Isolierung von Kardiomyozyten Kerne von Post-mortem Gewebe

Zusammenfassung

Cardiac Kerne über Dichte Sedimentation isoliert und mit Antikörpern gegen immunmarkiert pericentriolar Material 1 (PCM-1) zu identifizieren und zu sortieren Kardiomyozyten Kerne durch Durchflusszytometrie.

Zusammenfassung

Identifizierung von Kardiomyozyten Kerne hat in Gewebeschnitten Herausforderung gewesen, da die meisten Strategien nur auf zytoplasmatische Markerproteine ^​​1 verlassen. Seltene Ereignisse in Herzmuskelzellen wie Proliferation und Apoptose erfordern eine genaue Identifizierung von Kardiomyozyten-Kerne auf die Zellerneuerung in der Homöostase und bei pathologischen Zuständen ² zu analysieren. Hier stellen wir eine Methode, um Kardiomyozyten Kerne aus post mortem Gewebe zu isolieren durch Sedimentation und Dichte Immunomarkierung mit Antikörpern gegen pericentriolar Material 1 (PCM-1) und anschließende Durchflusszytometrie-Sortierung. Diese Strategie ermöglicht einen hohen Durchsatz-Analyse und Isolation mit dem Vorteil bei der Arbeit ebenso gut auf frischen und gefrorenen Gewebe Archivalien. Dies macht es möglich, das Material bereits in Biobanken gesammelten studieren. Diese Technik ist und die Messung in einer Vielzahl von Arten und mehrfach Downstream-Anwendungen, wie ^{Kohlenstoff-14-3,} Zell-cycle-Analyse ^4, Visualisierung von Thymidin-Analoga (zB BrdU und IdU) ^4, Transkriptom-und epigenetische Analyse.

Protokoll

1. Die Isolierung des Herz-Kerne

1. Mantel Ultrazentrifuge Rohre (Beckman Zentrifugenröhrchen # 363.664) mit 10 ml 1% BSA / PBS Beschichtungslösung. Verschließen Sie die Röhrchen und lassen Sie sie für 30 min in einem Rohr Rotator drehen. Entfernen Sie die Beschichtungslösung und lassen Sie die Zentrifugenröhrchen Luft trocknen lassen (eine Tube pro Maus Herz für die Analyse der einzelnen Mäuseherzen, abwechselnd bis zu 5 Mäuseherzen oder 1 g Herzgewebe von einer anderen Spezies erforderlich ist (z. B. Mensch) können verarbeitet werden In einem Röhrchen).
2. Alle folgenden Schritte sollten auf Eis durchgeführt werden. Präparieren Sie die linke Herzkammer aus frischen oder gefrorenen Snap-Maus-Herz mit einem Skalpell. Man beachte, daß dieses Protokoll für Mäuseherz optimiert, sondern auch von Ratten oder menschlichen Herzens angepasst werden. Alternativ können bis zu 1 g des Herzgewebes von einer anderen Spezies.
3. Schneiden Sie die Probe in kleinen Kabinen mit einem Skalpell.
4. Übertragen der Gewebestücke in einen 50 ml-Falcon-Röhrchen mit 15 ml Lyse-Puffer gefüllt.
5. Homogenisieren derHerzgewebe mit einem T-25 Ultra-Turrax-Homogenisator Sonde (IKA) bei 24.000 UpM für 10 sek.
6. Verdünnen des Homogenats mit einem gleichen Volumen Lysepuffer bis 30 ml.
7. Verwenden Sie ein Glas Douncer (40 ml) zur weiteren Homogenisierung des Gewebes und die Kerne frei. Führen Sie acht Schläge mit einem großen Abstand Pistill.
8. Führen Sie das rohe Kerne durch ein 100 um und 70 um Nylon-Mesh Zellsieb (BD Biosciences), fortlaufend zu isolieren.
9. Anzentrifugieren das rohe Kerne in einer gekühlten Zentrifuge (4 ° C) bei 700 × g für 10 min isoliert.
10. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig durch Umdrehen der Rohre und wischen Sie das Innere des Rohres mit einem Papiertuch. Achten Sie darauf, die Kerne Pellet stören.
11. Man löst das rohe Kerne in 5 ml Saccharose-Puffer zu isolieren durch Pipettieren der Lösung mehrmals auf und ab. Fügen Sie eine weitere 25 ml Saccharose-Puffer auf die gelöste Pellet.
12. 10 ml frisch zubereiteten Saccharose-Puffer auf die beschichtete Ultrazentrifuge Rohr (siehe Schritt 1.1).
13. Sorgfältig überlagern den zusätzlichen 10 ml Saccharose-Puffer mit dem resuspendierten Pellet Kerne in Saccharose-Puffer von 1,9 Schritt aufgelöst.
14. Gleichen Sie die Zentrifugenröhrchen, bevor Sie sie in eine JS13.1 frei schwingenden Rotor und platzieren Sie den Rotor in eine High-Speed-Zentrifuge (Beckman Avanti S-25).
15. Drehen der Kerne Probe bei 13.000 × g bei 4 ° C für 60 min.
16. Wenn die Spin abgeschlossen ist, entfernen die Röhrchen vorsichtig von dem Rotor und der Überstand verworfen durch Invertieren der Rohre und Abwischen der restlichen Ablagerungen aus dem Inneren der Rohre mit einem Papiertuch.
17. Lösen Sie die Kerne Pellet in 1 ml Kerne Pufferspeicher (NSB Plus-Puffer). Hinweis: NSB plus enthält 1,5 mM Spermin als DNA-Stabilisator.
18. Fahren Sie mit Schritt 2.1, Immunfärbung von Kardiomyozyten Kernen.

2. Immunfärbung für die Durchflusszytometrie

1. Die negativen Kontrollen für Immunfärbung. Man entnimmt einen aliquoten von 20 ul aus den Kernen Probe und eineDD 980 ul von NSB und Puffer.
2. In Anti-pericentriolar Material 1-Antikörper (Kaninchen-Anti-PCM-1, Atlas Antikörper) zu den Kernen Probe in einer Verdünnung von 1:500 bis Immunmarkierung Kardiomyozyten Kernen. In den Isotyp-Antikörper in der gleichen Verdünnung des Anti-PCM-1-Antikörper mit der Negativkontrolle, in Schritt 2.1 hergestellt.
3. Inkubieren negativen Kontrolle und Probe-Röhrchen bei 4 ° C über Nacht.
4. Waschen Sie Negativ-Kontrolle und Probe mindestens einmal mit NSB Plus-Puffer (Spin-Down Rohre in einer gekühlten Zentrifuge (4 ° C) bei 700 xg für 10 min. Überstand verwerfen und lösen sich die Kerne Pellet in 1 ml NSB Plus-Puffer).
5. In Anti-Kaninchen-fluoreszierenden sekundären Antikörper (FITC oder APC) zu negativen Kontrolle und Probenröhrchen in einer Verdünnung von 1:1000.
6. Inkubieren negativen Kontrolle und Probe-Röhrchen bei 4 ° C für 1 h.
7. Waschen Sie Negativ-Kontrolle und Probe mindestens einmal mit NSB Plus-Puffer (Spin-Down Rohre in einer gekühlten Zentrifuge (4 ° C) bei 700 xg für 10 min. Überstand verwerfen und lösen sich die Kerne Pellet in 1 ml NSB Plus-Puffer).
8. Fahren Sie mit der durchflusszytometrischen Analyse und Sortierung.

3. Durchflusszytometrie

1. Coat Kerne Sammlung Röhrchen (Falcon 15 ml) mit 1% BSA / PBS-Lösung, bevor Sie die Durchflusszytometrie Sortierung wie in Schritt 1.1 beschrieben starten.
2. Filtern Sie die Probe und die negative Kontrolle durch einen 30 um Zellsieb und laden Sie zuerst die negative Kontrolle der Durchflusszytometer (BD Zufluss). Definieren Sie die erste und zweite Tor zu Kernen und Singuletts (Einzel-Kerne) zu definieren, basierend auf Vorwärtsstreuung (FSC), Vorwärtsstreuung Impulsbreite (FS Pulsbreite) und seitliche Streulicht (SSC) (Abb. 2a und b). Hinzufügen eines DNA-Färbung (DRAQ5 (1:500)) zu der Probe kann helfen, die Kerne Bevölkerung zunächst zu identifizieren.
3. Laden der Probe und immunmarkierten definieren das dritte Tor zu Kardiomyozyten Kerne (PCM-1-positve) aus nicht-Kardiomyozyten Kerne (PCM-1-negativen) zu isolieren. Starten Sie die Sortierung(Abb. 2c und d).

Optional: Um die Kern-DNA-Gehalt (Ploidie) zu analysieren und Zellzyklus-Analyse durchzuführen fügen Sie eine entsprechende DNA-Färbung der Kerne (zB Hoechst 33342 oder DRAQ5) (Abb. 2e).

4. Nach der Durchflusszytometrie Sortierung, legen Sie die Kerne auf Eis und neu analysieren, um die Sortierung Reinheit (Abb. 3a und b) zu bestimmen.
5. Drehen Sie den sortierten Kerne in den Sammelröhrchen bei 1500 xg in einer Kühlzentrifuge für 15 min.
6. Man löst die Kerne Pellets in einer Pufferlösung mit dem Downstream-Anwendungen.

4. Repräsentative Ergebnisse

Kerne Morphologie und Integrität durch DNA Flecken beurteilt werden und visualisiert durch Mikroskopie (Abb. 1). Erfolgreiche PCM-1 Kennzeichnung kann durch Epifluoreszenzmikroskopie und mittels Durchflusszytometrie (Abb. 1 und Abb. 2c und d) beurteilt werden. PCM-1-Positive und negative Populationen sollten gut voneinander getrennt werden (Abb. 2c und d). In murinen linken Ventrikel ungefähr 30% aller Kerne Kerne sein sollte Kardiomyozyten (2d). Sortieren Reinheit kann durch neue Analyse der sortierten Kerne (Abb. 3a und b) beurteilt werden. Beide Kerne Bevölkerung sollte eine Sortierung Reinheitsgrad von mehr als 95%.

Abbildung 1. PCM-1 identifiziert Kardiomyozyten Kerne. Cardiac Kerne (a) mit Antikörpern gegen PCM-1 (b) und Nkx2.5 (c) in einer erwachsenen Maus Herzen gefärbt werden. (D) PCM-1-markierte Kerne werden von Kardiomyozyten Zytoplasma (Myosin heavy chain (MHC)) umgeben ist und zum Ausdruck des Transkriptionsfaktors Nkx2.5 und dokumentiert die genaue Identifizierung von Kardiomyozyten Kerne von PCM-1-Färbung (Maßstab 20 pm und 10 um (d, Einschub)). (E) Cardiac Kerne Isolate visualisiert mit dem DNA-Farbstoff DRAQ5. (F und g) CardiomyocYTE Kerne sind mit Antikörpern gegen PCM-1 (Maßstab 10 um) beschriftet. Beachte, dass die epinuclear Färbungsmuster von PCM-1 in Myozyten Kerne im Gewebe aufweist und in isolierten Kernen (Pfeile).

Abbildung 2. Durchflusszytometrische Sortierung von Kardiomyozyten Kernen. (A) Cardiac Kerne werden durch Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitwärts-Streulicht (SSC) identifiziert. (B) ein zweites Tor identifiziert einzelne Kerne von FSC und FS Impulsbreite ^5. (C, d) Fluoreszenz-Gating ermöglicht die Trennung von Kardiomyozyten Kerne (PCM-1-positiv) und nicht-Kardiomyozyten (PCM-1-negativen) Kerne von Herzgewebe. (E) Maus Kardiomyozyten meist (> 80%) diploid (2n), ist nur eine kleine Teilmenge tetraploiden (4n) ^6. Hinweis enthalten menschlichen Kardiomyozyten eine höhere Frequenz von Polyploidie Kerne (> 2n) ^7,8.

Abbildung 3. Reinheit Analyse der sortierten Kardiomyozyten und nicht-Kardiomyozyten Kerne. Re-Analyse der sortierten Nicht-Kardiomyozyten (a) und Kardiomyozyten Kerne (b). Beide Populationen zeigen eine Sortierung Reinheitsgrad von mehr als 99%.

Diskussion

Genaue Identifizierung der Kardiomyozyten Kerne ist entscheidend für die Analyse der regenerativen Vorgänge im Myokard ^2,3. Herkömmliche Techniken zu Kardiomyozyten aus frischem Gewebe zu isolieren sind hauptsächlich auf enzymatischen Abbau von Proteinen der extrazellulären Matrix und die anschließende Reinigung in der interstitiellen Zellen durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit basiert. Die weitere Reinigung des lebenden Kardiomyozyten aus embryonalen Stammzellen (ESC) Immunmarkierung mit ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Lysispuffer
Name des Reagenzes
0,32 M Saccharose
10 mM Tris-HCl (pH = 8)
5 mM CaCl 2
5 mM Magnesiumacetat
2,0 mM EDTA
0,5 mM EGTA
1 mM DTT

2. Saccharose-Puffer

Name des Reagenzes

2,1 M Saccharose

10 mM Tris-HCl (pH = 8)

5 mM Magnesiumacetat

1 mM DTT

3. Kerne Speicherpuffer (NSB plus)

Name des Reagenzes

0,44 M Saccharose

10 mM Tris-HCl (pH = 7,2)

70 mM KCl

10 mM MgCl 2

1,5 mM Spermin

Chemikalien und Geräte	Firma
Kaninchen-IgG-Isotyp-ChIP Grade, # ab37415	Abcam
Kaninchen anti-PCM-1-Antikörper, # HPA023374	Atlas Antibodies
Donkey sek. Antikörper, Anti-Kaninchen Alexa 488 Fluor, # A-21.206 oder gleichwertige sek. Fluoreszenz-Antikörper	Life Technologies
DRAQ5	Biostatus
Zelle Siebe 30 um, 70 um und 100 um	BD Biosciences
Glass Douncer (40 ml) undPistill "L"	VWR (Wheaton Industries Inc.)
T-25 Ultra-Turrax-Homogenisator	IKA Deutschland
Dispergierwerkzeug S25 N-18 G	IKA Deutschland
Beckman Avanti Zentrifuge	Beckman Coulter
Falcon-Tubes 15 ml und 50 ml	VWR
Beckman Zentrifugenröhrchen # 363664	Beckman Coulter
JS13.1 frei schwingenden Rotor	Beckman Coulter
Influx Zytometer	Beckman Coulter
Tube Rotator	VWR