Vorbereitung der Myeloide Suppressorzellen (MDSC) von Naive und Pankreas-Tumor-tragenden Mäusen mittels Durchflusszytometrie und Automated Magnetic Activated Cell Sorting (autoMACS)

Zusammenfassung

Dies ist eine schnelle und umfassende Methode der Immunphänotypisierung Myeloide Suppressorzellen (MDSC) und bereichernde Gr-1 ⁺ Leukozyten aus Maus-Milz. Diese Methode verwendet Durchflusszytometrie und autoMACS Zellsortier für tragfähige Gr-1 bereichern ⁺ Leukozyten vor der FACS-Sortierung MDSC zur Verwendung In-vivo- Und In-vitro- Assays.

Zusammenfassung

MDSC sind eine heterogene Population von unreifen Makrophagen, dendritischen Zellen und Granulozyten, die in lymphatischen Organen bei pathologischen Zuständen einschließlich parasitäre Infektionen, Entzündungen, traumatischen Stress, Graft-versus-host-Krankheit, Diabetes und Krebs ^7.1 ansammeln. Bei Mäusen, MDSC ausdrückliche Mac-1 (CD11b) und Gr-1 (Ly6G und Ly6C) Oberflächenantigene ^7. Es ist wichtig zu beachten, dass MDSC auch in verschiedenen Tumor-tragenden Hosts, wo sie deutlich erweitert werden untersucht und zu unterdrücken Anti-Tumor-Immunantwort gegenüber naiven Kollegen ^7-10. In Abhängigkeit von den pathologischen Zustand, gibt es verschiedene Subpopulationen von MDSC mit unterschiedlichen Mechanismen und Ziele der Unterdrückung ^11,12. Daher sind wirksame Mittel zur lebensfähigen MDSC Populationen zu isolieren, die Aufklärung ihrer verschiedenen molekularen Mechanismen der Unterdrückung in vitro und in vivo.

Vor kurzem hat die Ghansah Gruppe hat den Ausbau MDSC in einem murinen Pankreaskarzinom-Modell berichtet. Unsere tumortragenden MDSC zeigen ein Verlust der Homöostase und erhöht suppressive Funktion im Vergleich zu naiven MDSC ^13. MDSC Prozentangaben sind deutlich weniger in lymphoiden Kompartimente von naiven vs Tumor-tragenden Mäusen. Dies ist eine große Einschränkung, die oft behindert genaue vergleichende Untersuchungen dieser MDSC. Deshalb bereichern Gr-1 ⁺ Leukozyten aus naiven Mäusen vor Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) erhöht Reinheit, Viabilität und reduziert Art Zeit. Allerdings ist die Anreicherung von Gr-1 ⁺ Leukozyten aus tumortragenden Mäusen optional, da diese in Hülle und Fülle für die schnelle FACS-Sortierung sind. Daher wird in diesem Protokoll beschreiben wir eine hocheffiziente Methode der Immunphänotypisierung MDSC und bereichernde Gr-1 ⁺ Leukozyten aus Milzen von naiven Mäusen für die Sortierung MDSC in einer fristgerechten Weise. Immunkompetenten C57BL / 6 Mäusen mit murinem Panc02 ce inokuliertlls subkutan während naive Mäuse erhalten 1XPBS. Etwa 30 Tage nach der Inokulation, Milzen entnommen und in den Single-Zellsuspensionen mit einem Zellabtrennungssiebes verarbeitet. Milzzellen werden dann Rote Blutkörperchen (RBC) lysiert und ein Aliquot dieser Leukozyten angefärbt mit Fluorochrom-konjugierten Antikörper gegen Mac-1 und Gr-1 zu Immunphänotyp MDSC Prozentsätze mittels Durchflusszytometrie. In einem parallelen Experiment, werden ganze Leukozyten aus naiven Mäusen mit fluoreszierenden konjugierten Gr-1-Antikörper, mit PE-Microbeads inkubiert und positiv selektiert mit Hilfe eines automatisierten Magnetic Activated Cell Sorting (autoMACS) Pro Separator gefärbt. Als nächstes wird ein Aliquot der Gr-1 ⁺ Leukozyten mit Mac-1-Antikörper gefärbt, um die Erhöhung der MDSC Prozentwert mit Durchflusszytometrie zu identifizieren. Nun sind diese Gr1 ⁺ angereicherten Leukozyten bereit für FACS-Sortierung von MDSC in vergleichenden Analysen verwendet werden (naiv vs tumortragenden) in in vivo und in vitro

Protokoll

Vor dem Start, bereiten Sie die folgenden Lösungen:

3% Färbung Media (SM):

-3% Fötalem Rinderserum (FBS) in 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)

MACS-Puffer (MB):

- 0,5% Albumin aus Rinderserum (BSA) in 1XPBS

1. Ernte Milz von Mäusen

1. Subkutan injizieren 6-8 Wochen im Alter von C57BL / 6 Mäuse (Harlan) mit 1,5 x 10 ⁵ Panc02 murinen Zellen in 100 ul 1x PBS suspendiert (tumortragenden; TB). Kontrollmäusen (Naive) erhalten 100 ul 1XPBS.
2. Etwa 4 Wochen nach der Injektion, einschläfern Mäusen durch Kohlendioxid erstickend wirken.
3. Ernte Milz von Mäusen durch stumpfe Dissektion mit einer Pinzette und Schere dann wiegen mit einer Waage. Ort Milz in separaten, etikettiert 50 ml konischen Röhrchen mit 1 x PBS.

2. Generieren Sie ein Einzel-Zell-Federgabeln von Leukozyten aus Milz

Alle Verfahren sollten in einer sterilen Umgebung unter einem Biologische Sicherheit Hood und Zellen und Antikörper auf Eis gehalten durchgeführt werden.

1. Montieren Zellabtrennungssiebes durch Einsetzen des Mesh-Sieb in die Öffnung des Bechers nach unten. Dann legen Sie den Sicherungsring in das Gewinde mit der geschlitzten Seite nach oben und mit dem Ring-Taste, um den Haltering ziehen und hält so den Bildschirm an Ort und Stelle. Setzen Sie den montierten Sieb in eine Petrischale mit 10 ml 1 x PBS.
2. Pool Milz und Formate Glas Pistill zu Milz gegen die Mesh-Sieb des Zellabtrennungssiebes und in die Petrischale zu schleifen. Wiederholen für jede Behandlung von Mäusen.
3. Filter Zellsuspension in einem 50 ml konischen Röhrchen mit einer 70 um Zellsieb und eine 5 ml serologische Pipette. Zentrifuge bei 12.000 rpm (250-300 xg) für 5 min.
4. Überstand abnehmen und Pellet in 5 ml 1 x RBC Lysispuffer pro Milz. Jeweils oben und unten kräftig. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. Die Reaktion durch Zugabe von 20 ml 1 x PBS. Jeweils oben und unten kräftig. Zentrifuge bei 12.000 rpm (250-300 xg) für 5 min.
5. Überstand abnehmen und Pellet in 20 ml sterilem 1 x PBS. Jeweils oben und unten kräftig.
6. Zählen von Zellen unter Verwendung von Trypanblau und eines Hämozytometers und resuspendieren in gewünschten Konzentration in 3%, so dass SM 50 ul entspricht 5x10 ^{5-1x10 6} Zellen (1x10 ⁷ Zellen / ml - 2x10 ⁷ Zellen / ml).

3. Zelloberflächen-Bemalen / Immunphänotypisierung von MDSC mittels Durchflusszytometrie

1. Beschriften Sie die Vertiefungen einer 96-Well-V Bodenplatte für die Steuerung und experimentellen Proben und einzelne Flecken auf Ersatz Kontrollen (keine Flecken, NS, Mac-1-FITC; Gr-1-APC und DAPI).
2. In 5x10 ^{5-1x10 6} Zellen in Höhe von 50 ul / Vertiefung von Splenozyten ihren jeweiligen Vertiefungen in der 96-Well-V-Bodenplatte. ZentrifugierenPlatte bei 12.000 rpm (250-300 × g) für 5 min.
3. Bereiten Sie "Master Mix" (MM) der Maus BD FC-Baustein (Ratte anti-Maus-CD16/32 monoklonaler Antikörper) in 3% SM verdünnt, in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Als Ausgangspunkt verwenden 1 pg FC-Baustein in 3% SM für ein Endvolumen von 50 ul, pro Vertiefung.
4. Entfernen Sie vorsichtig Überstand aus jeder Vertiefung der 96-Loch-V-Bodenplatte durch schnelles Umdrehen der Platte über und zurück, über einen Abfallbehälter oder ein Waschbecken ohne Störung der Zell-Pellets.
5. Vortex, kurz zentrifugieren FC-Baustein MM für 5 Sekunden und 50 ul zu allen Pellets im 96-Well-V-Bodenplatte. Gut mischen durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren, so dass Proben in ihre Brunnen. Inkubieren Platte für 15 min im Dunkeln auf Eis. Zentrifugenplatte bei 12.000 rpm (250-300 xg) für 5 min.
6. Bereiten Sie "Master Mix" (MM) von Fluorochrom-konjugierte Antikörper in 3% SM in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis verdünnt, während Proben mit FC-Baustein inkubieren. Antikörper sollten titriert werdenum optimale Verdünnung für Färbeverfahren zu bestimmen. Als Ausgangspunkt, kombinieren eine Verdünnung von 1.25 Mac-1-FITC und 1:20 Verdünnung von Gr-1-APC in 3% SM für ein Endvolumen von 50 ul, pro Probe gut.
7. Vorsichtig Überstand zu entfernen aus jeder Vertiefung der 96-Well-V-Boden, wie zuvor beschrieben.
8. Vortex, kurz zentrifugieren MM von fluoreszierenden-konjugierte Antikörper-Färbung für 5 Sekunden und 50 ul, die Kontrolle und experimentelle Pellets. Gut mischen durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren. Für Single-Fleck Kompensationen, fügen Sie eine Verdünnung von 1.25 Mac-1-FITC, 1:20 Verdünnung von Gr-1-APC und 75 ng / ml DAPI, in 3% SM für ein Endvolumen von 50 ul pro Well an ihre jeweiligen Brunnen. Dann werden 50 ul 3% auf gut SM ungefärbt (keine Flecken). Gut mischen und inkubieren Zellen in 96-Well-V-Bodenplatte für 30 min im Dunkeln auf Eis.
9. Label-FACS-Röhrchen (5 ml, 12 mm x 75 mm Polystyrol Rundbodengefäße) zu jeder Vertiefung in der 96-Well-V-Bodenplatte entsprechen. Geben Sie 200 ul 3% SM zu jedem FACSRohr.
10. Zentrifugenplatte bei 12.000 rpm (250-300 xg) für 5 min und Überstände entfernen. Waschen Sie Pellets durch Zugabe von 100 ul 3% SM zu jedem Pellet und mischen Sie gut durch leichtes Auf-und Abpipettieren. Zentrifugenplatte bei 12.000 rpm (250-300 xg) für 5 min. Wiederholen Sie Schritt noch einmal zu waschen.
11. Vorsichtig Überstand zu entfernen aus jeder Vertiefung der 96-Well-V-Boden, wie zuvor beschrieben. Resuspendieren jedes Pellet in 100 ul 3% SM und gut mischen.
12. Übertragen Sie 100 ul resuspendierten Pellets aus jedem Well der 96-Loch-V-Bodenplatte, um ihre jeweils beschriftet FACS-Röhrchen.
13. Vor-Zytometrie-Analyse fließen, fügen 75 ng / ml DAPI zu steuern und zu experimentellen Proben und DAPI einzigen Fleck-Kompensation.
14. Führen Sie die durchflusszytometrische Erfassung von MDSC Prozentsätze. Führen Ausgleich mit dem negativen (keine Flecken Kontrolle) und die einzige positive Kontrollen. Richten Sie eine Dot-Plot, der die nach vorn (FSC) gegen seitliche Streulicht (SSC) in Log-Skala zeigt, so dass Leukozyten-Populationen vonInteresse identifiziert werden kann. Zeichnen Sie ein großes Tor auf allen Leukozyten, ohne Schmutz und Klümpchen mit niedrigsten Vorwärts-und Seitwärts-Streulicht. Von diesem übergeordneten Tor, erstellen Sie einen neuen Dot-Plot, der SSC gegen DAPI und Tor zeigt auf DAPI-(Live-) Zellen. Wählen Sie diese neu gated Bevölkerung und schaffen eine Dot-Plot, der Mac-1 gegen Gr-1 und Tor zeigt auf Ihrem doppelt positiven (Mac-1 ⁺ Gr-1 ⁺⁾ MDSC.

4. Magnetischen Anreicherung von Gr-1 ⁺ Leukozyten

1. Aliquotieren 1x10 ⁷ verbleibenden ungefärbten Leukozyten in entsprechend beschriftete FACS-Röhrchen und zentrifugieren bei 12.000 rpm (250-300 xg) für 5 min.
2. Planen MM von Gr-1-PE-Antikörper in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Für bis zu 10 ⁷ Zellen, verwenden Sie eine 1:10 Verdünnung von Gr-1-PE-Antikörper in 50 l MB, pro Probe. Für größere Zellzahlen, bis Volumina entsprechend zu skalieren. Kurz für 5 Sekunden zentrifugiert, in den Leukozyten in FACS-Röhrchen und Inkubation für 15 min bei 4 ° C im Dunkeln.
3. 2 ml MB auf FACS-Röhrchen, Zentrifuge bei 12.000 rpm (250-300 xg) für 5 min und Überstand verwerfen.
4. Bereiten MM von Anti-PE MicroBeads in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Für bis zu 10 ⁷ Zellen, verwenden Sie ein 1:4-Verdünnung des Anti-PE MicroBeads in 200 ul MB, pro Probe. Für größere Zellzahlen, bis Volumina entsprechend zu skalieren. Kurz für 5 Sekunden zentrifugiert, in den Leukozyten in FACS-Röhrchen und Inkubation für 15 min bei 4 ° C im Dunkeln.
5. 2 ml MB auf FACS-Röhrchen, Zentrifuge bei 12.000 rpm (250-300 xg) für 5 min und Überstand verwerfen. Pellet in 3 ml SB. Anschließend wird durch ein 70 um Sieb in eine neue, markierte 50 ml konischen Röhrchen.
6. Vorbereiten und grundieren Auto MACS Separator Pro. Refill alle Flaschen mit den entsprechenden Lösungen und leeren die Abfallbehälter, falls erforderlich. Gerät einschalten und prüfen Status der Flüssigkeitsbehälter und Spalte (n) nach der Initialisierung. Alle Symbole sollte grün leuchten. Auf dem Menü wählen Sie "Trennung" von der oberenMenüleiste gefolgt von "Jetzt waschen" aus der unteren Menüleiste. Wählen Sie "Spülen" aus dem Pop-up-Option von "Run", um die Grundierung zu starten gefolgt. Sobald die Grundierung Prozess erfolgreich abgeschlossen ist, wird das Instrument zeigt dann, dass es "Ready for Separation" unter dem Status-Menü.
7. Wählen Sie die passende gekühlt Tube-Rack für Rohrdurchmesser und Platz 50 ml konischen Röhrchen mit magnetisch markierte Zellen in Reihe A, 50 ml konischen Röhrchen für die negative Fraktion Sammlung in Zeile B und 15 ml konischen Röhrchen für die positive Fraktion Sammlung in der Reihe C
8. Wählen Sie "POSSEL_S" Zellseparation Programm für die positive Selektion von markierten Zielzellen in sensiblen Modus von Proben. Die magnetisch markierte Zielzellen auf der Säule zurückgehalten Automaten; unmarkierten Zellen in der negativen Fraktion Sammelrohr in der Zeile B. über automatisierte Zurückziehen des Magneten losgelassen wird, die markierten Zielzellen, in die positive Sammelrohr in Reihe C des Rohrs freigegeben Rack.

5. Post-Sort Analyse der Gr-1 ⁺ Enriched Leukozyten

1. Recount Gr-1 ⁺ und Gr-1 ^- Fraktionen unter Verwendung von Trypanblau und eine Hämazytometer. Die Zellen in der gewünschten Konzentration in 3% Färbung Medium, so daß 50 ul entspricht 5x10 ^{5-1x10 6} Zellen (1x10 ⁷ Zellen / ml - 2x10 ⁷ Zellen / ml) zugefügt und 50 ul entsprechend markierten FACS-Röhrchen.
2. Vorbereiten einer MM von Mac-1 nur bei 1:25 Verdünnung in 3% SM auf ein Endvolumen von 50 ul pro Probe. Stain Zellen und bereiten einzigen Fleck Kompensationen von Gr-PE, Mac-1 FITC und DAPI für die Durchflusszytometrie-Analyse. Geben Sie 200 ul 3% SM und DAPI Lebensfähigkeit Farbstoff wie zuvor beschrieben.
3. Führen durchflusszytometrische Datenerfassung bis Gr-1 ⁺ und Gr-1 zu bestimmen ^- und Prozentsätze zu vergleiche auch MDSC Prozentsätze Pre-und Post-autoMACS Bereicherung.

6. Repräsentative Ergebnisse

Hier zeigen wir r epräsentativer Ergebnisse für autoMACS Anreicherung von Gr-1 ⁺ Leukozyten aus gepoolten, naiv Milz für die anschließende FACS-Sortierung von MDSC (Abbildung 1). 1x10 ⁶ naiv Leukozyten wurden mit Mac-1-FITC und Gr-1-APC-Antikörpern gefärbt, um MDSC Prozentsätze mit einem BD LSRII Instrument zu identifizieren, vor autoMACS Sortierung. 1x10 ⁷ naiven Leukozyten wurden dann mit Anti-Gr-1-PE und PE-Antikörper MicroBeads zur Anreicherung von Gr-1 ⁺ Leukozyten unter Verwendung eines autoMACS Pro Separator gefärbt. Post-autoMACS Bereicherung, Gr-1 Prozentsätze in Gr-1 ⁺ und Gr-1 ^- gesammelten Fraktionen wurden mittels Durchflusszytometrie. 1x10 ⁶ Gr-1 ⁺ Leukozyten wurden entfernt und mit Mac-1-FITC-Antikörper zu analysieren und zu vergleichen, MDSC Prozentsätze von angereichertem, vereinigt naiven Leukozyten an nicht-angereicherten, Tumor-tragenden vereinigt Leukozyten mittels Durchflußzytometrie gefärbt.

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Abbildung 1. AutoMACS Anreicherung von Naive Gr-1 ⁺ Leukozyten für MDSC FACS-Sorting. Die Milz wurde von Pankreas-Tumor-tragenden Mäusen und naiv geerntet und verarbeitet in den Single-Zellsuspensionen. Durchflusszytometrie-Analyse von naiven Leukozyten Oberfläche mit Mac-1 und Gr-1 Fluoreszenz-konjugierte Antikörper gefärbt, vor autoMACS Bereicherung (A). Durchflusszytometrie-Analyse von Gr-1 ⁺ (B) und Gr-1 ^- (C) Fraktionen post-autoMACS Anreicherung von Gr-1 ⁺ Zellen aus gepoolten naiv leuckocytes mit Gr-1-PE-Antikörper und anti-PE MicroBeads gefärbt. Durchflusszytometrie-Analyse der MDSC und Gr-1 ⁺ Prozentsätze nach autoMACS Anreicherung von Gr-1 ^+-Zellen aus naiven vereinigt Leukozyten (D) im Vergleich zu nicht-angereicherte vereinigt Leukozyten aus Tumor-tragenden Mäusen (E) (naive Mäuse, n = 5 , Tumor-tragenden Mäusen, n = 3). MDSC und Gr-1 Prozentsätze sind gated in den repräsentativen Konturdiagramme und Histogramme.

Diskussion

Dies ist eine detaillierte Verfahren zum Verarbeiten und immunophentyping MDSC Populationen, die für verschiedenen lymphoiden Geweben von verschiedenen Tiermodellen ist. Insbesondere kann autoMACS Anreicherung für die Isolierung von verschiedenen Leukozytenpopulationen einschließlich Gr-1 Depletion von Splenozyten ^4, Reinigung von myeloiden Teilmengen aus Milzzellen und Lymphknoten ^5, Isolierung von Knochenmark Neutrophilen ¹⁴ und Reinigung von CD8 ⁺ T-Zellen aus der Milz v...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENZ	UNTERNEHMEN	Katalog #	KOMMENTARE
1X Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung	Thermo Scientific Hyclone	SH30028.02	Ca 2 + / Mg 2 + / Phenolrot-freiem
Albumin aus Rinderserum (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906	Lassen Sie ungestört auflösen BSA in PBS; sterilen Umgebung
Fötales Rinderserum (FBS)	Thermo Scientific Hyclone	SV3001403HI	Hitze inaktiviert; sterilen Umgebung
Ratte anti-Maus-CD16/32 monoklonalen Antikörper (Fc-Block)	BD Biosciences	553142	Sterilen Umgebung
Anti-Maus-CD11b (Mac-1) FITC	eBiosciences	11-0112	SterilUmwelt
Anti-Maus Ly6G (Gr-1) APC	eBiosciences	17-5931	Sterilen Umgebung
Anti-Maus Ly6G (Gr-1) PE	eBiosciences	12-5931	Sterilen Umgebung
DAPI	Invitrogen	D1306	Verdünnungsreihe sterilen Umgebung
Zellabtrennungssiebes	Sigma-Aldrich	CD1-1KT	Autoklav vor der Verwendung
Um 70-Sieb	BD Biosciences	352350	Sterilen Umgebung
1X RBC Lysis Buffer	eBiosciences	00-4333-57	Warm auf Raumtemperatur vor Gebrauch; sterilen Umgebung
Petrischalen	Fisher Scientific	08-757-12	Sterilen Umgebung
50ml coniCal-Rohre	Thermo Scientific	339652	Sterilen Umgebung
5ml 12X75mm Polystyrol Röhrchen mit rundem Boden	BD Biosciences	352054	Bekannt als FACS-Röhrchen, sterile Umgebung
96-Well-Platten mit V-Boden	Corning	3897	Sterilen Umgebung
Trypanblau	Cellgro	25-900-CI	Sterilen Umgebung
PE MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-801	Sterilen Umgebung
AutoMACS Pro Separator	Miltenyi Biotec	130-092-545
AutoMACS Spalten	Miltenyi Biotec	130-021-101
AutoMACS Laufpuffer	Miltenyi Biotec	130-091-221