Verfahren zur Herstellung Biofunktionelle Nanofasern

Zusammenfassung

Ein effizientes Konzept zur Herstellung von Nanofasern mit funktionellen Gruppen, die spezifisch mit Proteinen dekoriert wird beschrieben. Der Ansatz erfordert zunächst die Herstellung eines Polymers mit der entsprechenden funktionellen Gruppe funktionalisiert. Die funktionelle Polymer in Nanofasern durch Elektrospinnen hergestellt. Die Effektivität der Bindung der Nanofasern mit einem Protein durch konfokale Mikroskopie untersucht.

Zusammenfassung

Elektrospinnen ist eine effektive Herstellungsverfahren zur Herstellung Nanofasern mit funktionellen Gruppen ausgestattet. Nanofasern mit funktionellen Gruppen ausgestattet kann genutzt werden, um Material-Biomarker Interaktionen dh als Biosensoren mit Potenzial als einzelnes Molekül Detektoren zu untersuchen. Wir haben ein effizientes Verfahren zur Herstellung von funktionellen Polymeren, wo die Funktionalität hat die Fähigkeit zur spezifischen Bindung mit einer Protein-Modell entwickelt. In unserem Modell-System, ist die funktionelle Gruppe 2,4-Dinitrophenyl (DNP), und das Protein Anti-DNP-IgE (Immunglobulin E). Das funktionelle Polymer, α, ω-bi [2,4-Dinitrophenyl Capronsäure] [poly (ethylenoxid)-b-Poly (2-Methoxystyrol)-b-poly (ethylenoxid)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO- CDNP) wird durch anionische lebende Polymerisation hergestellt. Die difunktionellen Initiator bei der Polymerisation verwendet wurde durch Elektronentransfer Reaktion von α-Methylstyrol und Kalium (Spiegel) Metall hergestellt. Das 2-Methoxystyrolmonomer zugegebenerste an den Initiator durch Zugabe des zweiten Monomeren, Ethylenoxid gefolgt, und schließlich das lebende Polymer wurde durch Methanol beendet. Die α, ω-dihydroxyl Polymer [HO-PEO-P2MS-PEO-OH] wurde mit N-2 ,4-DNP-∈-Aminocapronsäure, durch DCC Kopplung, was zur Bildung von α, ω-bi umgesetzt [ 2,4-dinitrophenylcaproic] [poly (ethylenoxid)-b-Poly (2-Methoxystyrol)-b-poly (ethylenoxid)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP). Die Polymere wurden durch FT-IR-, ¹ H-NMR-und Gelpermeationschromatographie (GPC) charakterisiert. Die Molekulargewichtsverteilungen der Polymeren waren schmal (1.1-1.2) und Polymere mit Molekulargewichten größer als 50.000 wurde in dieser Studie verwendet. Die Polymere wurden gelbe Pulver und löslich in Tetrahydrofuran. Ein wasserlösliches CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / DMEG (dimethoxyethylene Glykol)-Komplex bindet und erreicht stationären Bindung mit IgE-Lösung innerhalb von wenigen Sekunden. Höherem Molekulargewicht (wasserunlösliche also rund 50.000) CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP Polymere, enthaltend 1% einwandige Kohlenstoff-Nanoröhren (SWCNT) wurden in elektroaktiven Nanofasern (100 nm bis 500 nm im Durchmesser) auf Silizium-Substrat verarbeitet. Fluoreszenz-Spektroskopie zeigt, dass anti-DNP IgE interagiert mit den Nanofasern durch Bindung mit den DNP funktionellen Gruppen Dekoration der Fasern. Diese Beobachtungen legen nahe, dass entsprechend funktionalisierten Nanofasern Versprechen für die Entwicklung Biomarker Detektionseinrichtung halten.

Protokoll

Ein. Synthese von α, ω-dihydroxyl Polymer [HO-PEO-P2MS-PEO-OH]

1. Polymerisationsreaktor zusammenzubauen, wie in Abbildung 1 gezeigt. Der Reaktor für dieses Experiment bestehen aus einem 100 ml Rundkolben 2-Hals-Kolben mit einem Einbauschliff Gelenkaußenteil (Chemglass), zwei Flusssteuerung Adaptern mit Hähnen (Chemglass) und eine Teflon-Rührstab. Adapter A (Abbildung 1) wurde verwendet, um Ultrahochreine (UHP) Stickstoff durch das System fließt, um Luft und Feuchtigkeit in das inerte Systems zu verhindern. Adapter B (Abbildung 1) wurde verwendet, um das Lösungsmittel, Monomer und Initiator in den Reaktionskolben zu injizieren.
2. Trocknen 200 ml Tetrahydrofuran (THF) über Na Metall, mit Benzophenon als Indikator für mindestens 6 Stunden unter trockenem Stickstoffgas.
3. Trocknen 10 ml 2-Methoxystyrol über Calciumhydrid für 24 Stunden.
4. Vorbereiten einer kalten Temperatur Bad bei -78 ° C unter Verwendung eines Schlamms aus einem Isopropanolnd flüssigem Stickstoff.
5. 25 ml THF in die Polymerisation Reaktionskolben (siehe Abbildung 1) unter Stickstoff und halten Reaktor unter Stickstoff allem durch die Polymerisation.
6. Platz 100 ml Rundkolben in Schlamm.
7. 2 ml (0,27 mmol / ml) von der Initiator-Lösung in den Reaktionskolben.
8. Injizieren das erste Monomer, 2-Methoxystyrol (4 ml) in den Reaktionskolben.
9. Ermöglichen die Reaktion für 40 min fort.
10. 1 ml der zweiten Monomer, Ethylenoxid.
11. Erlauben die Polymerisation bei Raumtemperatur zwei Tage lang fortgesetzt.
12. Beenden des Polymers mit HCl (6 M) / Methanol (1/20, v / v).
13. Reinigen das Polymer durch Ausfällen in Hexanen und trockenem Polymer in einem Vakuumofen.
14. Charakterisierung des Polymers mittels NMR.

2. Funktionalisierung von α, ω-Dihydroxy-Polymer mit N-2 ,4-DNP-Ε-Aminocapronsäure an das Funktionale Polym erhaltenäh, CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP

1. In einem Dreihalskolben, platzieren die α, ω-dihydroxyl Polymer (0,05 mmol), das N-2 ,4-DNP-E-Aminocapronsäure (0,25 mmol), DCC (0,15 mmol) und DMAP (0,005 mmol) und Trocknen auf Unterdruckleitung für 4 Stunden.
2. Abzudestillieren trockenem Dichlormethan (10 ml) in den Kolben.
3. Das Vakuum unter Stickstoff und unter Rühren für 12 Stunden Reaktion bei Raumtemperatur.
4. Filter Reaktionsgemisches und erholen Polymer durch Ausfällen zweimal in Hexan und Methanol.
5. Trocken ausgefällt Polymer in einem Vakuumofen bei 40 ° C.
6. Ermitteln der Polymerstruktur und Funktionalität durch FT-IR-und ¹ H-NMR.

3. Vorbereitung der CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/SWCNT Lösung für Elektrospinnen

1. Lösen Sie 20 w% der CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP in Chlorbenzol.
2. Lösen Sie 20 w% und 40 w% von Polystyrol (MW 800.000) in Chlorbenzol zu zwei Lösungen herzustellen. Die höhermolekularen Polystyrol verwendet wird zunehmende Polymerkette-Kettenverhakung und erhalten die optimale Viskosität für Elektrospinnen erforderlich.
3. Mischen Sie die Polymerlösungen in 3,1 und 3,2 zusammen, um 1:1 und 1:2 Verhältnisse der Polymere bilden und fügen 1 w% Single Walled Carbon Nanotubes (SWCNT) zu der Mischung und rühren über Nacht für eine gleichmäßige Verteilung der CNTs vorbereitet.

4. Elektrospinnen von Polymer-CNT Composite-

1. Montieren Sie den Elektrospinnen wie in Abbildung 2 dargestellt eingestellt. Auf der rechten Seite der Figur ist der Glassman High Voltage Source. Daneben ist eine Retorte Ständer, auf dem der Silizium-Wafer befestigt ist. Auf der linken Seite ist ein weiterer Retorte Stand, auf dem die Spritze montiert ist und dahinter ist die Lampe für die Visualisierung des Verfahrens, wie sie fortschreitet.
2. Mit einer Injektionsspritze, zurückzutreten eine kleine Menge des CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/polystyrene/SWCNT Gemisch (ca. 1 ml) und montieren Sie die Spritze auf der Retorte Ständer.
3. Ein Silizium-Wafer ist der Berged gegenüber der Spritze sicher im Abstand von 10 cm, und die Masseklemme der Hochspannungsquelle ist daran befestigt.
4. Befestigen des Clips mit dem Hochspannung an der Nadel an der Spritze aufgebracht werden, drücken den Kolben ein wenig (um einen Tropfen an der Nadelspitze suspendieren) und an diesem Punkt ist Elektrospinnen bereit.
5. Einschalten der Hochspannungsquelle und justieren Spannungsmesser bis 10 kV. Je nach Art der Polymere in dem zusammengesetzten, können höhere Spannungen benötigt werden, insbesondere wenn Nanofasern unter hundert Nanometern Durchmesser erwünscht sind.
6. Unmount Silizium-Wafer und in einem Exsikkator über Nacht vollständig trocknen.

5. Charakterisierung von Nanofasern

1. Anfängliche Bildgebung von Nanofasern mit optischen Mikroskop, um die globale Betrachtungsweise der Fasern zu beobachten getan.
2. Nutzen Scanning Electron Microscope, um feinere Details wie Morphologie, Durchmesser, durchschnittliche Porengröße, etc. zu beobachten
3. Tragen, weitere Bildgebung mit einem Atomic Force Microscope, um 3-D Topographie von Fasern, etc. zu beobachten

6. Binding Spezifität von Nanofasern mit Anti-DNP IgE Protein

1. Bereiten Sie eine Lösung von 4 ug / l fluoreszenzmarkierten, FITC-IgE (Fluorescein Isothio-Cyanat-Immunglobulin E) in PBS-BSA (Phosphate Buffered Saline-Bovine Serum Albumin)-Lösung.
2. Legen Sie ein kleines Stück Silizium-Wafer, auf denen sich Nanofasern auf einem MatTek auch Deckglas. Inkubieren Sie die Nanofasern in dieser Lösung für eine Stunde. Die Inkubation wird durch sanftes Pipettieren aus, 10 ul IgE-Lösung auf dem Siliciumwafer getan.
3. Nach der Inkubation Entfernen ungebundener Probe IgE durch Waschen dreimal mit PBS-BSA Pufferlösung. Die PBS-Lösung wird sanft auf der Wand des MatTek Schale abgegeben wird, um zu vermeiden, Verspritzen den Puffer direkt auf den Nanofasern. Swirl das Gericht vorsichtig von Hand, um Pufferlösung auf Nanofasern verteilen. Entfernen Sie vorsichtig Puffer mit einer Pipette und neuTorf dies zwei weitere Male.
4. Für die Steuerung, inkubieren Nanofasern in fluoreszenzmarkierten IgG (unspezifisch für DNP) unter den gleichen Bedingungen.
5. Visualisieren der gebundenen Fasern mit einem konfokalen Mikroskop zu beobachten Bindung mit IgE. Für unsere Studie war die verwendete Mikroskop Leica TCS SP2 konfokalen mit 63x Objektiv.

7. Strom-Spannungs-Verhalten von Nanofasern

1. Verbinden Sie zwei Mikro-Stellungsregler zu einem sehr geringen Stromquelle wie der Keithley 6430 sensitive Sourcemeter. Die bis zum Bestimmen der Strom-Spannungs-Verhalten eingestellt ist in Abbildung 3 dargestellt. Diese Abbildung zeigt die Probe Station verwendet, um die anfänglichen IV Eigenschaften der Nanofasern zu bestimmen. Es setzt sich aus dem Bausch und Lomb MicroZoom Mikroskop, einem Vakuum Chuck Bühne, und vier Mikropositionierern bei der Sondierung verwendet wird. In der rechten oberen wird das Agilent 34405A Digital Multimeter bei der Messung der Spannung verwendet und unten das ist die Keithley 6430 Sub-Femtoampere Remote-Source-Meter Quelle die geringen Strömen, die Eingaben in die Fasern verwendet wurden.
2. Montage der Sondenarme der Mikro Positionierer über das Fasermatte auf gegenüberliegenden Seiten mit den Spitzen der Fasern berührt.
3. Verbinden Sie zwei weitere Mikro-Stellungsregler mit einem digitalen Multimeter, montieren Sie die Tastarme in-zwischen den beiden anderen und landen die Tipps der Fasermatte. Stellen Sie sicher, dass die vier Tipps, wie kollinear wie möglich sind.
4. Eingangs variierende Mengen an Strom von der Keithley (typischerweise im Bereich Nanoampere).
5. Messung des Spannungsabfalls an den äußeren Spitzen für jede Größe des Stromes bezogen.
6. Plotten diese Werte zeigen den Typ des Geräts, die Fasermatte wirkt wie.

8. Repräsentative Ergebnisse

Functional Polymer

"> Verfahren zur Synthese von α, ω-bi [2,4-Dinitrophenyl Capronsäure] [poly (ethylenoxid)-b-Poly (2-Methoxystyrol)-b-poly (ethylenoxid)] (-PEO-CDNP P2MS-PEO-CDNP) ist in Abbildung 4 dargestellt. ¹ Die Struktur der funktionellen Polymer wurde durch FT-IR (Abbildung 5) und 500 MHz ¹ H-NMR-Spektroskopie (Abbildung 6) bestätigt. Das FT-IR zeigt das komplette Verschwinden die-OH breite Absorption im Bereich von 3500 cm ^-1 zeigt quantitative Funktionalisierung mit dem CDNP Gruppe. Dies wird auch durch die NMR-Spektrum in 6 gezeigt bestätigt. Verwenden der Integration der Peaks in dem NMR-Spektrum wurde bestimmt, dass die CDNP-PEO -P2MS-PEO-CDNP Polymeren quantitativ funktionalisiert.

Nanofasern

In Abbildung 7 ist eine Matte aus leitfähigen Nanofasern durch Elektrospinnen CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / Polystyrol / SWCNT aus Chlorbenzol erhalten sheigenen. Konfokale Bilder erhalten wurde, zeigte, dass das Protein mit der IgE-DNP auf der Faseroberfläche bindet. ³ Dies ist ein Indiz für die Spezifität der Bindung von elektrogesponnenen DNP-Polymeren gegen IgE-Antikörper ist. Die Intensität des Lichts ist ein Indikator für das Vorhandensein von IgE auf den Nanofasern als das Protein fluoreszierend markiert ist.

8a ist eine AFM (Rasterkraftmikroskop) Bildes eines die Nanofasern durch dieses Verfahren und Figur 8b zeigt das erhaltene Dimension dieses insbesondere Nanofaser ist ca. 150 nm im Durchmesser. Nach diesem Verfahren Fasern zwischen 100-700 nm erhalten. Zu diesem aktuellen Zeitpunkt ist es schwierig, Fasern mit einer bestimmten Dimension vorzubereiten. Dies steht im Einklang mit dem, was durch andere Gruppen beobachtet. ⁴ Figur 9 zeigt REM-Aufnahmen von CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / Polystyrol / SWCNT Nanofasern und der Durchmesser der Nanofasern zwischen 200 nm bis 300 nm waren. Es gibt drei SEM Bilder der nanofibers bei unterschiedlichen Vergrößerungen dargestellt. Studie der drei Bilder zeigt die Morphologie der Fasern sind lineare und Perlen. Das übergeordnete Ziel ist, um Fasern, die meist linear sind vorzubereiten. Abbildung 10 zeigt die IV Grundstück von Matten aus Nanofasern aus CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / Polystyrol / SWCNT vorbereitet. Der Plot zeigt das Verhalten eines Widerstandes (Ohmscher). Wenn das Antigen an den Nanofasern gebunden ist, erwarten wir, um eine Änderung in der IV-Verhalten der Fasermatte zu sehen, wie diese Änderung des Widerstands ist ein Merkmal, dass die funktionalen Fasern potentielle Anwendung als die aktive Komponente in Sensoren für Einzelmoleküldetektion haben schlägt .

Abbildung 1. Polymerisationsreaktor für die Synthese der α, ω-dihydroxyl Polymer. A) Die Einspritzstelle für die Strömung UHP Gas Stickstoff. B.) Einspritzstelle für die Lösungsmittel, Monomer und Initiator. C) Das Reaktionsgefäß.

Abbildung 2. Setup für Elektrospinnen mit einem Glassman Hochspannungsquelle verwendet.

Abbildung 3. Setup verwendet, um IV Parzellen mit einer Sub-Femtoampere Fernbedienung Sourcemeter (Keithley) zu messen.

Abbildung 4. A). Synthetic Ansatz zur Herstellung von OH-PEO-P2MS-PEO-OH Polymeren. B) Funktionalisierung von α, ω-Dihydroxy [poly (ethylenoxid)-b-Poly (2-Methoxystyrol)-b-Poly (ethylenoxid)].

Abbildung 5. FT-IR-Spektren von (A) OH-PEO-P2MS-PEO-OH, Vorläufer CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP und (B) CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP.

Abbildung 6. 500 MHz Protonen-NMR der CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP.

Abbildung 7. A) Binding Bild von FITC-IgE mit CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP Fasern elektrogesponnenen aus Chlorbenzol. B) Konfokale mikroskopische Bild der Steuerung (Nanofasern mit IgG).

Abbildung 8. A) AFM-Bild CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP Fibers elektrogesponnenen aus Chlorbenzol und B) AFM Profil dh Dimension der einen Faser in 5a gezeigt.

Abbildung 9. REM-Aufnahmen von CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / Polystyrol / SWCNT Nanofasern.

Abbildung 10. IV Grundstück von Matten aus Nanofasern aus CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / Polystyrol / SWCNT vorbereitet.

Diskussion

In diesem Bericht haben wir einen leistungsstarken Ansatz zur Herstellung biofunktionalen Nanofasern vorgestellt. Die Nanofasern auf eine funktionelle Gruppe, die spezifisch für ein Protein ist Modells eingerichtet. Das Verfahren und die Vorgehensweise in dieser Mitteilung berichtet, ist allgemeiner Natur und können verwendet werden, um Nanofasern mit einem funktionellen Gruppe gewünschten dekoriert vorzubereiten. Das anionische lebende Polymerisation ist leistungsfähiges Verfahren zur kontrollierten Polymerstruktur...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer
Natrium-Metall	Sigma-Aldrich	282065
Benzophenone	Sigma-Aldrich	239852
2-Methoxystyrol	Sigma-Aldrich	563064
Tetrahydrofuran	Sigma-Aldrich	178810
Chlorbenzol	Sigma-Aldrich	319996
Einwandige CNTs	Sigma-Aldrich	704113
Polystyrol	Sigma-Aldrich	81416
Silizium-Wafer	Silicon Quest-Int'l	720200
Zeiss FESEM	Carl Zeiss Inc.	Ultra 60
Probestation mit Bausch & Lomb MicroZoom II High Performance Mikroskop	Bausch und Lomb
Leica konfokalen Systems	Leica Microsystems	TCS SP2
Sub-Femtoampere Fernbedienung Sourcemeter	Keithley Instruments	6430
Autoranging Digital Multimeter	Keithley Instruments	175A
Spritzenpumpe	Chemyx Inc.	Fusion 200
Zeiss Optical Microscope	Carl Zeiss Inc.	Zeiss / Axiotech