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Diese Methode beschreibt, wie zu isolieren und zu verewigen mikrovaskulären Endothelzellen von der Maus Gehirn. Wir beschreiben ein Schritt-für-Schritt-Protokoll ausgehend von der Homogenisierung von Hirngewebe, Verdauungsschritten, Aussaat und Immortalisierung der Zellen. Normalerweise dauert es etwa fünf Wochen, um eine homogene, verewigt mikrovaskuläre Endothelzellen Zelllinie zu erhalten.
Epithel-und Endothelzellen (EC) bauen parazellulären Barrieren, die das Gewebe aus der externen und internen Umwelt zu schützen. Die Blut-Hirn-Schranke (BHS), bestehend aus EG, Astrozyten end-Füße, Perizyten und die Basalmembran ist verantwortlich für den Schutz und die Homöostase des Hirnparenchym. In vitro BBB Modelle sind gemeinsame Instrumente, um die Struktur und Funktion des BBB studieren auf zellulärer Ebene. Eine beträchtliche Anzahl von verschiedenen in vitro BBB Modelle wurden für Forschung in verschiedenen Labors auf dem neuesten Stand eingerichtet. Normalerweise werden die Zellen von Rindern, Schweinen, Ratte oder Maus Hirngewebe (ausführlich im Aufsatz von Wilhelm et al. 1). Menschlichen Gewebeproben sind nur in einer begrenzten Anzahl von Labors oder Unternehmen 2,3. Während primäre Zellpräparationen zeitaufwendig sind und die EC-Kulturen können von Charge zu Charge unterschiedlich, verewigt die Gründung der EG-lines steht im Mittelpunkt des wissenschaftlichen Interesses.
Hier präsentieren wir eine Methode zur Festlegung einer immortalisierten Gehirn mikrovaskulären EC Linie von neonatalen Maus Gehirn. Wir beschreiben das Verfahren Schritt für Schritt verwalten die Reagenzien und Lösungen verwendet. Die Methode, mit unserem Labor etablierten ermöglicht die Isolierung eines homogenen verewigt Endothelzelllinie innerhalb von vier bis fünf Wochen. Das Gehirn mikrovaskulären endothelialen Zelllinien bezeichnet CEND 4 (aus Großhirnrinde) und cerebEND 5 (aus Kleinhirnrinde), wurden nach diesem Verfahren in der Förster Labor isoliert und sind effektiv zur Erläuterung der verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen an der BHS verwendet. Verwendung CEND und cerebEND haben wir gezeigt, dass diese Zellen zu Glucocorticoid 4,6-9 reagieren und Östrogen-Behandlung 10 sowie pro-infammatory Mediatoren wie TNFalpha 5,8. Darüber hinaus haben wir die Pathologie Multiple sc studiertlerosis 11 und Hypoxie 12,13 auf der EG-Ebene. Die CEND und cerebEND Linien können als ein gutes Werkzeug zur Untersuchung der Struktur und Funktion der BBB, zellulärer Reaktionen von ECs auf verschiedene Reize oder die Interaktion der EG mit Lymphozyten oder Krebszellen in Betracht gezogen werden.
Ein. Isolierung von Hirnkapillaren
Anmerkung: Meninges können als dünne, transparente Membranen an der Oberfläche des Hirngewebes identifiziert werden. Sie können vorsichtig mit sterilen Pinzetten entfernt werden.
2. Immortalisierung der Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen
4. Splitting der CEND-Zellen (Hinweis: Splitting nur einmal pro Woche getan werden sollte, vermeiden Splitting Höher als 1:4).
5. Einfrieren von CEND-Zellen
CEND Wachstumsmedium: 450 ml DMEM, 10% FCS, 10 ml L-Glutamin, 2% MEM-Kit, 2% NEAA, 10 ml Natrium-Pyruvat, 50 U / ml Penicillin / Streptomycin
6. Repräsentative Ergebnisse
Die CEND und cerebEND Zellen wurden durch Immunfärbungen der endothelialen a gekennzeichnetnd BBB Markern sowie durch Messungen der transendotheliale elektrischen Widerstand (TEER) und Durchlässigkeit. Die CEND und cerebEND hatte eine ähnliche Morphologie der primären Kulturen des Gehirns ECs, mit Monoschichten aus dicht gepackten länglichen Zellen, die Wachstumshemmung bei Konfluenz ausgestellt. Die Zellen exprimiert gut nachweisbaren Konzentrationen von Claudin-5, Occludin und VE-Cadherin Proteine, die an den Zell-Zell-Verbindungen lokalisiert wurden, wie durch Immunfluoreszenz (Abbildung 3) 4,5 gezeigt. Kultivieren CEND Zellen in Serum-reduziertem Medium zu einer Erhöhung der TEER (ab 150 Qcm 2 in Gegenwart von 10% Serum und 500 Qcm 2 in Gegenwart von 2% Serum), die durch die Zugabe von Hydrocortison potenziert wurde (800 Qcm führten 2) oder Insulin (1.000 Qcm 2) 4. Monoschichten von CEND in Serum-reduziertem Medium für 21 Tage kultiviert hatten TEER von 900 Qcm 2 (Abbildung 4). TEER wurde gemessen unter Verwendung einer Anordnungenthaltenden Strom-und Spannungs-ziehende Meßelektroden (World Precision Instruments). Zum Vergleich wurde der primäre mikrovaskuläre Gehirn ECs wurde berichtet, TEER-Werte von 200-600 haben Qcm 2 und eine handelsübliche Maus-Zelllinie bEnd.3 hatten TEER-Werte von 100-140 Qcm 2 (für Übersichtsartikel siehe Abt 2005 und Toth et al., 2011 17,18). Darüber hinaus wurde der Durchgang von Makromolekülen, wie nicht geladene FITC-Dextrane Molekularmassen 4, 10, 70 und 500 kDa oder Fluorescein (300 Da) durch die Monoschicht von CEND in 2% FCS Differenzierungsmedium über 4 h verringerte verglichen mit Kontrollzellen in Wachstumsmedium mit 10% FCS gehalten: parazellulären Flussmittel wurde zu 30% der Kontrollzellen für Fluorescein verringert, auf 26% für FITC-Dextran 10 und 70 kDa, und Flussmittel wurde zu 4,5% der Kontroll-Zellen für FITC reduziert -dextrtan 500 kDa. TEER-Werte ähnlich war die Durchlässigkeit auf der untersten Ebene in den Zellen in Gegenwart von gluc kultiviertocorticoids (GC) 4. In weiteren Studien identifizierten wir die Glucocorticoid Zielgene, Occludin, Claudin-5 und VE-Cadherin in Gehirn Gefäßendothel 4,7,9. GC Behandlung führte zu einer Erhöhung der Expression dieser Proteine und auf die Umlagerung von VE-Cadherin mit dem Zytoskelett. Die direkte GC-vermittelten Regulation von Tight junction-Proteine und Claudin Occludin-5 erscheint durch GC Response-Elemente in ihren Promotorregionen 4,7,19. Zusätzlich Claudin-5 wurde als neuartiges Östrogen Ziel im Gefäßendothel 10 identifiziert.
Endotheliale Dysfunktion liegt vielen verschiedenen Krankheiten. Wir kultiviert Die CEND unter Sauerstoff / Glukose Deprivation (OGD) Bedingungen. OGD führte zur Unterbrechung der BBB-Funktion, die nach der kombinierten Behandlung mit GC und Proteasom-Inhibitor Bortezomib 12 rekonstituiert werden konnte. OGD Bedingungen führten zu einem starken Anstieg der Glucose-Aufnahme und in der Expression von Glucose transporsitz in cerebEND, denen durch die Zugabe von MK801, ein nicht-kompetitiver Inhibitor der NMDA-Rezeptor-13 könnte.
Abbildung 1. Morphologie Gehirn mikrovaskuläre Endothelzellen (CEND) eine Woche nach der Isolierung. Lichtmikroskopie Bilder wurden unter dem 6x (A) und 15x (B) Vergrößerung. Die inselartigen gebildeten Kolonien von Endothelzellen sind sichtbar.
Abbildung 2. Morphologie des Gehirns mikrovaskulären Endothelzellen (CEND) 1 Monat nach der Isolierung und Immortalisierung. Lichtmikroskopie Bilder wurden unter 15x Vergrößerung. Ein konfluenten, homogene Endothelzelle Monoschicht beobachtet werden kann.
Abbildung 3. Verewigt Gehirn microvascular endothelialen Zellen exprimieren Claudin-5, Occludin und VE-Cadherin. CEND Zellen wurden auf Kollagen IV-beschichteten Deckgläsern gezüchtet und angefärbt mit Antikörpern gegen Claudin-5 (A), Occludin (B) und VE-Cadherin (C). Die Aufnahmen wurden mit einem Zeiss-Mikroskop Axioscop2 unter 40-facher Vergrößerung.
Abbildung 4. Messung transendotheliale elektrischen Widerstand (TEER) von CEND Monoschicht. CEND wurden auf Kollagen IV-beschichteten Transwell-Filter (Porengröße 0,4 um) gezüchtet. Nach Erreichen der Konfluenz wurden die Zellen in Medium mit 2% FCS gehalten. TEER wurde nach 7, 14 und 21 Tagen unter Verwendung einer Anordnung, die Strom-und Spannungs-ziehende Messelektroden gemessen.
Das beschriebene Verfahren kann zur Isolierung von mikrovaskulären ECs verwendet werden aus verschiedenen Mausstämmen sowie aus verschiedenen Knock-out-Maus-Stämme, die spezifischen Änderungen im vaskulären Endothel-Funktion zu studieren. Als ein Verfahren zur Immortalisierung verwendeten wir die Transformation mit Onkoproteins von murinem Polyomavirus, Polyoma mittleren T-Antigen. Es wandelt sich rasch unreifen Endothelzellen in vivo und in vitro 20,21,22. Andere Verfahren zur Immortalisierung von ECs in der Literatur beschrieben sind beispielsweise die Immortalisierung mit SV40 large T-Antigens von Simian Virus 40 vakuolisierenden 23, Adenovirus E1A Genprodukt 24 oder Überexpression der katalytischen Untereinheit der humanen Telomerase 3. Die Immortalisierung mit PYMT ist spezifisch für den murinen unreifen ECs, die Gewinnung eines homogenen EG Kultur aus neugeborenen Mäusen in einer kurzen Zeit ermöglicht. Immortalisierung verändert die Eigenschaften der Zellen und the Ergebnisse mit immortalisierten Zelllinien erhalten sollten entweder mit primären Zellen oder mit Experimenten in vivo an Mäusen verglichen werden. PYMT immortalisierten EG beschrieben worden, um eine hohe fibrinolytische Aktivität, die aus einer erhöhten Produktion von Urokinase-Plasminogen-Aktivator exprimieren und eine verminderte Produktion von Plasminogenaktivator-Inhibitoren 25. Direkter Vergleich von PYMT verewigt bEND5 Zelllinie mit primären ECs ergab, dass sowohl in vitro als BBB Modelle sind bekannt für T-Zell-Adhäsion Studien 26 geeignet.
Die Zelllinien etabliert nach dem beschriebenen Verfahren kann bei niedrigen Passage-Nummer verwendet werden, um Barriereeigenschaften durch hohe Expression von BBB und EC junctional Proteine zu erhalten, da die Zellen diese Eigenschaften verlieren, während des Alterns. Somit nach Verlust der Barriereeigenschaften, sollte die Herstellung einer neuen Zellinie betrachtet werden. Zelle Plattierungsdichte sollte für ECs hoch, da diese entscheidend für die Zellproliferation. Dies muss bei der Isolierung als auch Wartung des verewigt ECs werden. Jede neue Zelllinie sollte ihre Sperreigenschaften und für eventuelle Verunreinigungen mit anderen Zelltypen getestet werden. EC Monoschichten kann mit anti-Galactocerebrosid, Anti-glial fibrillary acidic protein-und anti-glatte Muskulatur-Antigen als primäre Antikörper angefärbt werden, um die Kontamination mit Oligodendrozyten, Astrozyten und Perizyten 4,27 auszuschließen. Um eine Kontamination durch meningal Gefäßsystem kann die Expression von Thrombomodulin getestet werden, was sich in allen Gefäßbetten mit Ausnahme des Gehirns 28 exprimiert.
Interessanterweise unterscheiden sich die immortalisierten mikrovaskulären Endothelzellen Zelllinien aus verschiedenen Hirnregionen isoliert in ihrer Barriere-Eigenschaften und die Anfälligkeit für proinflammatorische Stimuli. Als ein Beispiel können die zerebrale CEND und zerebelläre cerebEND Zelllinien genannten 4,5 sein. CerebEND zeigten im Vergleichum CEND, geringere Expression von großen tight junction Komponenten Claudin-1 und Occludin. Jedoch waren die Ebenen der Claudin-3 und -12 höher cerebEND. Die Barrierefunktion cerebEND Zellen erlitten wesentlich unter einer Behandlung mit dem Entzündungsmediator, TNFa als die Barriereeigenschaften CEND Zellen tat 5. Höhere Kleinhirn Anfälligkeit für entzündliche Stimuli können in vivo in Patienten mit Multipler Sklerose und in seiner Tiermodell der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis 29 beobachtet werden. Diese interessanten Ergebnisse zeigen die Notwendigkeit der Erzeugung und Charakterisierung von einzelnen in vitro Modelle für unterschiedliche Hirnregionen, um die Zukunft Drug Targeting in das Gehirn zu verbessern.
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft DFG unter Grantnummer FO 315/4-1 und DFG SFB 688 unterstützt.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare |
Rinderserumalbumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | Reinheit> 98% |
Kollagen IV | Sigma-Aldrich | C5533 | 50 ug / ml in 50 mM Essigsäure |
Collagenase / Dispase | Roche | 10269638001 | |
Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Fötalem Kälberserum (FCS) | PAA Laboratories | A15110-1333 | Endkonzentration 10%, hitzeinaktiviertes (30 min bei 56 ° C) |
L-Glutamin | Biochrom AG | K0282 | Lagerung: ≤ -15 ° C |
MEM Vitamine | Biochrom AG | K0373 | Lagerung: ≤ -15 ° C |
Na-Pyruvat | Biochrom AG | L0473 | |
Neomycin (G418) | PAA Laboratories | P11-012 | |
Nicht essentielle Aminosäuren (NEA) | Biochrom AG | K0293 | Lagerung bei 4 ° C |
Penicilin / Streptomycin | Biochrom AG | A2212 | Lagerung: ≤ -15 ° C |
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Biochrom AG | L1825 | |
Polybrene (Hexadimethrinbromid) | Sigma-Aldrich | 107689 | 0,8 mg / ml in PBS, Lagerung bei -20 ° C |
Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
Trypsin / EDTA | Biochrom AG | L1825 | 0,05%, 0,02% EDTA in PBS |
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