Dreidimensionale Zellkultur-Modell zur Messung der Auswirkungen der interstitiellen Flüssigkeit Flow auf Tumorzellinvasion

Zusammenfassung

Interstitielle Fluidstrom wird in soliden Tumoren erhöht und modulieren kann Tumorzellinvasion. Hier beschreiben wir eine Technik, um interstitielle Flüssigkeit fließen, um Zellen in einer Matrix eingebettet zu bringen und dann die seine Auswirkungen auf Zellinvasion. Diese Technik kann leicht angepasst werden, um andere Systeme zu studieren.

Zusammenfassung

Das Wachstum und die Progression der meisten soliden Tumoren sind abhängig von der anfänglichen Transformation der Krebszellen und ihre Reaktion auf Stroma-assoziierten Signalmoleküle in der Tumor-Mikroumgebung ^1. Bisher hat die Forschung auf die Tumor-Mikroumgebung in erster Linie auf die Tumor-Stroma-Interaktionen ^2.1 konzentriert. Allerdings ist die Tumor-Mikroumgebung auch eine Vielzahl von biophysikalischen Kräfte, deren Wirkungen noch wenig verstanden. Diese Kräfte sind biomechanischen Folgen des Tumorwachstums, die zu Veränderungen in der Genexpression, Zellteilung, Differenzierung und Invasion ³ führen. Dichte-Matrix ^4, Steifigkeit ^{5-6, 6-7} und Struktur, interstitielle Flüssigkeitsdruck ^8, und der interstitiellen Flüssigkeit fließen ⁸ sind alle während der Tumorprogression verändert.

Interstitielle Fluidströmung insbesondere eine höhere Tumoren im Vergleich zu normalem Gewebe ^8-10. Die geschätzte interstitiellen Flüssigkeit flow Geschwindigkeiten wurden gemessen und in dem Bereich von 0,1-3 um s ^-1, je nach Größe des Tumors und Differenzierung ^{9, 11.} Dies ist aufgrund des erhöhten interstitiellen Druckes mit Tumor-induzierte Angiogenese und erhöhte Gefäßpermeabilität ¹² hervorgerufen wird. Interstitielle Fluidströmung hat sich gezeigt, um das Eindringen von Krebszellen ^13-14, vaskulären Fibroblasten und glatten Muskelzellen ¹⁵ erhöht wird. Dieses Eindringen kann auf autologen chemotaktische Gradienten um Zellen in 3-D ¹⁶ erzeugt oder erhöht Matrix-Metalloproteinase (MMP)-Expression ^15, Chemokin Sekretion und Expression Zelladhäsionsmolekül ^17. Jedoch ist der Mechanismus, durch den Zellen zu erfassen Fluidströmung nicht gut verstanden. Zusätzlich zu verändern Tumorzelle Verhalten moduliert interstitiellen Flüssigkeit fließen die Aktivität anderer Zellen in der Tumor-Mikroumgebung. Es ist mit (a) Fahren Differenzierung von Fibroblasten in tumorpromovierenden myofibr verbundenoblasts ^18, (b) Transportieren von Antigenen und anderen löslichen Faktoren in Lymphknoten ^19, und (c) Modulieren lymphatischen Endothelzellen Morphogenese ^20.

Die hier vorgestellte Technik auferlegt interstitiellen Flüssigkeit fließen auf Zellen in vitro und quantifiziert deren Auswirkungen auf Invasion (Abbildung 1). Diese Methode wurde in mehreren Studien veröffentlicht worden, um die Auswirkungen der Strömung auf Stroma und die Invasion von Krebszellen ^{13-15, 17} zu messen. Durch Ändern der Matrix-Zusammensetzung, dem Zelltyp, und Zellkonzentration, kann dieses Verfahren auf andere Krankheiten und physiologische Systeme angewendet werden, um die Auswirkungen der interstitiellen Strömung auf zellulärer Prozesse, wie Invasion, Differenzierung, Proliferation und die Genexpression zu untersuchen.

Protokoll

1. Assay Set-up

1. Auftauen einer kleinen aliquoten (<500 ul) von Matrigel auf Eis bei 4 ° C (etwa 2 Stunden).
2. Bereiten Sie Gel-Rezeptur (siehe Beispiel Volumina in Tabelle unten): 10x PBS (1x im Gesamtvolumen), 1 N Natronlauge (entspricht 0,023 Bände hinzugefügt Kollagen, respektive dem Kollagen den Empfehlungen des Herstellers, soweit erforderlich), geben Sie Matrigel und Kollagen I zu Endkonzentrationen von 1 mg / ml und 1,3 mg / ml (andere Matrix-Formulierungen verwendet werden, je nach Zelltyp und Experiment werden).

Beispiel Gel-Rezeptur

Komponenten	Stoffkonzentration	Endkonzentration	Fügen Volumen
10X PBS	10X	1X	0,090 ml
Steriles Wasser			0,346 ml
1 N NaOH			0,008 ml
Matrigel	9,90 mg / ml	1 mg / ml	0,101 ml
Rattenschwanz Kollagen Typ I	3,66 mg / ml	1,3 mg / ml	0,355 ml

3. Mischen Komponenten des Gels auf Eis in der gleichen Reihenfolge wie oben und inkubieren endgültige Lösung für 1 Stunde bei 4 ° C Nach unserer Erfahrung, eine 1-stündigen Inkubation vor dem Aussähen der Zellen führt zu einer gleichmäßigeren Gelierung des Kollagens. Achten Sie darauf, Matrigel und Kollagen auf Eis halten zu allen Zeiten und an so schnell wie möglich arbeiten, um die Gelierung zu verhindern.
4. Platz 12 mm Durchmesser 8 um Pore Zellkultur-Inserts in eine 12-Well-Platte mit einer sterilisierten Pinzette.
5. Zählen von Zellen und Resuspendieren in serumfreiem Medium bei 5 × 10 ⁶ Zellen / ml (Gesamtvolumen sollte 10% des Gel-Lösung).
6. Geben Sie 100 ul Zell-suspension zu 900 ul Gel-Lösung (Endzellkonzentration ⁵ x 10 5 Zellen / ml) mischen und gründlich durch Pipettieren vorsichtig nach oben und unten.
7. Fügen Sie 150 ul der fertigen Mischung für jeden Einsatz und Transfer zu einem 37 ° C, 5% CO _2-Inkubator für 30 Minuten, bis Gel polymerisiert.
8. Mit Serum-freien Medien,

• Geben Sie 100 ul oben auf dem Gel und 1200 ul unter dem Einsatz für den statischen Zustand. Die Flüssigkeitsstand im Inneren des Einsatzes und außen in der auch etwa gleich sein sollte, was zu einer minimalen Druckdifferenz über dem Gel und ohne interstitielle Strömung.
• Geben Sie 100 ul unter dem Einsatz und 650 ul oben Gel für den Strömungszustand. Seien Sie vorsichtig, um mögliche Luftblasen unterhalb des Einsatzes zu vermeiden, da diese Zellen, die aus der Migration durch die Membran an diesen Standorten zu verhindern. Die Druckdifferenz, die dieses Volumen erzeugt wird, ungefähr 1,3 cm H ₂ O (oder 1 mm Hg).

9. Legen Sie die Platte in einem 37° C, 5% CO _2-Inkubator für 24 Stunden.

2. Zellfärbung und Zählen

1. Fügen Sie 500 ul 1X PBS pro Vertiefung in neue 24-Well-Platte, das wird benutzt, um die Einsätze zu waschen.
2. Entfernen des Mediums restlichen in dem oberen Abschnitt der Strömung Transwells und die Lautstärke festzulegen. Berechnen Sie insgesamt eluierten Volumen durch Subtraktion des verbleibenden Volumens aus dem Gesamtvolumen ursprünglich aufgenommen, 650 ul (dies wird für Durchfluss Berechnungen verwendet werden, siehe unten). Wattestäbchen, um das Gel aus den Einsätzen zu entfernen und um die obere Oberfläche der Membran Wischtuch nicht befallenen Zellen zu entfernen. Legen Sie die Einsätze in den 24-Well-Platte mit 1X PBS für 15 s, um Einsätze zu waschen.
3. PBS entfernen und hinzufügen 500 ul von 4% Paraformaldehyd (PFA) unter jedem Einsatz, Inkubation 30 Minuten bei Raumtemperatur, um die transmigrierten Zellen zu fixieren.
4. Entfernen Sie die PFA und spülen Sie einmal mit 500 ul 1X PBS, um restliches Fixativ entfernen.
5. Fügen Sie 500 ul of 0,5% Triton X-100-Lösung unter den Einsätzen und inkubieren für 10 Minuten bei Raumtemperatur, um die Zellen zu permeabilisieren.
6. Schneiden Sie aus Membranen des Einsatzes mit einer Rasierklinge und Ort in 100 ul 2 pg / ml DAPI in 1X PBS-Lösung, wobei darauf geachtet, um die Unterseite der Membran der Vorderseite nach unten platzieren (transmigrierten Zellen nach unten).
7. Wrap Platte in Alufolie nehmen und auf einem Schüttler bei 150 rpm für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
8. Waschen Sie Membranen in 500 ul 1X PBS auf Schüttler (3 Mal wiederholen für jeweils 10 Minuten), um freie DAPI zu entfernen.
9. Ort Membranen auf Glasplättchen mit transmigrierten Zellen nach oben, fügen Montagelösung und Deckglas.

3. Datenanalyse

1. Count DAPI-gefärbten Zellkernen auf 5 zufällig ausgewählten Standorten jeder Membran (bleiben Sie weg von den Rändern und verwenden Sie einen 10x-oder 20x Objektiv).
2. Berechnen des Durchschnitts-Zellen und erhalten die prozentuale Invasion durch Verwendung der folgenden Formel:
   Invasion Prozent = 100% x (durchschnittliche Zellzahl x Membranfläche) / (Fläche des mikroskopischen Bildes x Anzahl der Zellen seeded)
   Die Invasion Prozent bis zu einem gewissen Kontrollbedingung (in der Regel der statische Zustand) um einen Vergleich zwischen unabhängigen Experimenten ermöglichen normalisiert werden.
3. Berechnen der durchschnittlichen Fließgeschwindigkeit: Die Gesamthöhe eluierte Volumen in der Strömungszustand von der Inkubationszeit (z. B. 24 Stunden).
4. Berechnen Sie die mittlere Fließgeschwindigkeit: Teilen Sie die mittlere Strömungsgeschwindigkeit durch die Querschnittsfläche des Gels / Membran (in diesem Fall 60 mm ^2).

4. Repräsentative Ergebnisse

Um Tumorzellinvasion unter interstitielle Strömung zu messen, führten wir unsere 3-D-Flow Invasion Assay unter Verwendung von MDA-MB-435S metastasierendem Melanom-Zellen. Diese Zellen haben früher gezeigt, dass in Reaktion auf interstitielle Fluidströmung ^13-14 einzudringen. Die Zellen wurden in einer Matrix von 1,3 mg / ml Ratten-tai aus eingebettetenl Sehne Kollagen Typ I und 1 mg / ml Matrigel Basalmembran-Matrix in einer endgültigen Zellkonzentration von 5 x 10 ⁵ Zellen / ml. Zwei verschiedene Bedingungen wurden verglichen: (1) Durchschnitt interstitielle flow = 0,1 &mgr; s ^-1 und (2) statischen Zustand = keine messbare Durchfluss (Abbildung 1).

Nach 24 Stunden wurden die Zellen, die durch die Poren der Membran eingedrungen mit DAPI gefärbt die Zellzählung erleichtern. 2 zeigt ein repräsentatives Bild der befallenen Zellen. Unter Hellfeld, sind nur die Poren der Membran sichtbar. Fluoreszenz-, die DAPI-gefärbten Nuklei wurden zum Zählen von Zellen und die Phalloidin gefärbt F-Aktin-Strukturen wurden verwendet, um die Zellkörper (optional) zu visualisieren. Mit Hilfe eines Student-t-Test unter Annahme gleicher Varianzen haben wir gezeigt, dass interstitielle Flow signifikant erhöht MDA-MB-435S Zellinvasion von 2,3-fache gegenüber der statischen Bedingungen (p = 0,003) (Abbildung 3). Diese corroborates zu ähnlichen Ergebnissen (aber mit unterschiedlichen Matrix-Bedingungen und sind daher Strömungsgeschwindigkeiten) mit dieser Zelllinie ^13-14.

1. Schematische Darstellung der 3-D-interstitiellen Fluidströmung Invasionshemmtest. Bereiten Sie zuerst Gel-Lösung unter Verwendung von geeigneten Konzentrationen und Volumina. Dann fügen Sie Zellen auf Gel-Lösung und Transfer zum Zellkultur-Inserts. Schließlich fügen Sie entsprechende Volumen von Medien auf jede Bedingung und inkubieren. Interstitielle Flüssigkeit fließt durch einen Fluiddruck Kopf getrieben.

2. Transmigrierten MDA-MB-435S-Zellen auf der Membran. A) Bild von der Membran unter Hellfeld;; befallenen Zellen wurden nach unserer interstitiellen Flüssigkeit fließen Invasion Assay und mit DAPI gefärbt und Alexa Fluor 488-Phalloidin zu erleichtern Zählen der befallenen Zellen fixiert B) DAPI staINED Zellkerne (blau); C) Alexa Fluor 488-Phalloidin angefärbt F-Aktin (in grün). Maßstabsbalken repräsentiert 50 um.

Abbildung 3. Erhöhte Invasion von MDA-MB-435S-Zellen unter Strom. Zellinvasion nach 24 Stunden deutlich durch interstitielle flow (p = 0,003) verbessert. Die Ergebnisse sind der Durchschnitt statischen Zustand normalisiert und Werte repräsentieren den Mittelwert ± SEM von 6 Zellkultur-Inserts.

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Diskussion

Hier haben wir eine Methodik zur Quantifizierung der Wirkung der Strömung auf interstitielle Tumorzellinvasion, unter Verwendung von Zellen in einem 3-D-Matrix in einer Zellkultureinsatzes eingebetteten beschrieben. Diese und ähnliche Verfahren sind verwendet worden, um die Wirkung der interstitiellen Strömung auf einer Vielzahl von Zelltypen ^{13-15, 17 studierst.} Unser Ansatz teilweise imitiert die Matrix Mikroumgebung des Tumors mit Kollagen Typ I und Matrigel, die Proteine ​​in der Basalmembran von E...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Collagen (Rattenschwanz)	BD	354236	Halten sterilen
Millicell Zellkultureinsatzes	Millipore	PI8P01250	8 mu m Porendurchmesser, Polycarbonat-Membran
Matrigel	BD	354234	Halten sterilen
PBS	Sigma Aldrich	100M-8202	10x für die Vorbereitung Gel-Lösung, 1x für Waschschritte
Natriumhydroxid, 1,0 N-Lösung	Sigma Aldrich	S2770	Halten sterilen
DMEM 1X	CellGro	10 bis 013-CV	Halten sterilen
Fötalem Rinderserum	Atlanta Biologicals	511150	Halten sterilen
Penicillin Streptomycin	CellGro	30002CI	Halten sterilen
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-500 ml	0,5% in PBS
Paraformaldehyd	Fisher Scientific	04042-500	4% in PBS
Deionisiertes Wasser			Halten sterilen
4 ',6-diaminido-2-phenylindol (DAPI)	MP Biomedicals	0215757401	1 mg / ml Stammlösung
Montage-Lösung	Thermo Scientific	TA-030-FM
Trypsin-EDTA	CellGro	25-052-CI	Halten sterilen