Funktionelle Bildgebung Brown Fat in Mäusen mit FDG micro-PET/CT

Zusammenfassung

Verfahren zur funktionellen Bildgebung von Maus braunen Fettgewebe (BAT) beschrieben, bei dem kalte-stimulierte Aufnahme von 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) in BAT nichtinvasiv beurteilt mit einer standardisierten micro-PET/CT Protokoll ist. Diese Methode ist robust und sensibel auf Unterschiede in der BAT-Aktivitäten in Maus-Modellen erkennen.

Zusammenfassung

Braunem Fettgewebe (BAT) von weißem Fettgewebe (WAT) durch seinen diskreten Ort und einem braun-rote Farbe aufgrund reiche Vaskularisierung und hohe Dichte von Mitochondrien. BAT spielt eine wichtige Rolle im Energie-Ausgaben und nicht zitternd Thermogenese bei neugeborenen Säugetieren sowie den Erwachsenen ^ein. BAT-vermittelten Thermogenese ist stark von der sympathischen Nervensystems reguliert, überwiegend über β-adrenergen Rezeptor ^{2, 3.} Jüngste Studien haben gezeigt, dass BAT Aktivitäten im menschlichen Erwachsenen negativ mit einem Body Mass Index (BMI) und anderen diabetischen Parametern ^4-6 korreliert. BAT hat damit als potenzielles Ziel für anti-obesity/anti-diabetes Therapie, die auf Modulation der Energiebilanz ^6-8 vorgeschlagen worden. Während mehrere kalte Herausforderung basierenden Positronenemissionstomographie (PET) Verfahren zum Nachweis von menschlichen BAT ^9-13 eingerichtet sind, es im Wesentlichen kein standardisiertes Protokoll für die Bildgebung und quantifendungsbe der BAT in kleinen Tiermodelle wie Mäuse. Hier beschreiben wir eine robuste PET / CT-Bildgebung Methode zur funktionellen Beurteilung der BVT in Mäusen. Kurz gesagt, waren erwachsene C57BL/6J-Mäuse kalt unter nüchternen Bedingungen für eine Dauer von 4 Stunden behandelt, bevor sie eine Dosis von ¹⁸ F-Fluorodeoxyglucose (FDG) erhalten. Die Mäuse wurden in der Kälte für eine zusätzliche Stunde post-FDG Injektion blieb, und dann gescannt mit einem kleinen Tier-dedizierten micro-PET/CT System. Die erworbenen PET-Bilder wurden mit der CT-Bilder für anatomische Referenzen Kooperationen registriert und analysiert FDG im interskapularen BAT Bereich BAT Aktivität präsentieren. Diese standardisierte kalt-Behandlung und bildgebende Protokoll wurde durch Testen BAT Aktivitäten wurden in pharmakologischen Interventionen validiert beispielsweise die unterdrückte BAT Aktivierung durch Behandlung der β-Adrenozeptor-Antagonist Propranolol ^{14, 15} oder der erweiterten BAT Aktivierung durch β3-Agonist BRL37344 ^16. Das Verfahren described hier zum Auffinden von Wirkstoffen / Verbindungen, die BAT-Aktivität modulieren, oder Gene / Wege, die in BAT Entwicklung und Regulation in verschiedenen präklinischen und grundlegende Studien beteiligt zu identifizieren angewendet werden.

Protokoll

Ein. Tierische Vorbereitung und Kältebehandlung

1. Suchen und untersuchen Sie ein 4 ° C kalten Raum, der für die Aufnahme von Labormäusen genehmigt wurde.
2. Pre-chill Tierkäfige Nacht im Kühlraum. Die Käfige werden ohne Futter und Einstreu, aber mit einer Flasche Wasser montiert.
3. Am Morgen des experimentellen Tag, Ort Mäuse einzeln in jedem der vorgekühlte Käfigen bei 30 min Intervallen. Jeder einzeln eingesperrt Maus sollte in der kalten Raum für fast 4 Stunden bleiben, bevor es um die Imaging-Labor transportiert wird. Sicherstellen, dass die Mäuse, aber mit Zugang zu Wasser Fasten.
4. Bei 4 Stunden nach der Kältebehandlung Transport eines Tieres in einer Zeit alle 30 min zur Bildgebung Lab. Dies kann durch Füllen eines Behälters mit Styropor Eis und Platzieren einer vorgekühlten Gehäusekäfigs auf der Oberseite der Eis im Inneren der Schachtel erreicht werden kann. Locker den Deckel auf dem Styropor-Box.

2. Setup Micro-PET/CT Imaging-Workflow

In diesem Protokoll micro-PET/CT Bildgebung mit der Siemens Inveon Dedicated PET (DPET) System und Inveon Multimodalität (MM) System (CT / SPECT) im angedockten Modus erreicht. Das Tier wird aus dem MM Eingang, zuerst mit dem CT für anatomische Artikeln abgetastet platziert und dann verschoben wird, um die Mitte des DPET für eine statische F18 PET Akquisition. Damit der Host-Computer für die Durchführung dieser sequentiellen Aufgaben automatisch, wird die folgende "Workflow" mit dem Inveon Acquisition Workplace (IAW) Software vor dem eigentlichen Bildgebungssitzung programmiert.

1. CT Acquisition: Bei einer Ganzkörper-CT-Scan, stellen Strom bei 500 uA, Spannung am 80kV, Belichtungszeit bei 200 ms und 240 Schritte für 240 °-Drehung. Für X-ray-Detektor, wählen Auflösung bei "low-System Vergrößerung" mit 78 mm axial Bildfeld und Einzelbett Modus. Wählen Sie "real time Wiederaufbau" mit dem "Common Cone-Beam Reconstruction"-Methode, so dass die Host-PC Gespräche mitein dediziertes Echtzeit Wiederaufbau Computer (Cobra), um die Aufgabe zu initiieren.
2. PET Emission Acquisition: Set 600 Sek. (10 min) für "fixed Scan-Zeit" in der "Erwerb durch die Zeit"-Option. Wählen Sie F-18 als "Studie Isotop" und verwenden 350-650 keV als "Energie".
3. PET Emission Histogramm: Set "dynamische frame" als "schwarz" Daten zu verarbeiten als ein Rahmen für die gesamte Dauer zu statischen Scan zu erreichen. Wählen Sie "3D", wie das Histogramm Art und wählen Sie "keine Streukorrektur".
4. PET Reconstruction: Verwenden Sie 2D-geordnete Teilmenge Erwartungsmaximierung (OSEM2D) als Rekonstruktionsalgorithmus.

3. Die Injektion von FDG

1. Bestellen Sie eine klinische Paket von ¹⁸ F-FDG (10 mCi) von einem regionalen Anbieter für seine Ankunft in der Imaging Lab ~ 30 min vor dem geplanten ersten Injektion. Folgen des Instituts Sicherheitsverfahren zu empfangen und zu überblicken das Paket mit radioaktiven Materials (RAM).
2. Mit dem Schutz von einem L-Block Tischplatte Schild, Aliquot der FDG und machen Verdünnungen mit sterilem Kochsalzlösung zur Verfügung gestellt. Die verdünnte Aktivitätskonzentration von FDG sollte bei 200-300 μCi/100 ul für jede Injektion verfügbar. Zeichnen Sie die FDG-Lösung in eine 1 ml Spritze mit 26G 1/2 inch Nadel, und messen die Radioaktivität des gesamten Spritze mit einer Dosiskalibrator.
3. Spritzen Sie das Tier, das gerade aus dem kalten Raum (siehe Schritt 1,4) mit 100 ul FDG-Lösung über die intraperitoneale (ip) Weg transportiert wird. Notieren Sie sich die Einspritzzeit. Messen Sie den Rückstand Radioaktivität der Spritze wieder mit dem Dosiskalibrator.
4. Legen Sie das Tier zurück in den kalten Käfig in einem Styropor-Kühler mit Eis gehalten. Inkubieren das Tier in kaltem (~ 4 ° C) für 1 Stunde für FDG.
5. Berechnen des injizierten FDG Aktivität für jede Maus durch die folgende Formel:
   Injizierten Aktivität (Ci) = Aktivität in der Spritze vor der Injektion- Aktivität in der Spritze nach der Injektion

4. Micro-PET/CT Imaging

1. Die micro-PET/CT Bildgebung beginnt 1 Stunde nach der FDG Injektion oder 5 Stunden nach der Kältebehandlung. Legen Sie das Tier in einer Narkose Kammer mit 3% Isofluran in Sauerstoff.
2. Sobald Anästhesie induziert wird, wird das Tier auf eine Mikro-CT Pellet (Tierbettes) mit seinem Kopf ruht in einem Kegel Gesichtsmaske, die kontinuierlich liefert Isofluran (2%) mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 L / min bewegt. Eine elektrische Heizkissen (BioVet, m2m Imaging Corp) wird unter das Tier gelegt zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur.
3. Schieben Sie das Tier zum Eingang des MM-Scanner, aktivieren Sie die "Laser"-Symbol in der Symbolleiste, und verwenden Sie das Touchpad-Steuerung, um das Bett zu bewegen, so dass die Brust des Tieres ist an der Kreuzung der horizontalen und vertikalen Laserlinien. In der "Laser ausrichten"-Fenster wählen Sie "ersten Scan-Typ" als CT-Scan und "PET Akquisition im Workflow enthalten" als option.
4. Öffnen Sie die "Scout View"-Fenster und erwerben ein Scout view Röntgenaufnahme. Verwenden IAW, um die Position des Tieres Bett einzustellen, so dass das Zentrum des Sichtfeldes CT in der Mitte der Maus Körper (Leber) befindet. Wiederholen Sie diesen Schritt, falls erforderlich.
5. Starten Sie den "Workflow" in Schritt 2 eingerichtet. Wenn Optionen auftauchen, wählen Sie eine entsprechende 3D-PET-CT Transformationsmatrix Datei in CT-Rekonstruktion verwendet werden, und wählen Sie eine neu geschaffene Normalisierung Datei für PET-Rekonstruktion ohne Schwächungskorrektur. Das IAW startet dann CT-und PET-Scans nacheinander als programmiert.
6. Nach der gesamte Workflow abgeschlossen ist, die 20 bis 25 Mai min dauern, kurz bewerten die Qualität der erworbenen CT-und PET-Bilder mit dem ASIPro VM, ein Mikro-PET-Analyse-Software mit IAW mitinstalliert. Archivieren der Bilddaten zu einer Datenspeichereinrichtung oder die Daten über das Netzwerk an einen Pfosten Bildanalyse Arbeitsstation (siehe Schritt 5) für eine weitere Analyse.
7. Release das Tier aus den bildgebenden Systemen und legen Sie es auf eine saubere Gehäusekäfig mit normalen Lebensmittel-und Wasserversorgung für die Erholung bei Raumtemperatur. Die Systeme sind nun bereit für die nächste Tier in der Warteschlange. Beachten Sie die Pflege und Behandlung von post-Bildgebung Tiere sollten des Instituts Vorschriften über "Umgang mit Labortieren mit RAM injiziert" folgen. Beachten Sie auch, dass gebrauchte Nadeln / Spritzen, die Saugkissen, Handschuhe und alle Betten und Fäkalien sollte als radioaktiver Abfall betrachtet werden, Umgang und des Instituts relevant RAM Entsorgungsvorschriften.

5. Post-Imaging-Analyse

1. Offene Inveon Research Workplace (IRW) Software (Siemens) und manuell importieren sowohl CT-und PET-Datensätzen. Co-Register CT-und PET-Bilder in Fenster "Registrierung" Einsatz von Werkzeugen mit dem "General-Analyse" Funktion, und unter dem "Review"-Fenster stellen Sie sicher, eine perfekte Ausrichtung zwischen CT-und PET-Bilder in allen 3 Dimensionen.
2. Von "Region of Interest (ROI) Quantifizierung"-Fenster, mit den Referenzen von den Ko-registrierten CT-Bilder zur Verfügung gestellt, identifizieren BAT am interskapularen Bereich des Halses, die vorherrschende kälteinduzierbare BAT in erwachsenen Mäusen, und ziehen Volumen von Interesse (VOI) von BAT auf den PET-Datensatz. Wählen Sie "Voxel Intensity" als "Quantifizierung Type" und notieren Sie die mittlere Radioaktivität innerhalb des VOI als Bq / ml. Ein Kalibrierungsfaktor die Counts / sec umwandelt Bq / ml wurde zuvor durch Abtasten eines Phantoms mit bekannten Radioaktivität errichtet.
3. FDG-Aufnahme in BAT wird als Prozentsatz der injizierten Dosis pro Gramm Gewebe (% ID / g) mit Zerfallskorrektur quantifiziert. Die injizierte Dosis ist das Ergebnis von Schritt 3.5, jedoch Becquerel (Bq) Einheit (1 uCi = 37.000 Bq) umgewandelt wird; wir an, dass 1 ml bis 1 g Gewebe entspricht.

Ergebnisse

Ein Beispiel für micro-PET/CT Bildgebung von Maus BAT ist in Abbildung 1 gezeigt. Während die CT-Bildgebung liefert anatomische Informationen codiert die PET-Bildgebung die Verteilung und Menge von ¹⁸ F-FDG durch den ganzen Körper. Diese Bilddaten können separat betrachtet werden (1A und 1B), fusioniert (1C), oder sich mit einem 3D-Merkmal, wie maximale Intensität (MIP, 1D). Mit Hilfe eines 3D-Bildgebung Werkzeug, ein Volumen von Interesse (VOI), hier der interskapularen BAT Region (durc...

Diskussion

In dieser Studie wurde eine micro-PET/CT-based Bildgebungsverfahren hat zum Erfassen BAT Aktivitäten in erwachsenen Mäusen, die einfach benötigt eine Kältebehandlung und eine Injektion von handelsüblichen ¹⁸ F-FDG entwickelt. Das gesamte Verfahren kann in einem Tag nach einer Behandlung und Imaging-Sequenz, die alle 30 Minuten beginnt, bis alle Tiere behandelt werden und abgebildet durchgeführt werden. Unter den experimentellen Bedingungen umrissen, können insgesamt 10 Mäusen (oder 2 Gruppen von 5 Mä...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
Micro-PET/CT Imaging System	Siemens Medical Solutions USA, Inc.	Inveon Dedicated PET System und Inveon Multimodalität CT / SPECT System (angedockt)
Propranolol	Sigma	P0884
BRL 37344	Sigma	B169
18 F-FDG	Cyclotope Inc.
C57BL/6J männlichen Mäusen	Jackson Laboratory	000664	3-4 Monate alt