Segmentierung und Messung von FAT-Volumes in Murine Obesity Modellen mithilfe von Röntgen-Computertomographie

Zusammenfassung

Fat-Content-Analyse wird routinemäßig bei Untersuchungen unter Verwendung der Maus Fettleibigkeit Modelle durchgeführt. Aufstrebende Methoden in der Kleintier-CT-Bildgebung und Analyse sind für Längs-Detail reichen Fettgehalt Analyse bietet. Hier haben wir ausführlich Schritt für Schritt Verfahren zur Durchführung von Kleintier-CT-Bildgebung, Analyse und Visualisierung.

Zusammenfassung

Adipositas ist mit einer erhöhten Morbidität und Mortalität sowie reduzierte Metriken in der Lebensqualität verbunden. ¹ Beide Umweltfaktoren und genetischen Faktoren mit Adipositas assoziiert sind, obwohl die genauen Mechanismen, die zur Krankheit beitragen derzeit abgegrenzt werden. ^2,3 Mehrere kleine Tier Modelle von Fettleibigkeit entwickelt worden und werden in einer Vielzahl von Studien beschäftigt. ⁴ Eine kritische Komponente bei diesen Experimenten gehört das Sammeln von regionalen und / oder insgesamt tierischem Fett Daten unter unterschiedlichsten Bedingungen.

Traditionelle experimentelle Methoden zur Messung zur Verfügung Fettgehalt in kleinen Tiermodellen der Adipositas gehören invasive (zB Ex-vivo-Messung von Fettdepots) und nicht-invasive (zB Dual Energy X-ray Absorptiometrie (DEXA) oder Magnetresonanz (MR)) Protokolle, von denen jeder präsentiert relativen Trade-offs. Aktuelle invasive Methoden zur Messung der Fettgehalt kann nähere Angabenfür Orgel und Region spezifische Fettverteilung, aber dabei die Themen werden ausgeschlossen Längs-Assessments. Umgekehrt bieten die gegenwärtigen nicht-invasive Strategien begrenzte Details für Orgel und Region spezifische Fettverteilung, sondern ermöglichen wertvolle Längs-Beurteilung. Mit dem Aufkommen von dedizierten Kleintier Röntgen-Computertomographie (CT) und individuelle analytische Verfahren, sowohl die Organ-spezifische Region und Analyse von Fett Verteilung und Längsprofilierung möglich sein. Jüngste Berichte haben den Einsatz von CT für In-vivo-Bildgebung Längs der Adipositas in lebenden Mäusen validiert. ^5,6 Hier haben wir eine modifizierte Methode, die für Fett / Gesamtvolumen Messung, Analyse und Visualisierung unter Verwendung der Carestream Molecular Imaging Albira CT-System ermöglicht in Verbindung liefern mit PMOD und Volview Software-Pakete.

Protokoll

1. Tiere

1. Für die nachstehend berichteten Ergebnisse wurden drei C57BL/6J-Mäuse und vier B6.V-Lep ^ob / J-Mäuse von den Jackson Laboratories (Bar Harbor, Main, USA) erhalten. B6.V-Lep ^ob / J-Mäusen repräsentieren eines der frühesten Modelle von Fettleibigkeit und bleiben aktiv erforscht. B6.V-Lep ^ob / J-Mäuse zeigen einen Phänotyp, der durch erhöhte Adipozyten Größe und Zahl gekennzeichnet und wiegen bis dreimal mehr als Wildtyp-Mäusen. ^7,8 Hier B6.V-Lep ^ob / J-Mäuse wurden als positive beschäftigt Steuerung für einen adipösen Phänotyp, um die Machbarkeit des Albira CT-System für die CT-basierte Fettgehalt Messungen verdeutlichen.
2. Imaging wurde durchgeführt, wenn die Tiere erreicht etwa 12 Wochen alt. (Fettleibigkeit in B6.V-Lep ^ob / J-Mäusen manifestiert sich nach 4 Wochen alt).
3. Die Mäuse wurden betäubt durch Isofluran (2,5% Durchfluss) und regelmäßig bei 2,5% über einen Nasenkonus Setup für die Bildgebung. Einimals wurden in Bauchlage in der Standard-Rattenfutter Bett (M2M Imaging Inc. Cleveland, OH) in zugeführt mit der Albira Bildstation. Glieder waren positioniert seitlichen vom Rumpf für eine einheitliche CT-Akquisition.
4. Nach der Bildaufnahme abgeschlossen war, wurden Mäuse aus der Bugspitze entfernt und kehrte nach einer Erholung Käfig bis zum Chorumgang.

2. Bild-Akquisition und Rekonstruktion

1. Bild Akquisitionen werden unter Verwendung des Albira CT-System (Carestream Molekulare Bildgebung, Woodbridge, CT). Die Mäuse wurden betäubt durch Isofluran (2,5% Durchfluss) und regelmäßig bei 2,5% über einen Nasenkonus Setup für die Bildgebung. Akquisitionen wurden durchgeführt, um ein Bett von 115 mm Länge zu scannen, mit über 600 Vorsprünge. Die Röntgenquelle wurde bei einem Strom von 200 uA und Spannung von 45 kV eingestellt und verwendet einen 0,5 mm Al-Filter zum Härten der Strahl.
2. Ungefähre Strahlung tief Äquivalentdosis für CT-Einstellungen betrug 220 mSv, und seichte Äquivalentdosis war 357,4 mSv. DieseDosen sind mehr als 20-fach niedriger als LD50-Werte berichtet. ⁹
3. Die Bilder werden rekonstruiert mit der FBP (Filtered Back Projection)-Algorithmus über die Albira Suite 5.0 Reconstructor mit "Standard"-Parameter. Diese kombinierten Aufnahme und Rekonstruktion Einstellungen erzeugen eine endgültige Bild mit 125 um isotrope Voxel, als ausreichend für die ganze Tier-Analyse. Für detaillierte Region spezifische Analyse kann ein Wiederaufbau mit 35 um isotrope Voxel für eine endgültige Auflösung von 90 um ausgewählt werden.

3. Bildanalyse

Die Bildanalyse erfolgt mit dem PMOD (PMOD Technologies Ltd, Zürich, Schweiz) Analyse-Software. Bilder sind in PMOD segmentiert nach Gewebedichte-Premiere für Gesamtvolumen und dann für FAT-Datenträger.

3,1 Bilder können für die Analyse reduziert werden, um Rechenaufwand zu minimieren.

1. Zu reduzieren, zu der Haupt-Registerkarte Ansicht navigieren.
2. Wählen Sie Extras> reduzieren.
3. Wählen von X 2, Y mit 2 und Z von 2.
4. Überprüfen Sie Ersetzen.
5. Wählen Sie Ausführen.

Die Meldung: "Der Begrenzungsrahmen wird sich ändern" angezeigt, sobald die Reduktion abgeschlossen ist.

3,2 Bilder können maskiert ins Bett und Nasenkonus Elemente für die spätere Band-of-Interest (VOI) Analyse zu beseitigen.

1. Um zu verschleiern, um Flugzeuge zu navigieren, Layouts, Drehungen, Spiegel, 3D-Marker> Flugzeuge & Layouts.
2. Wählen Sie Show Ebene Z.
3. Blättern Sie zu der Bugspitze in der Z-Ebene.
4. Wählen Sie die Registerkarte Haupt VOI> Zeichnen Ecken.
5. Zeichnen Sie eine Region of Interest (ROI) rund um die Tier-Nase ohne das Bett und Bugspitze.
6. WählenKopieren tatsächliche ROI.
7. Gehen Sie zum nächsten Stück, und fügen Sie ROI von Puffer durch die einschlägigen Ebenen der Nase.
8. Verwenden Sie auf Gruppe bearbeiten von Ecken auf die ROIs nach Bedarf anzupassen.
9. Wählen Sie Löschen ROI bei den ersten Flugzeuge über die Bugspitze.
10. Erzeugen eines neuen VOI, um das Tier Umfang (mit Ausnahme der Tierbettes) an den ersten Ebenen über die Schäfte umfassen.
11. Navigieren Sie zu VOI-Tools> Maskierung & Algebra.
12. Geben -1000 in der Dialogbox zur Verfügung gestellt.
13. Wählen Sie die Maske Voxel außerhalb des ausgewählten VOIs Taste.

Die Meldung: ". Irreversible Daten Betrieb Wollen Sie fortfahren?" Displays.

14. Wählen Sie Ja.
15. Navigieren Sie zu den Ebenen, Layouts, Drehungen, Spiegel, 3D-Marker> Flugzeuge & Layouts.
16. Wählen Sie Alle Ebenen.
17. Untersuchen Sie das VOI für Integrität.
18. Wählen Sie Speichern.
19. Speichern unter Analysieren.
20. Ändern Sie den Dateinamen-Präfix.

3,3 Erstens Segment das Bild für die gesamte Tier-Volumen:

1. Wählen Sie Extras> Externe.
2. Wählen Sie das Kontrollkästchen Segmentierung.
3. Geben Sie einen Bereich von -300 bis 3500 (Dichtebereich Referenz von Bauchfett-Region Dichtebereich abgeleitet).
4. Wählen Sie Run Segmentierung.
5. Überprüfen Sie die Integrität der Segmentierung.
6. Wählen Sie OK.
7. Wählen Sie Entfernen ROI.
8. Wählen VOI Statistiken.

Berichtet Statistiken repräsentieren das Gesamtvolumen.

9. Notieren Sie die Lautstärke gemeldet.

3,4 nächstes Segment das Bild für FAT-Datenträger:

1. Zurück zu den nicht-segmentierten maskierte Bild für Fett-Volume-Segmentierung.
2. Um die gespeicherte maskierten Daten-Datei zu laden, aktivieren Sie das Analysieren Box in der Load-Fenster).
3. Wählen Sie Extras> Externe.
4. Wählen Sie das Kontrollkästchen Segmentierung.
5. Geben Sie einen Bereich von -200 bis -50.
6. Wählen Sie Run Segmentierung.
7. Überprüfen Sie die Integrität der Segmentierung.
8. Wählen Sie OK.
9. Wählen VOI Statistiken.

Die ausgewiesenen Statistiken stellen die FAT-Datenträger.

10. Notieren Sie die Lautstärke gemeldet.
11. Wählen Sie Speichern.
12. Speichern unter Analysieren.
13. Ändern Sie den Dateinamen-Präfix.

Optional: Wenn Haut / Peripherie-Dichte bleibt, die "Erosion und Dilatation" Protokoll unten durchgeführt werden, um diese Regionen für VOI-Analyse zu beseitigen.

1. Wählen Sie Extras> Externe.
2. Wählen Sie das Morphologische Kontrollkästchen. Die morphologischen Ansicht wird angezeigt.
3. Wählen Sie Erosion.
4. Wählen Sie OK.
5. Wählen Sie Extras> Externe.
6. Wählen Sie das Morphologische Kontrollkästchen. Die morphologischen Ansicht wird angezeigt.
7. Wählen Dilatation.
8. Wählen Sie OK.

4. Visualisierung von CT-Bildern

4,1 VolView v3.2 (Kitware, Clifton Park, NY, USA) wurde verwendet, um gerenderten 3D-Visualisierungen von segmentierten Bilder zu erstellen.

1. Öffnen Sie die CT-Daten in Analyze-Format eingestellt.
2. Verwenden Sie die Standardeinstellungen im Popup-Fenster.
3. Öffnen Sie das Menü Plug-Ins.
4. Unter Dienstprogramm, wählen Sie Zusammenführen Bände.
5. Deaktivieren Sie Rescale Komponenten.
6. Klicken Sie auf Zuweisen zweiten Eingang.
7. Wählen der segmentierten Daten Fett für den zweiten Eingang.
8. Verwenden Sie die Standardeinstellungen im Popup-Fenster.
9. Klicken Sie auf Übernehmen Plug-in.
10. Doppelklicken Sie auf Volume Sichtfenster für eine vergrößerte Darstellung des Themas Maus.

4,2 Zurück zur Farbe / Opazität Registerkarte. Die Komponente im Dropdown-Feld bezieht sich auf welchen Datensatz wird derzeit bearbeitet wird. Zwei Regler sind am unteren Rand der Registerkarte befindet und bestimmen die relative Helligkeit jedes Bauteil Daten innerhalb der Überlagerung festzulegen, mit Werten von 0 bis 1. Für die Komponente 1, the CT, bevorzugen wir die Verwendung eines Graustufen Farbschema. Um die Farbe zu ändern:

1. In der Scalar Color Mapping Abschnitt, auf einer der Farbregler doppelklicken Sie darauf.
2. Um einen Schieberegler zu entfernen, ziehen Sie sie aus der Box.
3. Um einen neuen Schieberegler hinzuzufügen, klicken Sie irgendwo innerhalb des Slider-Bereich.
4. Entfernen Sie einen der Schieberegler.
5. Machen Sie den linken Farbregler schwarz (skalaren Wert (S) = -19000).
6. Machen richtige Farbe weiß Schieber ((S) = 15.000).
7. Von der Scalar Opacity Mapping-Rechner, erstellen Sie einen neuen Punkt, indem Sie innerhalb der Box. Dies gibt insgesamt drei Punkte im Fenster.
8. Für den mittleren Punkt ändern (S) auf ~ -3000, und die Opazität (O)-Wert auf 0 gesetzt.
9. Wählen Sie den dritten Punkt an der rechten Seite des Fensters.
10. Anderer (S) bis etwa 32000, und O bis 0,25.
11. Der erste Punkt kann irgendwo auf der linken Seite, nur solange der Wert für die Deckkraft auf 0 gesetzt ist.
12. Wechseln Sie in zwei Komponenten, die das Aussehen des Fettes bearbeiten sollte.
13. Ändern Sie jede der RGB-Schieber in rot mit einem Doppelklick und Verschieben der Farbton (H)-Regler nach links, um Falschfarben-Karte das Fett auf rot. Sehr wenig sonst sollte nötig, um das Aussehen des Fettes zu justieren.

4,3 Um eine Drei-Panel Drehung Film die Anzeige der CT-, Fett-und Overlay zu erstellen:

1. Klicken und Ziehen der Maus das Thema in eine aufrechte Position mit dem Rücken zu Ihnen zeigt.
2. Unter Component Gewichte, setzen Sie den Wert der Komponente zwei bis 0 bis nur die CT-Scan angezeigt.
3. Klicken Sie auf Bewertung> Kamera.
4. Wählen Sie eine Zahl von Frames for die Rotation Film (für den vorliegenden Fall haben wir uns für "36").
5. Ändern Sie den Wert X Drehung um 360 Grad.
6. Wählen Sie Erstellen.
7. In dem Popup-Dialogfeld erstellen Sie einen neuen Ordner mit dem Namen CT, und speichern Sie die Datei im TIFF-Format, das wird eine Reihe von Rotation Bilder auszugeben.
8. Wiederholen Sie diesen Schritt für die Fett-Bild als auch für die überlagerte Fett / CT-Bild und speichert sie in einzelne Ordner jeder Zeit.

4,4 V 1.43u ImageJ wurde verwendet, um eine Rotation Filmdatei, welche die Ausgabe VolView Bilder zu erzeugen.

1. In ImageJ, wählen Sie Datei> Importieren> Image Sequence.
2. Wählen Sie das erste Bild in der CT-Ordner. Die Software erkennt automatisch die anderen Dateien und öffnen Sie sie als Stapel.
3. Wiederholen Sie die Fett-und Overlay-Sequenzen zu öffnen.
4. Öffnen Sie die ROI-Manager unter Analysieren> Tools> ROIManager.
5. Zeichnen Sie ein ROI rund um das Thema Maus, ohne unnötige Hintergrund-Pixeln.
6. In der ROI-Manager, klicken Sie auf Hinzufügen, um den ROI hinzuzufügen.
7. Wählen Sie eine andere Bildfolge.
8. In der ROI-Manager, klicken Sie auf den ROI, um es auf das Bild anzuwenden. Auf diese Weise wird jeder der beschnitten Stacks perfekt zusammenpassen.
9. Wenn der ROI über alle Stacks ist, innerhalb der ROI der rechten Maustaste auf.
10. Wählen Sie Duplizieren.
11. Bitte markieren Sie die doppelten Stack-Box, um den ROI aus dem Rest des Bildes zu trennen.
12. Schließen Sie das größere Bild-Stacks.
13. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle drei Bildsequenzen.
14. Zum Bild> Stacks> Tools> kombinieren, um die Stapel miteinander zu kombinieren.
15. Wählen Sie für CT-Stack ein.
16. Wählen Sie für Stack 2 Fat.
> Wiederholen und wählen Kombiniert Stacks für Stack 1 und Overlay für Stack 2.
17. Es gibt jetzt eine Drei-Panel-, Bild-Drehung Stapel mit Vorschau-Funktion, indem Sie Play in der unteren linken Ecke des Bildes angezeigt.
18. Um den Film als AVI speichern, wählen Sie Datei> Speichern unter ...> AVI ...
19. Klicken Sie auf Speichern.

5. Repräsentative Ergebnisse

Ergebnisse für drei WT (C57BL/6J) und vier Mäuse fettleibig (B6.V-Lep ^ob / J) Mäuse werden hier als repräsentatives Beispiel von Fett / Gesamt-Volumen-Verhältnis Messungen unter Verwendung der Albira CT-System gemeldet. Abbildung 1 unten bietet einen repräsentativen mit VolView v3.2 für die Segmentierung (dh Gesamtvolumen Fett und Volumen) von fettleibigen Mäusen CT-Bilder erstellt anzuzeigen.

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Abbildung 1. Vertreter CT-Bilder segmentiert für Fett. (A) der adipösen Maus (B6.V-Lep ^ob / J) CT Gesamtvolumen in Graustufen, (B) FAT-Datenträger in rot, und (C) Bildfusion. (D) WT Maus (C57BL/6J) CT Gesamtvolumen in Graustufen, (E) FAT-Datenträger in rot, und (F) Bildfusion.

Insgesamt Bände, FAT-Volumes, und berechnet Fett / Gesamtvolumen Verhältnisse sind nachfolgend in Tabelle 1 für jeden WT-Maus und jedem adipösen Maus berichtet. Der gemittelte Fett / Gesamt-Volumen-Verhältnis für den WT-Gruppe und der adipösen Gruppe betrug 0,09 und 0,42 (Abbildung 2). Die Fett / Gesamtvolumen Verhältnisse für die WT-Mäuse im Vergleich zu den fettleibigen Mäusen wurde festgestellt, dass signifikante Differenz (p = 0,001).

WT (C57BL/6J)	Gesamt (cm 3)	Fat (cm 3)	Fat / Gesamtübersetzung	Adipöse (B6.V Lep-OB /)	Gesamt (cm 3)	Fat (cm 3)	Fat / Gesamtübersetzung
Tier 1	28,79	3,00	0,10	Tier 1	66,25	26,75	0,40
Animal 2	33,25	3,05	0,09	Animal 2	61,15	26,31	0,43
Tier 3	30,30	2,63	0,09	Tier 3	64,19	25,7	0,40
				Tier 4	54,25	23,78	0,44

Tabelle 1. Das Gesamtvolumen, Fett-Volumen,und Fett / Gesamt-Volumen-Verhältnisse für WT und fettleibigen Mäusen. Total und dicke Bände wurden von segmentierten Bildern mit PMOD VOI-Analyse abgeleitet.

Abbildung 2. Gemittelt Fett / Gesamtvolumen Verhältnisse für WT-Mäuse im Vergleich zu fettleibigen Mäusen. Gemittelt Fett / Gesamtvolumen Verhältnisse für WT (C57BL/6J) und adipös (B6.V-Lep ^ob / J) festgestellt, dass 0,09 und 0,42 bzw. angezeigt werden. (Fehlerbalken = einfache Standardabweichung). WT gegenüber adipösen Fett / Gesamt-Volumen-Verhältnisse erwiesen sich signifikant (p-Wert = 0,001).

Diskussion

Hier, unter Verwendung B6.V-Lep ^ob / J-Mäusen haben wir die Machbarkeit der Durchführung Fettgehalt Messungen in einem kleinen Tiermodell mit der Albira CT-System dargestellt. Diese Messungen stimmen mit den Erwartungen für Vergleiche von konzerninternen und Inter-Gruppen-Messungen. Erstens, vorausgesetzt, repräsentative Ergebnisse hier hervorheben begrenzte konzerninternen Variabilität bei der Messung von Fett / Gesamt-Volumen-Verhältnisse in beiden WT und fettleibigen Mäusen Gruppen mit diesen Verfahren. Zweitens unterscheidet sich Fett / Gesamt-Volumen-Verhältnisse für WT gegenüber fettleibigen Mäusen signifikant. Schließlich auf Vergleichen beruhen (nicht abgebildet) mit früheren Werten für die relative insgesamt Fettmasse und Prozent Körperfett im Vergleich zum WT-B6.V Lep ^ob / J-Mäusen berichtet, unseren Messungen für Fett / Gesamt-Volumen-Verhältnisse für WT gegenüber B6.V- Lep ^ob / J-Mäuse fallen in einem erwarteten ^{Bereich, 7, 8.}

Die Methoden detailliert hier könnte angewendet oder an andere m angepasst werdenODELLE und / oder Studienziele. Änderungen in den Wiederaufbau Parameter erforderlich sein, um bestimmte Ziele zu erreichen. Zum Beispiel, Judex et al. (2010) berichtet, dass 50 um aufgelöste Bilder für einige Regionen spezifische Analyse erforderlich waren. Eine isotrope cm Volumen eines Bildes kann für 35 um Rekonstruktionen im Albira 5,0 Reconstructor Suite mit dem "HR" Rekonstruktion Option ausgewählt werden. Sobald die Albira CT-System ist für die Region und organspezifische Fettgehalt Messungen verwendet der volle Nutzen (dh simultane Region und organspezifische Fettvolumen Messungen und Längenmaße) des CT-basierte Fettgehalt Analyse kann Albira CT-System realisiert werden.

Schlussfolgerungen:

Hier bieten wir Ihnen eine detaillierte Schritt für Schritt Methode zur Messung des Fettgehaltes in lebenden Mäusen mittels Röntgen-CT-Bildgebung. Wir erwarben unsere CT-Datensätze mit Hilfe eines Albira Bild-Station, und nachfolgende Segmentierung durchgeführt und anaLyse mit dem PMOD Software-Suite. Schließlich geben wir Anweisungen, um einfache Rendering und Visualisierung des Fettgewebes Verteilung innerhalb des ganzen Tieres zu ermöglichen.