau-GFP, 7C) oder RNA-Tagging-Systeme (GRK * mCherry, 7D) können ohne Injektion abgebildet werden.
Abbildung 1.
Abbildung 2.
Abbildung 3.
Abbildung 4.
Abbildung 5.
Abbildung 6.
Abbildung 7.
Live Cell Imaging ist ein leistungsfähiges Assay zur Untersuchung zellulärer Prozesse in Echtzeit. Neben der einfachen Hellfeld-Beobachtung hat der Zusatz von fluoreszierenden Markierungen an Proteine und RNAs von Interesse führen zu vielen Durchbrüchen. Hier haben wir ein Protokoll für die Bildgebung individuelles Wohnen Eizellen, die in Kombination mit genetischen und biochemischen Assays genutzt werden können umrissen.
In diesem Protokoll auch erklären, wie experimentell zu manipulieren lebenden Oozyten durch Injektion. Es gibt viele Möglichkeiten für das Material zu injizieren, einschließlich In-vitro synthetisiert fluoreszenzmarkierten RNA-Assay die Fähigkeit einer sekundären Struktur, um direkte RNA Körperregion (Ball und Davis, unveröffentlicht) und Antikörper, die die Funktion von Proteinen 6 inhibieren. Zukünftige Arbeiten werden wahrscheinlich sehen die Einführung anderer Etikettierung Komponenten und zelluläre Maschinerie zur lebenden Eizellen ermöglichen molekularen Mechanismen zu testen.
t "> Die Erhaltung der Rentabilität und Lebensfähigkeit des Gewebes ist von wesentlicher Bedeutung bei der Arbeit mit lebenden Zellen. In diesem Protokoll, weisen wir darauf hin eine Reihe von Schritten, die auf Stress des Eies Kammer führen kann. Zum Beispiel, trotz Öl überlegen for Imaging, erweiterte Kulturbegriff in der Öl kann dazu führen, auf dem Ei Kammer zu betonen. Dies kann leicht unter Hellfeld Belichtung werden durch Untersuchung des Zellkerns und Position, Membran, die Eizelle zu verzerren und wird bleb unter Stress (vgl. Abbildung 7E (unbelasteten) zu Figure7F überwacht werden ( betonte)). Stage 9 Eikammern zeigen RNA Lokalisation und Grenze Zellmigration 12 über mehrere Stunden. jedoch ein Stadium 8.7 Eikammer beginnt zu negativen Auswirkungen in Halo Kohlenstoff Öl nach etwa 40 Minuten von den Eierstöcken entfernt von dem weisen weiblich. Spätstadium Eikammern, Stufe 11 bis 14, kann sich normal entwickeln entweder in Öl oder wässrigen Medien wegen der Sekretion der Eischale von den Follikelzellen in diesen Phasen 13. Es war Reported, dass die Zugabe von Insulin zu wässrigen Medium Insekten-Stufe 9 Oozyten bis zu 6 Stunden 14 und germaria bis zu 14 Stunden 15 aufrechtzuerhalten. In allen Fällen sollten aggressive Manöver des Eies Kammer vermieden werden, da sie die Eizellen betont und reduziert seine Lebensfähigkeit. Imaging weniger Ei Kammern und darauf achten, dass jeder vorsichtig zu behandeln ist der beste Weg, um eine optimale Rentabilität zu gewährleisten.Wir haben nichts zu offenbaren.
Diese Arbeit wurde durch eine Wellcome Trust Senior Research Fellowship an I. Davis unterstützt.
Werkzeuge in Dissektion verwendet sollte sauber sein, aber müssen nicht autoklaviert werden. Wischen Sie Werkzeuge mit EtOH und es ihnen ermöglichen, vor Beginn trocknen.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare |
Feine Spitzen Pinsel (Künstler Sable, rund, Größe 00 oder 0) | Von den meisten Verkaufsstellen Malutensilien | Eine gute Qualität ist wichtig, Pinsel | |
Halocarbon Products Corporation, Baureihe 95 | Halocarbon Products Corporation, 887 Kinderkamack Road, River Edge NJ 07661 | Europäische Händler: Solvadis (GMBH) Achten Sie darauf, Oxygenat durch Einblasen von Luft durch das Öl. | |
Deckglas-Nr. 1.5, 22 x 50mm | International-No1-VWR Cat = 631-0137-22-50mm | Menzel-Glaser-22-40mm-MNJ 400-070T | |
Dumont No.5 - Dumostar | Fine Science Tools | 11253-20 | "Biologie" Spitze ist auch gut, aber zerbrechlicher |
Dissecting Sonde | Fine Science Tools | 10140-01 | |
Seziermikroskop | Olymp | SZ61 | |
CO2-Pad | Erhältlich über http://www.flystuff.com / (Ein Geschäftsbereich der Genesee Scientific) | 59-114 (789060 Dutscher) | Europäische Händler: Dutscher www. dutscherscientific. com / Es ist auch relativ einfach benutzerdefinierte bauen eine eigene Fliege Pads |
Kimcare | Kimbery Clark-Kimcare-Medizinische Reinigungstücher | KLEW3020 | |
Mikroskop-DeltaVision | Applied Precision | DC-CORE | |
Mikromanipulator | Burleigh Mikromanipulatoren von Lumen Dynamics Group Inc. 2260 Argentia Road, Mississauga, Ontario, Kanada L5N 6H7 | Burleigh PCS-5000-Serie, TS-5000 bis 300 | http://www.ldgi-burleigh.com / (Formerly Exfo) |
Injektionsvorrichtung | Tritech Research, Inc. 2961 Veteran Ave Los Angeles, CA 90064 | MINJ-1 | Geändert mit einer Halterung zu nehmen Eppendorf Femptotips |
Injektionsnadel | Eppendorf Sterile Femtotips I und II | 930000043 | Verschiedene Tipps sind besser für unterschiedliche Anwendungen |
Tipps zum Einlegen von 20 &mgr; l | Eppendorf | 5242956.003 | |
Trockene aktive Hefe | Fleischmann Yeast | # 2192 |
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