Transplantation von Pankreas-Inseln in die Niere Capsule von diabetischen Mäusen

Zusammenfassung

Unser Protokoll wurde entwickelt, um sauber und einfach liefern Inseln oder Zellen unter die Nierenkapsel von Mäusen. Die Zellen werden zu Pellets in den letzten Schlauch für die Transplantation der Zellen unter die Nierenkapsel verwendet konzentriert. Die Leichtigkeit dieser Technik reduziert den Stress auf die Zellen und der Maus.

Zusammenfassung

Unser Protokoll wurde entwickelt, um sauber und einfach liefern Inseln oder Zellen unter die Nierenkapsel diabetischer oder normalen Mäusen. Wir fanden, dass es leichter war, die kleinen Inseln oder Zellen in Pellets in den letzten Förderschlauch (PE50) verwendet werden, um die Zellen unter die Nierenkapsel Transplantation zu konzentrieren. Diese Technik bietet sowohl Geschwindigkeit und Leichtigkeit bei gleichzeitiger Verringerung unnötigen Stress auf die Zellen oder die Maus.

Loading: Settled, hob die Hand, Inseln oder pelletierten Zellen werden sorgfältig aus dem Boden eines 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit einem p200 pipetteman und eine gerade, dünnwandige Pipettenspitze aufgenommen. Eine Länge von PE50 Schlauch wird die Pipettenspitze mit einem kleinen Silikon-Adapter Schlauch befestigt. Die Zellen sind absitzen, in die Spitze, und dann sind die PE50 Rohr durch langsames Wahl der pipetteman übertragen. Sobald die Zellen in der Nähe des Ende des PE50 Schläuche sind, ist ein Knick machte und die Silikon-Adapter Schlauch wird über den Knick gestellt. Der PE50 Schlauch wird in ein 15 ml konische mit einem Schnitt 5 ml Pipette übertragen, und die PE50 Schlauch wird über die Seite der 5 ml-Pipette mit Klebeband zu verhindern Eisstockschießen beim Zentrifugieren. Die Zellen sind erlaubt bis 1.000 Umdrehungen pro Minute erreichen und blieb stehen.

Transplantation: Empfänger Mäuse betäubt, rasiert und gereinigt. Durch einen kleinen Schnitt an der linken Flanke der Maus gemacht und die Niere freigelegt. Die Niere, Fett und Gewebe feucht gehalten mit physiologischer Kochsalzlösung Tupfer. Das distale Ende des PE50 ist ein Hamilton Schneckenantrieb Spritze befestigt ist, mit einer Pipettenspitze, mit dem Silikon-Adapter Schlauch. Eine kleine nick ist auf der rechten Flanke Seite der Nieren gemacht, nicht zu groß noch zu tief. Die abgeschrägte Ende des PE50-Schlauch, am nächsten die Zellen, wird sorgfältig unter der Kapsel wird der Schlauch um sanft bewegt, um Platz zu machen, während swabbing physiologischer Kochsalzlösung; einem trockenen Kapsel kann leicht reißen. Eine kleine Luftblase unter der Kapsel durch langsames Wählen Sie die Spritze Schneckenantrieb geliefert. Inseln sind dann langsam hinter die Luftblase geliefert. Sobald die Inseln geliefert worden Nieren Homöostase erhalten bleibt und die knick ist bei niedriger Hitze verödet. Die Niere ist zurück in die Höhle gebracht und das Bauchfell und Haut werden vernäht und geheftet. Mäuse sind sofort mit Flunixin und Buprenorphin sq behandelt und in einem Käfig auf einem Heizkissen.

Protokoll

Vorbereitung der Inseln für die Transplant (Tx)

1. Unter einem inversen Mikroskop, hand-pick Inselchen mit einem P200 Pipetman und gerade Pipettenspitze aus den kultivierten Inseln in einem 100mm Platte.
2. Graf Inselchen 100 pro und Transfer in jede Mikrozentrifugenröhrchen (~ 500 Inseln / Rohr / Maus).
3. Lassen Inseln auf den Grund des Mikrozentrifugenröhrchen begleichen.
4. Zeichnen Sie eine kleine Insel Pellets in ein P200 Pipetman (eingestellt auf 130ul) mit einer geraden dünnwandigen Pipettenspitze.
5. Legen Sie einen Silikonschlauch-Adapter über die Spitze der Spritze. Legen Sie eine Länge von PE50 Rohr in die Silikon-Adapter.
6. Hängen Sie die Pipetman auf die Seite der Motorhaube und Band der PE50 Schlauch an der Haube Wand höher als die Inseln in der Spitze. Damit können die kleinen Inseln, nur in der Spitze der Pipette zu begleichen.
7. Übertragen Sie die Inseln in den PE50 Rohr durch langsames Wahl der Pipetman und Bewegung der kleinen Inseln in der PE50 Rohre, darauf achten, daß die Inseln aus dem Ende zu vertreiben.
8. Machen Sie einen Knick in das abgeschrägte Ende des PE50 Schlauch. Unter Beibehaltung der Knick, trennen Sie das Silikon-Adapter Schlauch von der Pipetman und sichern Sie den Knick mit dem Silikon-Adapter.
9. Legen Sie die kleinen Inseln in der PE50 Schläuche, geknickt Silikon-Adapter Schlauch nach unten in ein konisches 15 ml mit einem Schnitt 5 mL Pipette und Band der PE50 Schlauch über die Seite der 5 ml Pipette zu verhindern, Eisstockschießen des PE50 Schlauch während Zentrifugieren.
10. Zentrifugieren Sie die PE50/15mL konische zu 1000 Umdrehungen pro Minute, und schalten Sie Zentrifuge. (Never bereiten mehr als 10 Inselchen Vorbereitungen auf einmal).
11. Das Röhrchen auf Eis.

Vorbereitung der Mouse for Transplant

1. Anesthetize die Mäuse mit Isofluoran oder mit Ketamin / Xylexene (siehe Vorbereitung Protokoll).
2. Nach Betäubung entnommen beeinflussen, rasieren die linke Flanke der Maus.
3. Swab Haut von Mäusen, Center-out, mit Povidon Jod Tupfer und wischen Sie dann mit einem ETOH Tupfer.
4. Suchen Sie die linke Niere (knapp rechts von der Milz). Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Haut, Aussetzen des Bauchfells.
5. Machen Sie einen kleinen Schnitt in das Bauchfell Freilegung der Niere. Keeping the Schnitt kleiner wird im Sinne der Niere erhöht und ausgesetzt zu helfen.
6. Tragen Sie einen leichten Druck auf beiden Seiten des Einschnitts, erhöhen oder Pop die Niere aus die Maus.
7. Halten Sie die Niere feucht durch die Anwendung physiologischer Kochsalzlösung mit einem Wattestäbchen Wattestäbchen.
8. Mit einer Spritze 23 oder 25 Gauge-Nadel, einen kleinen Kratzer auf der rechten Flanke der Niere, die Schaffung eines nick in die Nierenkapsel; nicht zu tief oder zu groß.

Transplantation von Inselzellen

Hinweis: Während sich die Maus für Tx vorbereitet wird, die zweite Person sollte die Hamilton Schraub-Laufwerk Inseltransplantats Spritze vorzubereiten.

1. Entfernen Sie langsam die Silikon-Adapter Schlauch vom PE50 Rohr unter Beibehaltung der Knick im Schlauch.
2. Platzieren Sie das andere Ende des PE50 Rohr in die Silikon-Adapter Schlauch und platzieren Sie den Silikon-Adapter Schlauch an der Pipettenspitze an der "Schraube-drive" Glas Hamilton-Spritze. Langsam loslassen Knick in der PE50 Rohre darauf achten, dass die Inseln nicht austreten.
3. Schieben Sie die Inseln langsam an die Spitze des PE50-Schlauch mit der "Schraube"-Mechanismus, aber halten Sie eine kleine Luftblase in der Vorderseite des kleinen Inseln in der PE50-Schlauch.
4. Into the nick gemacht in der Niere, vorsichtig die PE50 Rohre unter der Kapsel, so dass eine kleine Tasche. Seien Sie sehr vorsichtig, nicht auf die Nieren-oder Punktion durch die Kapsel Beitel.
5. Es hilft, die Fläche und Kapsel feucht mit normaler Kochsalzlösung getränkt Gentamycin Wattestäbchen Wattestäbchen zu halten; einem trockenen Kapsel leicht reißen.
6. Bewegen Sie den Schlauch in alle Richtungen, wodurch ein "Taschengeld" für die transplantierten Inseln zur Ruhe. Denken Sie daran, zusätzliche physiologische Kochsalzlösung erneut, damit die Fläche feucht.
7. Unter der Leitung von der Person, die mit der Maus geöffnet hat und wer hat die PE50 Schlauch unter die Nierenkapsel platziert, die zweite Person, die die Maus und Hamilton Transplantation Spritze vorbereitet, wird langsam voran Inseln unter der Kapsel, in der "Tasche", hinter einer kleinen Luftblase durch den PE50 Schläuche geliefert werden, bis alle Inseln verpflanzt.
8. Entfernen Sie langsam den PE50 Schläuche, trocknen Sie den Bereich mit einem trockenen Wattestäbchen und vorsichtig cauterize den nick mit geringer Wärmeentwicklung.
9. Mit einem trockenen Wattestäbchen Wattestäbchen, sicherzustellen, dass alle Blutung aufgehört hat. Sobald Blutung aufgehört hat, wieder befeuchten die Niere mit steriler Kochsalzlösung, und sanft ersetzen die Niere in die Bauchhöhle vor dem Schließen der Maus mit Naht und die Haut Heftklammern.

Closing / Revival der Maus

1. Schließen Sie das Bauchfell mit einer laufenden Stich mit 5-0 Seidenfäden w / a C-6 19mm Nadel.
2. Mit einer Pinzette ziehen beide Seiten der Hautschnitt zusammen.
3. Staple die Haut zusammen mit 2 oder 3 Klammern.
4. Reinigen Sie die Haut der Maus von Blut, mit einem Wattestäbchen Wattestäbchen und Saline.
5. Unmittelbar behandeln die Maus mit einer subkutanen Injektion von Flunixin und Buprenorphin.
6. Platzieren Sie die Maus in einen Käfig, der auf einem Heizkissen oder unter eine Wärmelampe gelegt wird, bis die Maus ist vollständig aktiv.
7. Entfernen Sie die Haut Heftklammern in 2 Wochen.

Diskussion

Dieses Protokoll bietet eine praktische und effiziente Möglichkeit für die sauber und einfach liefern Inseln oder Zellen unter die Nierenkapsel diabetischer oder normalen Mäusen. Die Technik der Konzentration und Pelletierung der Inseln oder Zellen in den letzten Förderschlauch (PE50) verwendet werden, um die Zellen unter die Nierenkapsel Transplantation bietet eine einfache und effektive Methode der Transplantation von Zellen bei gleichzeitiger Verringerung unnötigen Stress auf die Zellen oder die Maus.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical gloves	Fisher Scientific	11-394-95(sz)
Surgical scrub sponges	Moore Medical	42940AK
Forceps	Miltex Inc.	6-114 and 6-26	2 with teeth, 2 straight
Dissecting scissors n=2	Miltex Inc.	5-290
Oster razor (sz. 40 blade)	Fisher Scientific	01-305-10B
4x4 Sterile gauze pads	Moore Medical	08252AK
Povidone Iodine pads	Moore Medical	08486AK
Alcohol pads	Fisher Scientific	14-819-2
Heating pad	Moore Medical	42508AK
23G or 25G needles			1" long
Cidex solution	Moore Medical	07535AK	for cleaning/santizing instruments
PE50 polyethylene tubing	BD Biosciences	427411	PE50, 0.965mm O.D. x 0.58mm I.D.
Cidex + 28 day soln	Moore Medical	35625AK
Silicone tubing	Spectrum Chromat.	123732	5/32”OD x 1/32” ID
Instrument sterilizing container	Moore Medical	39074AK
Straight Pipet Tips	USA Scientific, Inc.	1111-0810	sterile
Glass syringe w/screw-drive	Hamilton Co	1001
Cauterizing tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS230
Needle Holder	Moore Medical	41-067
5-0 silk	LOOK Surgical	754B	for suture (6-C)
Cotton tipped swab	Moore Medical
9mm autoclip stapler	BD Biosciences	7630
9mm staples	BD Biosciences	7631
9mm staple remover	BD Biosciences	7637