A Galvanotaxis Assay für die Analyse von neuralen Vorläuferzellen Cell Migration Kinetics in einem von außen angelegten Direct Current Electric Field

Zusammenfassung

In diesem Protokoll zeigen wir, wie Sie benutzerdefinierte Kammern, die die Anwendung eines Gleichstrom elektrisches Feld an Zeitraffer-Aufnahmen von erwachsenen Gehirn abgeleitete neurale Vorläuferzellen Translokation während Galvanotaxis ermöglichen ermöglichen konstruieren.

Zusammenfassung

Die Entdeckung von neuralen Stamm-und Vorläuferzellen (kollektiv als neuralen Vorläuferzellen) (NPC) im erwachsenen Gehirn von Säugetieren ist an einem Körper der Forschung auf die Nutzung der multipotenten und proliferativen Eigenschaften dieser Zellen für die Entwicklung von Strategien neuroregenerative gerichtet geführt. Ein entscheidender Schritt für den Erfolg einer solchen Strategie ist die Mobilisierung von NSC Richtung einer Läsionsstelle nach Transplantation oder exogene, um die Reaktion der endogenen Vorstufen, die in der periventrikulären Region des ZNS gefunden werden verbessern. Dementsprechend ist es wichtig, die Mechanismen, die zu fördern leiten, und verbessern NPC Migration verstehen. Unsere Arbeit konzentriert sich auf die Nutzung von Gleichstrom elektrische Felder (dcEFs) zu fördern und zu direkten NPC Migration - ein Phänomen, das als Galvanotaxis bekannt. Endogenen physiologischen elektrischen Feldern funktionieren als kritische Hinweise für die Zellwanderung während der normalen Entwicklung und Wundheilung. Pharmakologische Unterbrechung dertrans-Neuralrohr Potenzial Axolotl Embryonen verursacht schweren Entwicklungsstörungen Fehlbildungen ^1. Im Rahmen der Wundheilung, wird die Rate der Reparatur der verwundeten Hornhaut direkt mit der Größe der Wunde epithelialen Potential, das nach der Verletzung auftritt korreliert, als durch pharmakologische Verstärkung oder Störung dieses dcEF ^2-3 gezeigt. Wir haben gezeigt, dass adulte subependymale NPCs rasche und gerichteten Migration kathodenseitigen in vitro durchlaufen, wenn sie einem von außen angelegten dcEF ausgesetzt. In diesem Protokoll beschreiben wir unser Labor die Techniken für die Schaffung eines einfachen und effektiven Galvanotaxis Assay für hochauflösende, langfristige Beobachtung der Regie Zellkörper Translokation (Migration) auf einer Ebene einzelner Zellen. Dieser Assay wäre geeignet für die Untersuchung der Mechanismen, dcEF Transduktion in zelluläre Motilität regulieren durch die Verwendung von transgenen oder Knockout-Mäuse, short interfering RNA oder spezifischen Rezeptor Agonisten / Antagonisten.

Protokoll

Alle Verfahren, die Behandlung der Tiere wurden von der University of Toronto Animal Care Committee in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts (Protokoll Nr. 20.009.387) zugelassen. Die folgenden Methoden sollten unter Verwendung steriler Instrumente und Techniken in einer Sterilbank, soweit zutreffend.

Im Protokoll-Text bezieht sich der Ausdruck "EFH-SFM" zu serumfreiem Medium mit epidermalen Wachstumsfaktor, basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor und Heparin ergänzt. EFH-SFM wird verwendet, wenn die Untersuchung der Galvanotaxis undifferenzierter NPCs, weil diese Mitogene NPCs in ihrem undifferenzierten Zustand ⁴ zu halten. Bei der Untersuchung der Galvanotaxis NPC-induzierte zu reifen Zelltypen differenzieren, "FBS-SFM" bezieht sich auf serumfreiem Medium mit 1% fötalem Rinderserum ergänzt. FBS fördert die Differenzierung von NSCs in reife neuronale Phänotypen ^5.

Ein. Isolation und Kultur von neuralen Vorläuferzellen (Nichtdargestellt im Video)

1. Betäuben ein CD1-Maus (6-8 Wochen alt) mit Isofluran und Opfer über Genickbruch.
2. Begießen den Kopf in 70% Ethanol und enthaupten das Tier mit scharfen Dissektion Schere.
3. Halten Sie den Kopf mit chirurgischen Pinzette die Haut auf der dorsalen Oberfläche, um den Schädel freizulegen.
4. Mit einem Skalpell und nein. 11 Blättern, erzielt das Schädels an der Stirnhöhle entlang der mediolateralen Achse und auch entlang der Sagittalnaht im rostrokaudalen Richtung.
5. Schälen Sie die Scheitelbeinen vom Kopf ohne. 7 gebogene Pinzette, dabei nicht zu durchbohren das Hirngewebe.
6. Führen Sie einen dünnen Spatel unterhalb des Gehirns ab unter dem Kleinhirn und Weiterentwicklung in Richtung der Riechkolben. Halten Sie den Schädel an Ort und Stelle mit einer Pinzette, ziehen das Gehirn aus dem Schädel und sofort legen Sie sie in eiskaltem künstlichen Liquor (siehe Rezepte unten).
7. Unter einem Dissektionsmikroskop, mit sterilenDissektion Schere und Pinzette geschnitten das Gehirn in der Hälfte entlang der Mittellinie. Drehen Sie jeden Hemisphäre, so dass die mediale (cut) Oberfläche nach oben zeigt.
8. Wählen Sie eine Halbkugel, und mit der medialen Oberfläche nach oben, suchen Sie die Splenium des Corpus callosum (hinteren Bereich des Corpus callosum).
9. Einen Einschnitt von der Oberfläche der Hirnrinde der Splenium des Balkens entlang der dorsoventralen Achse.
10. Peel die eingeschnittene Kortex zu der Riechkolben, die medialen und lateralen Wände des lateralen Ventrikel freizulegen.
11. Rotieren die Halbkugel so dass der dorsale Oberfläche nach oben zeigt, und mit gekrümmten Mikroschere zum Ausschneiden und sammeln die freiliegenden medialen und lateralen Wänden, die den Bereich, in dem periventrikulären NPCs aufzuhalten ⁶ enthalten.
12. Wiederholen Sie die Schritte 1,8-1,11 für die andere Hemisphäre.
13. Pipettieren der isolierten Gewebe in 7 ml Trypsin-Lösung (siehe Rezept unten) in einem 15 ccm Rohr, und legen Sie das Rohr auf einer Wippe in einem 37 ° CInkubator für 25 min.
14. Zentrifugieren bei 1.500 rpm für 5 min, den Überstand aspirieren und resuspendieren das Gewebe in 2 ml Trypsin-Inhibitor-Lösung (siehe Rezept unten).
15. Gently verreiben das Gewebe mit einer kleinen Bohrung Pasteurpipette 30-50 mal vorsichtig, um Luftblasen zu vermeiden.
16. Zentrifugieren bei 1.500 rpm für 5 min, den Überstand aspirieren und resuspendieren in 1-2 ml SFM (Rezept siehe unten) durch Verreiben das Pellet 3-5 mal.
17. Zentrifugieren bei 1.500 rpm für 3 min, saugen Sie den Überstand und resuspendieren in 1 ml SFM + EFH.
18. Zählen leben Zelldichte mit einem Hämozytometer und Platte die Zellen in einer T25-Kulturkolben in einer Dichte von 10 Zellen pro ul in SFM + EFH.
19. Lassen Sie die Kultur für 7 Tage ungestört frei schwebenden primäre Neurosphären von NPCs zusammen ergeben wachsen.

2. Galvanotaxis Chamber Vorbereitung

1. Platz 3 quadratischen Glas-Nr. 1 Deckgläschen (22 x 22 x 0,17 mm) ina Flasche 6N Salzsäure über Nacht.
2. Am nächsten Tag, mit einem Diamant-Spitze Glasschneider bis 6 rechteckigen Streifen (22 x 5 x 0,17 mm) aus Glas vom Quadrat nicht geschnitten. 1 Deckgläser.
3. Übertragen Sie die acid-washed Platz rutscht und rechteckige rutscht in eine laminare Strömung Kapuze. Waschen Sie die rechteckige und quadratische Streifen zunächst mit 70% Ethanol, dann mit Gewebekultur-grade autoklavierten Wasser, und lassen Sie sie auf einem Kim trocknen Wischen (für zusätzliche Sterilität, kann das Glas an der Luft trocknen erlaubt sein).
4. Anwenden Vakuumfett an dem Umfang der einen Fläche der quadratischen Glasobjektträgern und verschließt diese an der Basis von 60 mm Petrischalen aus Kunststoff.
5. Anwenden Vakuumfett entlang der langen Achse der einen Oberfläche der rechteckigen Glasstreifen, und schließt diesen an gegenüberliegenden Kanten der quadratischen Glasobjektträgern (derart, dass sie parallel zueinander sind), um eine zentrale Mulde zu schaffen.
6. UV-Sterilisation der Kammern für mindestens 15 min in der Sterilbank.
7. Pipette 250-300 ul von Poly-L-Lysine auf den zentralen Mulde der Kammern hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 2 Stunden.
8. Etwa 15 Minuten vor dem Ende der Inkubationszeit, bereiten die Matrigel-Lösung (siehe Rezept unten).
9. Saugen Sie die Poly-L-Lysin, waschen Sie die zentralen Tröge mit 1 ml autoklavierten Wasser, und Pipette 250-300 &mgr; l Matrigel Lösung auf den zentralen Tälern.
10. Inkubiere die Kammern bei 37 ° C für 1 Stunde.
11. Saugen Sie die Matrigel-Lösung und vorsichtig waschen die zentralen Tröge mit 1-2 ml SFM.
12. Je 100 ul der EFH-SFM oder FBS-SFM auf den zentralen Tälern und übertragen Sie die Galvanotaxis Kammern auf der Bühne eines Zählen Mikroskop.
13. Pipette 3-4 ml des Neurosphäre enthaltenden Kultur in eine 60 mm Petrischale und übertragen die Petrischale auf der Bühne des Mikroskops gezählt.
14. Bei einer Betrachtung Ziel 5x, verwenden Sie eine P10 Pipette 5-8 gesamten Neurosphären (bis zu vier gleichzeitig) auf den zentralen Mulde jedes Galvanotaxis übertragenKammer ohne distanziert sie, und sorgfältig verteilt die Neurosphären rund um den zentralen Mulde ohne Unterbrechung des Matrigel Substrat.
15. Fügen Sie eine weitere 150-200 ul EFH-SFM oder FBS-SFM auf den zentralen Tälern.
16. Übertragen der Galvanotaxis Kammern in einem 37 ° C, 5% CO _2, 100% befeuchteten Inkubator für 17 bis 20 h (wenn Analysieren undifferenzierten NPC), damit die Neurospheres, um zu der Matrigel Substrat haften und dissoziieren in einzelne Zellen, wie in Abbildung 1 dargestellt . Wenn Analysieren differenzierten NSCs sollte die Inkubationszeit bis 69-72 h verlängert, um die Differenzierung der Zellen zu ermöglichen.

3. Live Cell Time-Lapse Imaging

1. Lassen Sie das Live Cell Imaging System bei 37 ° C äquilibrieren, 5% CO ₂ für mindestens 30 min vor Beginn der Zeitraffer-Aufnahme.
2. Schneiden Sie zwei 12 cm lange Stücke von 1 mm Durchmesser Silber Draht, Spule sie von einem Ende, und legen Sie sie in Clorox bLeach für 20 min zu bilden Ag / AgCl Elektroden.
3. Übertragen Sie die Galvanotaxis Kammern auf der Bühne eines Zählen Mikroskop und auswählen, welche Kammer wird für Live-Cell-Imaging Migration Analyse auf Grundlage der folgenden Kriterien verwendet werden: i) die Neurosphären sollte fast vollständig dissoziiert in einzelne Zellen und ii) die Zellen besitzen sollte Runde Morphologien mit wenig bis keine Prozesse sich von den Zellkörper.
4. Übertragen des ausgewählten Galvanotaxis Kammer in einer Sterilbank, zusammen mit einem getrennten quadratischen Nr. 1 Deckglas und Vakuum Fett.
5. Waschen der Deckel erste rutschen mit 70% igem Ethanol, dann mit autoklaviertem Wasser und Anwendung eines Streifens aus Vakuumfett an zwei parallelen Kanten des Deckglases.
6. Absaugen Kulturmedien von der zentralen Rinne der Kammer, dann schnell platzieren das Deckglas (Fett-Seite nach unten) auf die Kammer derart, dass das Fett Streifen auf den beiden parallelen rechteckigen Glasstreifen, effektiv eine Dachan die Kammer.
7. Je 100 ml frisches EFH-SFM oder FBS-SFM in den zentralen Mulde durch Kapillarwirkung.
8. Verwenden Vakuumfett um Grenzen für Pools von Kulturmedien auf jedem Ende der zentralen Rinne zu schaffen, wie in 2 gezeigt.
9. Schneiden Sie zwei 15 cm Stücke von PVC-Schlauch, und verwenden Sie einen 10-ml-Spritze mit einer 18-Gauge-Nadel sorgfältig injizieren Agarose-Lösung in den Schlauch, wodurch keine Blasen bilden in den Rohren, und lassen Sie das Gel für 5 min zu festigen.
10. Übertragen der Galvanotaxis Kammer zu der lebenden Zellen System, zusammen mit dem Agarosegel Rohren, Ag / AgCl-Elektroden, und ein Paar von leeren 60 mm Petrischalen, die als Reservoire Kulturmedien verwendet werden und wird die Ag / AgCl-Elektroden enthalten. Lassen Sie die Galvanotaxis Kammer innerhalb des 37 ruhen ° C, 5% CO _2-Umgebung für 20-30 min.
11. Während dieser Zeit bereiten die Deckel der 2 leere Petrischalen und den Deckel der Petrischale des Galvanotaxis Kammer die durch Bohren von Löchernin sie mit einem Dremel oder ein ähnliches Werkzeug, wie in Abbildung 3 gezeigt.
12. Pipette 1-1,5 ml EFH-SFM oder FBS-SFM auf beiden Seiten der zentralen Rinne und 7-8 ml SFM in jedes leere Petrischale. Legen Sie eine Petrischale auf jeder Seite des Galvanotaxis Kammer der zentralen Mulde und Ort ein Ag / AgCl-Elektrode in jede Schale. Die Lücke zwischen der Kammer und den Galvanotaxis Petrischalen auf elektrische Kontinuität mit den Agarosegel Brücken zu schaffen, wie in Abbildung 4 dargestellt.
13. Schließen Sie die Ag / AgCl-Elektroden mit einem externen Netzteil, mit einem Amperemeter in Reihe, um elektrischen Strom zu messen, und schalten Sie die Stromversorgung. Mit einem Voltmeter, um die Stärke des elektrischen Feldes direkt auf der zentralen Mulde zu messen, und den Ausgangspegel der Stromversorgung bis die gewünschte elektrische Feldstärke erreicht ist (die Assays in diesem Labor durchgeführt nutzen eine dcEF Stärke von 250 mV / mm mit elektrischer Strom zwischen 1 und 1,5 mA).
14. Initiate der Zeitraffer-Modul auf dem Live Cell Imaging System und ermöglichen das Experiment, um die gewünschte Menge an Zeit laufen. Nach Abschluss des Tests, fixieren die Zellen in 4% Paraformaldehyd für Standard Immunfärbung Analyse.

Ergebnisse

Kinematische Analyse zeigt, daß in Gegenwart von 250 mV / mm dcEF, undifferenzierte NPCs sehr gerichtet und rasche Galvanotaxis Richtung der Kathode (5A, Kinofilm 1) aufweisen. In Abwesenheit eines dcEF wird zufällige Bewegung der Zellen beobachtet (5B, Film 2). Zu dieser Feldstärke> 98% von undifferenzierten NSCs für die gesamte 6-8 h, für die sie abgebildet migrieren, und da tote Zellen nicht migrieren dies legt nahe, dass sie lebensfähig bleiben während dieses Zeitraums in ...

Diskussion

Dieses Protokoll wurde von den etablierten Methoden der früheren Studien ^7-9 angepasst. Galvanotactic Kammern kann unter Verwendung einer Vielzahl von verschiedenen Techniken, einschließlich der Errichtung eines separaten Glas gut für Einschluss Zellaussaat oder mit Hilfe von CO _{2-Laser-Ablation} zur Mikrofabrikation des zentralen Rinne ^10,11 werden. Einige Techniken können mehr mühsam oder kostspieliger als andere. Wir haben eine einfache und kostengünstige Konstruktion eines Assay...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bezeichnung des Gegenstands	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
			Neuronale Vorläuferzellen Isolation
2 M NaCl	Sigma	S5886	11,688 g in 100 ml dH 2 O gelöst
1M KCl	Sigma	P5405	7,456 g in 100 ml dH 2 O gelöst
1M MgCl 2	Sigma	M2393	20,33 g in 100 ml dH 2 O gelöst
155 mM NaHCO 3	Sigma	S5761	1,302 g in 100 ml dH 2 O gelöst
0,5 M Glucose	Sigma	G6152	9,01 g gelöst in 100ml dH 2 O
108 mM CaCl 2	Sigma	C7902	1,59 g in 100 ml dH 2 O gelöst
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070
Rinderpankreas Trypsin	Sigma	T1005
Sheep Hoden Hyaluronidase	Sigma	H6254
Kynurensäure	Sigma	K3375
Ovomucoid Trypsininhibitor	Worthington	LS003086
DMEM	Invitrogen	12100046
F12	Invitrogen	21700075
30% Glucose	Sigma	G6152
7,5% NaHCO 3	Sigma	S5761
1M HEPES	Sigma	H3375	23,83 g in 100 ml dH 2 O gelöst
L-Glutamin	Gibco	25030
EGF	Invitrogen	PMG8041	Rekonstituieren in 1 ml Hormon-Mix und Aliquote in 20 ul Einheiten.
FGF	Invitrogen	PHG0226	Rekonstituieren in 0,5 ml Hormon-Mix und Aliquote in 20 ul Einheiten.
Heparin	Sigma	H3149
Apo-Transferrin	R & D Systems	3188-AT	0,1 g in 4 ml dH 2 0 gelöst
Putrescin	Sigma	P7505	Auflösen 9,61 mg in Apo-Transferrin solution
Insulin	Sigma	I5500	25 mg in 0,5 ml 0,1 N HCl und fügen Sie 3,5 ml dH 2 0
Selen	Sigma	S9133
Progesteron	Sigma	P6149
Standard Dissection Werkzeuge	Fine Science Tools
Dissektionsmikroskop	Zeiss	Stemi 2000
			Galvanotaxis Chamber Vorbereitung
Platz Glasabdeckung Dias	VWR	16004
6N Salzsäure	VWR	BDH3204-1
Hochvakuumfett	Dow Corning
60 mm Petrischalen	Fisher Scientific	0875713A
Poly-L-Lysin	Sigma	P4707
Matrigel	BD Biosciences	354234	Tauwetter und Aliquot in 150 ul-Einheiten
FBS	Invitrogen	10082139	Nur verwenden, wenn induzieren NPC Differenzierung, ansonsten SFM + EFH Kulturmedien wie oben angegeben
Zählen Mikroskops	Olymp	CKX41
			Live Cell Time-Lapse Imaging
Silberdraht	Alfa Aesar	11434
UltraPure Agarose	Invitrogen	15510-027
Hitze Inactivated FBS	Sigma	16140071
PVC-Schlauch	Fisher Scientific	80000006	3/32 "ID x 5/32" OD
Bleichmittel	Clorox
10-ml-Spritze	BD	309604
18-Gauge-Nadel	BD	305195
Dremel Bohrmaschine	Dremel	Modell 750
Inverses Mikroskop mit befeuchteten, bebrütete Kammer ausgestattet	Zeiss	Axiovert-200M
			Rezepte Artikel Volumen 2 M NaCl 6,2 ml 1M KCl 0,5 ml 1M MgCl 2 0,32 ml 155mm NaHCO 3 16,9 ml 1M Glucose 1 ml 108 mM CaCl 2 0,09256 ml Penicillin-Streptomycin 1 ml Wasser autoklaviert 74 ml Künstliche Zerebrospinalflüssigkeit Artikel Volumen oder Masse Künstliche Zerebrospinalflüssigkeit 30 ml Rinderpankreas Trypsin 40 mg Sheep Hoden Hyaluronidase 22,8 mg Kynurensäure 5 mg Trypsin-Lösung Artikel Volumen oder Masse SFM 15 ml Ovomucoid Trypsininhibitor 10 mg Trypsininhibitorlösung Artikel Volumen Wasser autoklaviert 37 ml 10X DMEM/F12 10 ml 30% Glucose 2 ml 7,5% NaHCO 3 1,5 ml 1M HEPES 0,5 ml Transferrin, Putrescin-Lösung 4 ml 25 mg Insulin-Lösung 4 ml Selen 100 & mu; L Progesteron 100 ul Hormone Mix (100 ml insgesamt bei -20 ° C) Artikel Volumen Wasser autoklaviert 37,5 ml 10X DMEM/F12 (3:1) 5 ml 30% Glucose 1 ml 7,5% NaHCO 3 0,75 ml 1M HEPES 0,25 ml Hormone mix 5 ml L-Glutamin 0,5 ml Penicillin-Streptomycin 0,5 ml Serum Free Media EFH-SFM: add 10 ul EGF, 10 ul FGF und 3,66 ul Heparin FBS-SFM: 0,5 ml FBS
Artikel	Volumen
Matrigel	150 ul
SFM	3,6 ml

Artikel	Volumen oder Masse
UltraPure Agarose	300 mg in 10 ml ddH 2 0
SFM Hitzeinaktiviertem FBS	8 ml 2 ml