High-throughput Screening niedermolekularer Modulatoren von Inward Gleichrichter-Kaliumkanäle

Zusammenfassung

Verfahren zum Entwickeln und Validieren eines quantitativen Fluoreszenz-Assay zur Messung der Aktivität von Kalium Einwärtsgleichrichter (KIR) Kanäle für das Hochdurchsatz-Screening Verbindung wird vorgestellt.

Zusammenfassung

Bestimmte Mitglieder der Einwärtsgleichrichter Kalium (Kir) Kanal Familie drug targets für eine Vielzahl von Erkrankungen, einschließlich Bluthochdruck, Vorhofflimmern und Schmerzen ^1,2 postuliert. Zum größten Teil jedoch Fortschritte zum Verständnis ihres therapeutischen Potenzials oder sogar grundlegenden physiologischen Funktionen durch den Mangel an guten pharmakologischen Werkzeugen verlangsamt. In der Tat hat die molekulare Pharmakologie des Einwärtsgleichrichter Familie weit hinter der des S4 Superfamilie der spannungsgesteuerten Kaliumkanäle (Kv)-Kanäle, für die eine Reihe von nanomolaren-Affinität und hochselektive Peptidtoxin Modulatoren ³ entdeckt haben zurückgeblieben. Die Bienengift Toxin tertiapin und seine Derivate sind potente Inhibitoren von Kir1.1 und Kir3 Kanäle ^4,5, aber Peptide sind nur von begrenztem Nutzen therapeutisch als auch experimentell aufgrund ihrer antigenen Eigenschaften und schlechte Bioverfügbarkeit, metabolische Stabilität und Gewebe Penetranz. Die Entwicklung potenterund selektive niedermolekulare Sonden mit verbesserten pharmakologischen Eigenschaften werden ein Schlüsselfaktor für ein volles Verständnis der Physiologie und therapeutische Potenzial von Kir-Kanälen sein.

Das Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) durch die National Institutes of Health (NIH) Common Fund hat Möglichkeiten geschaffen für akademische Wissenschaftler Sonde Entdeckung Kampagnen für molekulare Targets und Signalwege in der Notwendigkeit einer besseren pharmakologischen ⁶ einzuleiten. Die MLPCN bietet Forschern den Zugang zu Industrie-scale Screening-Zentren und die medizinische Chemie und Informatik zu unterstützen niedermolekularen Sonden, um die Funktion von Genen und Gen-Netzwerke aufzuklären entwickeln. Der entscheidende Schritt in der Zulassung zu dem MLPCN ist die Entwicklung eines robusten Target-oder Pathway-spezifischen Assay, zugänglich für High-Throughput-Screening (HTS) ist.

Hier beschreiben wir, wie man eine Fluoreszenz-basierten Thallium (Tl ⁺⁾ flux assa entwickelny von Kir Kanalfunktion für das Hochdurchsatz-Screening Verbindung ^7,8,9,10. Der Assay basiert auf der Durchlässigkeit des K ^+-Kanals Pore der K ⁺ Kongener Tl ⁺ basiert. Eine handelsübliche Leuchtstofflampen Tl ⁺ Reporter-Farbstoff wird verwendet, um transmembrane Fluss der Tl ⁺ durch die Pore zu erkennen. Es gibt mindestens drei kommerziell erhältliche Farbstoffe, die sich für Tl ⁺ Flux Assays sind: BTC, FluoZin-2 und ^7,8 Fluxor. Dieses Protokoll beschreibt Assay-Entwicklung mit FluoZin-2. Obwohl ursprünglich entwickelt und vermarktet als Zink-Indikator, Ausstellungen FluoZin-2 eine robuste und dosisabhängige Erhöhung der Fluoreszenzemission auf Tl ⁺ Bindung. Wir begann mit FluoZin-2 vor Fluxor verfügbar war ^7,8 und haben weiterhin so ^9,10 zu tun. Jedoch sind die Schritte in Assay-Entwicklung im wesentlichen identisch für alle drei Farbstoffe, und Benutzer sollten bestimmen, welche am besten geeigneten Farbstoff ist für ihre spezifische nEEDS. Wir diskutieren auch die Assays Performance-Benchmarks, die erreicht, um für die Einreise in die MLPCN in Betracht gezogen werden muss. Da Tl ⁺ gut durchzieht die meisten K ^+-Kanäle, sollte der Test sein, anpassbar an die meisten K ^+-Kanal Ziele.

Protokoll

Ein. Erzeugung von stabilen polyklonalen Zelllinien

1. Die Errichtung eines hochwertigen stabile Zelllinie die Kir Kanal von Interesse ist ein wichtiger erster Schritt in Richtung Entwicklung eines robusten High-Throughput-Screening-Test. Konstituierende K ^+-Kanal Überexpression kann zu einer Aktivierung des Zelltodes Wege, stabile Zelllinie Degeneration und Verlust der Assay-Leistung führen. Um diese potentiellen Probleme zu vermeiden und ein bequemer interne Kontrolle für die Assay-Entwicklung (siehe unten), wird ein Tetracyclin-induzierbare Expressionssystem ⁸ empfohlen.
2. Kultur die elterliche T-Rex-HEK293-Zellen unter Verwendung von Standardverfahren in B-Medium (DMEM Wachstumsmedium mit 10% FBS, 50 U / ml Penicillin, 50 ug / ml Streptomycin und 5 ug / ml Blasticidin S). Verwenden frühen Passage Zellen (z. B. 3-4 Passagen seit dem Auftauen aus flüssigem Stickstoff Lagerung) für die Transfektion und stabile Klonselektion.
3. Plate 4 Millionen T-Rex-HEK293-Zellen in einem75 cm ^2-Kolben, so dass der Kolben etwa 80% konfluent am folgenden Tag ist. Kultur über Nacht in einem 5% CO ₂ Inkubator bei 37 ° C.
4. Transfizieren der Zellen unter Verwendung von 10 bis 15 ug der DNA und pcDNA5/TO-Kir Lipofectamin LTX / Plus Reagenz nach dem Protokoll des Herstellers. Nach 5 Stunden ersetzen Transfektionsmedium mit B-Medium.
5. 24 Stunden nach der Transfektion, ersetzen die B-Medium mit B-Medium, enthaltend 250 ug / ml Hygromycin (BH-Medium), um stabile Klonselektion beginnen. Füttern Sie die Zellen alle 2-3 Tage mit frischem BH-Medium.
6. Mehr als 90% der Zellen sollte in den nächsten 7 Tagen sterben, hinterlassen kleine Kolonien von stabil transfizierten Zellen. Lassen Sie die Kolonien für weitere 10-14 Tage vor der Spaltung wachsen zu einer 175 cm ^2-Kolben für die Expansion.
7. Zur Kryokonservierung, eingefroren 3 x 10 ⁶ Zellen / ml in Medium mit 45% konditioniert BH-Medium, 45% Antibiotika-freien, serumhaltigen DMEM und 10% DMSO. Einfrierendie Zellen über Nacht bei -80 ° C in einer Zelle Gefrierbehälter und dann in flüssigen Stickstoff zu bewegen für die langfristige Lagerung. Auftauen Zellen aus flüssigem Stickstoff mit Invitrogen empfohlene Protokoll. Beachten Sie, dass die Lebensfähigkeit der Zellen geringer sein wird, wenn sie aus einer Flasche, die größer als 75% konfluent zum Zeitpunkt der Verarbeitung ist eingefroren.

2. Erzeugung von stabilen monoklonale Zelllinien

1. Waschen eine sub-konfluenten 75 cm ^2-Kolben von stabilen polyklonalen Zellen mit zweiwertigen-free HBSS. 1 ml Trypsin und inkubiere für 3-5 min in einer 5% CO _2-Inkubator bei 37 ° C. 5 ml BH-Medium in den Kolben zu Trypsinaktivität hemmen und verreiben wiederholt (zB 5 mal) vollständig dissoziieren die Zellen. Überprüfen Sie sorgfältig die Zellen unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, wird die Suspension besteht fast ausschließlich aus einzelnen Zellen. Dies erhöht die Wahrscheinlichkeit des Erhaltens monoklonaler Zelllinien.
2. Bestimmen Sie die Zelldichte und verdünnendie Suspension auf eine Konzentration von 0,7 Zellen je 20 ul. Mit einer Multi-Kanal-Pipette, Pipette 20 ul der Zellsuspension in jedes Well der BD PureCoat Amin-beschichteten (oder gleichwertig Poly-D-Lysin beschichtet) 384-Well-Platten. Im Prinzip sollten 70% der Vertiefungen eine Zelle mit diesen Plattierungsbedingungen empfangen. Somit sollte ein 384-Well-Platte enthalten mehr als 200 Klone zu analysieren. Weiterhin Kultivieren der Zellen in einem 5% CO ₂ Inkubator bei 37 ° C.
3. Nach einer Woche, überprüfen Sie die Platten unter einem Mikroskop für Brunnen mit einzelnen Kolonien. Beachten Sie ihre Position auf dem Deckel mit einem Permanent-Marker für die Zukunft. Seien Sie sicher, auch beachten und verstehen sich inklusive Brunnen mit mehreren Kolonien. Diese werden am einfachsten durch das Auftreten von Kolonien wachsen von mehreren Seiten des allgemein anerkannt. Seien Sie sich bewusst, dass die Verdampfung schneller auftreten, aus Brunnen in der Nähe der Kante der Platte neigt. Fügen BH-Medium in die Vertiefungen, in denen erhebliche Verdunstung stattgefunden hat. Ansonsten ist es nicht notwendig to füttern die Zellen.
4. Überwachen Sie die Brunnen immer häufiger in den nächsten 7-10 Tage. Die Zellen werden bereit zu spalten, wenn die Vertiefungen von Interesse mindestens 50% konfluent sind.
5. Aufteilen der Zellen auf 384-Loch-Platten zu duplizieren; einen Platte zum Testen mit Tl ^+-Fluss und die andere für die Fortsetzung des monoklonalen Linien in Kultur. Absaugen Medium aus den Vertiefungen, die die Zelllinien von Interesse. Waschen Sie die Zellen mit zweiwertigen-free HBSS, mit 20 ul von Trypsin in jede Vertiefung und übertragen Sie die Platte mit einem 37 ° C Inkubator für 15-20 min. Nach dem Verschieben der Platte wieder zu der Zellkultur Kapuze, fügen Sie 20 ul BH-Medium in jede Vertiefung und verreiben Sie mehrmals, um die Zellen zu distanzieren. Überprüfen Sie die Brunnen unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, sind die Zellen vollständig dissoziiert. Dies kann erfordern mehrere Runden von Pipettieren, wie die Zellen werden festhaftenden. Sobald die Zellen dissoziiert sind, übertragen 10 ul jeder Zellsuspension in die Vertiefungen eines neuen BD PureCoat Amin-beschichteten 38 duplizieren4-Well-Platte. Achten Sie darauf, die Beziehung zwischen der Quelle wohlgemerkt und doppelte Ziel Brunnen, so dass die Klone ausstellenden robuste Kir-Kanal-Aktivität (siehe unten) wieder auf den ursprünglichen gut verfolgt werden kann. Fügen Sie 20 ul BH-Medium auf die ursprüngliche Quelle auch die restlichen Zellen ernähren und weiter sie in Kultur in 5% CO _2-Inkubator bei 37 ° C.
6. Damit die Zellen in der Ziel-Platte zu haften und wachsen bis zu einer Woche. Nachdem die meisten Klone mindestens 50% Konfluenz erreichen, können sie für Kir Kanalaktivität mit dem beurteilt werden Tl ^+-Fluss-Test beschrieben.
7. Am Tag vor dem Test absaugen Kulturmedium und ersetzen Sie es mit BH-Medium mit 10% dialysiertem FBS. Dies verhindert unbeabsichtigte Kanal Ausdruck, das von Tetracyclin verunreinigt Serum entstehen könnten. Induzieren Kir Kanal Expression in nur einer der zwei Vertiefungen für jeden Klon von einschließlich 1 ug / ml Tetracyclin. Das Duplikat nicht induziert auch als a dienen"Hintergrund"-Steuerung. Führen Sie die Tl ^{+-Fluss-Assays,} wie im Folgenden beschrieben.

3. Allgemeine Tl ⁺ Flux Testdurchführung

1. Der Tag vor einem Tl ⁺ Flux Experiment distanzieren die Zellen und quantifizieren die Dichte der Zellsuspension wie in den Abschnitten 2.1 und 2.2 beschrieben. Platte 20.000 monoklonale Zellen, die stabil mit einem Kanal Kir Gens von Interesse in jede Vertiefung einer BD PureCoat Amin beschichtete 384-Well-Platte unter Verwendung eines Thermo Multidrop Combi oder ein Mehrkanal-Pipettor transfiziert. Verwenden BH-Medium mit 10% dialysiertem FBS für Plattieren. Beachten Sie, dass einige Zellen über Nacht wird mit 1 ug / ml Tetracyclin kultiviert werden, um Kir-Kanal Expression zu induzieren, während andere nicht. Die Lage des induzierten und induzierten Zellen werden für jede Art von Experiment unterscheiden und sind in Abbildung 1 gezeigt.
2. Am nächsten Tag inspizieren die Platten unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen adhärente sind und gleichmäßig über den Boden verteiltder Brunnen. Die Brunnen sollten 80-90% konfluent sein.
3. Verwenden einer ELx405 Washer das Zellkulturmedium mit 20 ul pro Vertiefung von HBSS Testpuffer, der 20 mM HEPES ersetzen und gepuffert auf pH 7,3 mit NaOH. Alternativ kann man eine "Flick und slam"-Methode, wobei die Platte umgedreht und unten scharf aufgeschnappt, das Medium in einen Abfallbehälter werfen, und dann klopfte auf gestapelten Papierhandtücher, um die restlichen Medien zu entfernen. Sofort im Rücken HBSS Assaypuffer zu der Platte, um die Zellen von Desikkation verhindern.
4. Bereiten Sie die FluoZin-2, AM Farbstoffbeladung Lösung. Nach kurzem Zentrifugieren das Rohr, lösen 50 ug FluoZin-2-Pulver in 100 ul wasserfreiem DMSO. An diesem Punkt können Aliquots der 1.000 x Stammlösung bei -20 ° C für die spätere Verwendung gespeichert werden. Wenn Sie bereit sind zu verwenden, fügen 50 ul einer 20% Gewicht pro Volumen Pluronic F-127/DMSO Lösung des Farbstoffs und mischen sich mit sanften Pipettieren. Nicht einfrieren den Farbstoff einmal Pluronic F-127 hinzugefügt wurde, wieTieftemperatur kann das Tensid aus der Lösung ausfallen. Fügen Sie die 150 ul Volumen von FluoZin-2, AM/Pluronic-F127 zu 100 ml HBSS Assaypuffer und vorsichtig mischen, um den Farbstoff Ladepuffer machen. Mit einem Multidrop Combi-oder Multi-Kanal-Pipette, mit 20 ul Farbstoff Ladepuffer in jede Vertiefung bereits mit 20 ul HBSS Assay-Puffer. Inkubieren der Zellen bei Raumtemperatur für etwa 1 Stunde (typischerweise Inkubation wurde im Dunkeln durchgeführt, obwohl es keinen direkten Hinweis, dass es notwendig ist).
5. Während die Zellen mit dem Farbstoff werden geladen, bereiten ein Tl ⁺ Stimulus Platte. Frisch aufzulösen 0,5 g Natriumbicarbonat in 50 ml 5x Tl ⁺ Stimulus-Puffer, enthaltend 1 mM Magnesiumsulfat, 1,8 mM Calciumsulfat, 5 mM Glucose, 10 mM HEPES und 12 mM Tl ⁺ Sulfat. Alternativ können Natriumbicarbonat mit Natriumgluconat ersetzt werden, wenn zum Beispiel der pH der Lösung innerhalb eines sehr engen Bereichs und Verlust von Kohlendioxid gehalten werden müssenein Anliegen ist. Das Röhrchen fest, um das Entweichen von Kohlendioxid zu begrenzen und zu invertieren mehrere Male, bis das Natriumbicarbonat in Lösung geht. Mit einem Multi-Kanal-Pipette werden 50 ul der Lösung in jede Vertiefung aus einem Polypropylen-384-Well-Platte (Tabelle 1).
6. Nachdem die Zellen mit FluoZin-2 geladen wurden, AM, waschen Sie die Platten mit einer ELx405 Mikroplatten Washer oder mit der "Flick und Slam"-Verfahren, wie oben beschrieben in Abschnitt 3,3. Je nach Art von Tl ⁺ Flußmittel Experiment durchgeführt werden soll, wieder hinzuzufügen 20 ul bzw. 40 ul Assaypuffer HBSS zu jeder Vertiefung. Die Platten sind nun bereit für Experimente.
7. Die Zell-und Tl ⁺ Platten in einem Hamamatsu Functional Drug Screening System (FDSS) oder gleichwertig kinetische Imaging Plate Reader mit integriertem Flüssigkeitausgabevorrichtung Fähigkeiten. Verwenden Sie geeignete Filter für Fluorescein / Fluorescein-Farbstoffen, wie Fluo-4.
8. Richten Sie einen Single-Add-Protokoll, so dass 10 ul der 5x Tl ⁺Serie zu den entsprechenden Wells der Zellplatte enthaltend 40 ul Assaypuffer HBSS zugegeben. Nimm Fluoreszenzbasismesswert bei einer 1 Hz Abtastfrequenz mindestens 10 sek. Die Well-to-Well-Fluoreszenz sollte einheitlich und stabil über die Platte einmal optimale Zelle plating, Wasch-und Farbstoff Lastbedingungen ansässig sind. Ein integrierter 384-Kanal-Pipette wird verwendet, um gleichzeitig fügen Sie die Tl ⁺ Stimulus-Puffer in jede Vertiefung.
9. Aufzeichnung für mindestens 2 min, so daß die Rate und Peak des Tl ^+-induzierte Anstieg der Fluoreszenz für die Off-line-Analyse erfasst wird.

4. Bestimmung der optimalen Tl + Konzentration

1. Tl ⁺ gut durchzieht die meisten Einwärtsgleichrichter K ^+-Kanäle. Um sicherzustellen, dass Tl ⁺ liegen nicht über den dynamischen Bereich des Tl ⁺ Reporterfarbstoff FluoZin-2, sollte man empirisch die optimale Tl ^{+-Konzentration} in einem Hoch-T verwendet werdenhroughput Bildschirm. Wir empfehlen eine Tl ^{+-Konzentration,} die 80% der maximalen Fluoreszenz-Antwort (EG ₈₀₎ unter Bedingungen, bei denen der Kanal maximal aktiviert wird evoziert.
2. Plate, Farbstoff Last und die Zellen werden in BD PureCoat Amin-beschichteten oder gleichwertig Poly-D-Lysin-beschichtete 384-Well-Platten wie oben in Abschnitt 3 beschrieben, so dass 40 ul HBSS Assay-Puffer in jede Vertiefung. Wie in der Platte Karte in Abbildung 1A, Spalte 1 und Zeilen A1-A23-Zellen, die nicht mit Tetracyclin ausgelöst wurden und daher nicht Ausdruck der Kir-Kanal von Interesse enthalten sollte gezeigt. Die FluoZin-2-Fluoreszenz-Signale von den nicht induzierten Vertiefungen verwendet werden, um das Niveau von Tl ⁺ Fluß durch endogene Wege, wie das Na bestimmen ⁺ - K ^{+-ATPase-Pumpe} und spannungsabhängigen K ^+-Kanäle, die normalerweise in exprimiert werden HEK- 293-Zellen.
3. Verwenden Sie ein Agilent Bravo Automated Liquid Handling Plattform oder manuelle Pipettieren ein vorzubereitenElf-Punkte-Tl ^{+-Konzentration} Verdünnungsreihe in HBSS Assay-Puffer. Typischerweise wird eine 3-fache serielle Verdünnungsreihe im Bereich von 100% bis 0.002% Tl ⁺ im Assay evaluiert. Die Serie sollte an einem 5x Konzentration gemacht werden, weil die Tl ^+-Lösungen werden 1:5 in der letzten Assay verdünnt werden. Bereiten Sie die Verdünnungsreihe durch Verdünnen der Standardlösung 5x Tl ^+-Puffer in Abschnitt 3 mit einem 5x Tl ^+-freien Puffer mit 1 mM Magnesiumsulfat, 1,8 mM Calciumsulfat, 5 mM Glucose und 10 mM HEPES beschrieben. Wieder auflösen frisch 0,5 g Natriumbicarbonat in 50 ml des fertigen Tl ⁺ Puffer unmittelbar vor dem Plattieren in einem Polypropylen-384-Well-Platte nach der Platte Karte in 2A gezeigt.
4. Legen Sie die Zelle und Tl ⁺ Stimulus Platten in die FDSS. Richten Sie einen Single-Add-Protokoll, so dass 10 ul der 5x Tl ^+-Serie in die entsprechenden Vertiefungen der Zelle Platte mit 40 ul HBS hinzugefügt wirdS-Assay-Puffer. Nimm Basislinie FluoZin-2 Fluoreszenz für 10 Sek. vor dem Hinzufügen Tl ⁺ zu der Platte. Wiederholen Sie das Experiment auf 3 separate Tage, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu schaffen.

5. Bestimmung der Assay-Empfindlichkeit, um DMSO

1. Die kleinen Moleküle in einem Hochdurchsatz-Screening abgefragt werden in dem organischen Lösungsmittel Dimethylsulfoxid (DMSO), das selbst die Durchführung des Assays beeinträchtigen können gelöst. Daher muss der Assay-Empfindlichkeit auf DMSO zuerst untersucht, um die höchste zulässige DMSO-Konzentration in der Maske festzulegen.
2. Plate, Farbstoff Last und die Zellen werden in BD PureCoat Amin-beschichtete 384-Well-Platten wie oben in Abschnitt 3 beschrieben, so dass 20 ul HBSS Assay-Puffer in jede Vertiefung. Die gesamte Platte enthalten sollte, die Zellen mit Tetracyclin (3A) induziert wurden.
3. Verwenden Sie ein Bravo Automated Liquid Handling Plattform oder manuelle Pipettieren eine elf-Punkte-D vorzubereitenMSO Konzentration Verdünnungsreihe in HBSS Assay-Puffer. Typischerweise wird eine 2-fach Verdünnungsreihe im Bereich von 10% bis 0,01% v / v DMSO für die Aktivität im Assay evaluiert. Die Serie sollte an einem 2x Konzentration gemacht werden, weil die DMSO-Lösungen um die Hälfte im letzten Test verdünnt werden. Die Verdünnungsreihe sollte in einer Polypropylen-384-Well-Platte plattiert werden, gemäß der Platte Karte in 3A gezeigt.
4. Bereiten Sie eine 5x Tl ⁺ Stimulus Platte auf der EC ₈₀ oder optimale Tl ^{+-Konzentration} in Abschnitt 4 ermittelt wird.
5. Legen Sie die Zelle, DMSO und Tl ⁺ Stimulus Platten in die FDSS. Richten Sie eine zwei-add-Protokoll, so dass 20 ul der 2x Konzentration DMSO Serie zu den entsprechenden Vertiefungen der Zelle Platte mit 20 ul HBSS Assay-Puffer hinzugefügt wird. Verlassen das DMSO auf die Zellen für die gleiche Menge an Zeit, um die Zellen Kleinmolekül Fahrzeugs während eines Bildschirms ausgesetzt wird. Rekord Baseline FluoZin-2 Fluoreszenz beimindestens 10 Sekunden vor Zugabe von 10 ul 5x Tl ⁺ Puffer in jede Vertiefung der Zellenplatte. Wiederholen Sie das Experiment auf 3 separate Tage, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu schaffen.
6. Der Assay ist tolerant sein, um Konzentrationen von mindestens 0,1% V / V für einen typischen High-Throughput-Screening, in der Verbindungen mit einer Konzentration von 10 pM getestet DMSO.

6. Bestimmung der Assay-Empfindlichkeit, um Bekannte pharmakologische Modulatoren

1. Nach der Bestimmung der optimalen Konzentration und Tl ⁺ DMSO Toleranz des Assays, die Wirkungen von pharmakologisch wirksamen Mitteln auf Kir Kanal mediierten Tl ⁺ Flußmittel bekannt geprüft werden sollte. Diese Reihe von Experimenten bewertet die Assay-Empfindlichkeit, die Fähigkeit, Rangordnung Verbindungen auf ihre Potenz, die Fähigkeit, Verbindungen auf ihre Wirkungsweise Wirksamkeit (zB Aktivator, Inhibitor) basierend kategorisieren und zu identifizieren wohlerzogene Kontrollverbindungen später verwendet werden in basierend d der Assayntwicklung und Bildschirm.
2. Plate, Farbstoff Last und die Zellen werden in BD PureCoat Amin-beschichtete 384-Well-Platten wie oben in Abschnitt 3 beschrieben, so dass 20 ul HBSS Assay-Puffer in jede Vertiefung. Spalte 1 und Zeilen A1-A23-Zellen enthalten sollte, das nicht mit Tetracyclin (4A) ausgelöst wurden.
3. Verwenden Sie ein Bravo Automated Liquid Handling Plattform oder manuelle Pipettieren eine elf-Punkte-Konzentration Verdünnungsreihe von bekannten Modulatoren in HBSS Assaypuffer vorzubereiten. Typischerweise ist ein 3-fach Verdünnungsreihe im Bereich von 100 pM bis 2 nM für die Aktivität im Assay evaluiert. Die Serie sollte an einem 2x Konzentration gemacht werden, weil die DMSO-Lösungen um die Hälfte im letzten Test verdünnt werden. Die Verdünnungsreihe sind in dreifacher Ausfertigung in einer Polypropylen-384-Well-Platte plattiert werden, gemäß der Platte Karte in 4A gezeigt. Sicherstellen, dass die Verdünnungen hergestellt sind, so dass die endgültige DMSO-Konzentrationen gleich sind zwischen Drogebehandlungen und weniger tha n oder gleich der maximal zulässigen DMSO-Konzentration in Abschnitt 5 definiert.
4. Bereiten Sie eine 5x Tl ⁺ Stimulus Platte auf die optimale Tl ^{+-Konzentration} in Abschnitt 4 ermittelt wird.
5. Legen Sie die Zelle, Verbindung und Tl ⁺ Stimulus Platten in die FDSS. Einrichten einer Zwei-Add-Protokoll, so dass die 20 ul 2x Konzentration Verbindung Serie zu den entsprechenden Wells der Zellplatte enthaltend 20 ul Assaypuffer HBSS zugegeben wird. Fügen Sie die Verbindungen zu der Zelle Platte und inkubieren für bis zu 20 min. Beachten Sie, dass die optimale Inkubationszeit für die Verbindungen, die beste Signal zu Hintergrund-Verhältnis erfassen durch Ausführen einer Reihe von Experimenten, bei denen Paare unterschiedliche Inkubationszeiten gewählt werden bestimmt werden kann. Rekord Baseline FluoZin-2-Fluoreszenz für mindestens 10 Sekunden vor Zugabe von 10 ul 5x Tl ^+-Puffer in jede Vertiefung der Zelle Platte. Wiederholen Sie das Experiment auf 3 separate Tage, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu schaffen.

_title "> 7. Checkerboard-Analyse

1. In der nächsten Reihe von Experimenten wird die Gleichmäßigkeit und Reproduzierbarkeit des Tests unter Verwendung eines "Schachbrett"-Analyse werden. Typischerweise wird eine Steuerung Inhibitor in jedem anderen gut jeder Spalte und Zeile einer 384-Well-Platte plattiert, wie in 5A gezeigt. Rigoros beurteilen das Rauschen in dem Assay, sollte eine Konzentration von EC _80-Inhibitor verwendet werden. DMSO wird mit den anderen Vertiefungen als Fahrzeugsteuerung aufgenommen. Tl ^+-Fluss in DMSO-und Arzneimittel-behandelten Zellen wird verwendet, um einen Wert für Z prime, ein statistisches Maß für well-to-well Variabilität zwischen den beiden Populationen von Brunnen zu berechnen. Z prime wird anhand folgender Formel berechnet:
   Z prime = 1 - (3SD _p + 3SD _n) / | bedeutet _p + bedeutet _n |
   wobei SD Standardabweichung ist, p ungehemmten Fluß und n ist vollständig inhibiert Flußwerte. Ein Assay mit Z 'Werte größer als oder gleich 0,5 auf 3 verschiedenen Tagen wird als suitable für das Hochdurchsatz-Screening.
2. Plate, Farbstoff Last und die Zellen werden in BD PureCoat Amin-beschichtete 384-Well-Platten wie oben in Abschnitt 3 beschrieben, so dass 20 ul HBSS Assay-Puffer in jede Vertiefung. Beachten Sie, dass die gesamte Platte mit Tetracyclin induziert werden.
3. Stellen Sie eine Verbindung / DMSO Platte durch Pipettieren in eine 384-well Polypropylen-Platte mit einem Multi-Kanal-Pipette, 80 ul / Vertiefung eines bekannten Inhibitors des Ziels Kir-Kanal bei der Konzentration in Abschnitt 6.5 bestimmt, und 0,1% v / v DMSO Fahrzeug wie in 5A gezeigt. Fügen Sie den bekannten Inhibitor ab und A1 mit dem Multi-Kanal-Pipette und alternative gut B2 und so weiter bis weit B24. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit DMSO ab und B1 und so bis weit A24. Das endgültige Layout der Platte sollte dem eines Schachbretts.
4. Bereiten Sie eine 5x Tl ⁺ Stimulus Platte auf die optimale Tl ⁺ basiert in Abschnitt 4 ermittelt.
5. Legen Sie die Zelle, Verbindung und Tl ⁺ Stimulus Platten in die FDSS. Einrichten einer Zwei-Add-Protokoll, so dass die 20 ul 2x Konzentration Verbindung Serie zu den entsprechenden Wells der Zellplatte enthaltend 20 ul Assaypuffer HBSS zugegeben wird. Fügen Sie die Verbindungen zu der Zelle Platte und inkubieren für bis zu 20 min bei Raumtemperatur. Rekord Baseline FluoZin-2-Fluoreszenz für mindestens 10 Sekunden vor Zugabe von 10 ul 5x Tl ^+-Puffer in jede Vertiefung der Zelle Platte. Wiederholen Sie das Experiment auf 3 separate Tage, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu schaffen.

8. Pilot-Bildschirm

1. In der Endphase der Assay-Entwicklung, führen eine Pilot-Bildschirm von einigen tausend Verbindungen des Assays unter Bedingungen, die Leistung, die schließlich in der großtechnischen Hochdurchsatzscreening eingesetzt werden auszuwerten.
2. Plate, Farbstoff Last und die Zellen werden in BD PureCoat Amin-beschichtete 384-Well-Platten wie oben in Abschnitt 3 beschrieben), wobei 20 ul HBSS Assay-Puffer in jede Vertiefung.Beachten Sie, dass die gesamte Platte Nacht sollte mit Tetracyclin kultiviert werden, um Kir-Kanal Expression zu induzieren.
3. Wählen etwa 2.000 bis 3.000 strukturell verschiedenen zu untersuchenden Verbindungen. Es ist oft sinnvoll und bequem zu Verbindungen Sammlungen mit bekannten Aktivitäten potenziell für Ionenkanal-Modulatoren angereichert verwenden. Solche Sammlungen sind die Spectrum Collection (Microsource) und die LOPAC Sammlung (Sigma). Darüber hinaus ist es ratsam, bekannten Modulatoren der Kir Interesse an der Pilot-Bildschirm aufzunehmen. Idealerweise sind diese Verbindungen werden in die Vertiefungen in einer verblindeten Weise hinzugefügt werden, um eine unvoreingenommene Prüfung der Hit Picking beschriebenen Methoden weiterverarbeiten lassen. Bereiten Sie die Verbindungen in 384-Well-Platten aus Polypropylen (Ziel-Platten) mit einem Labcyte Echo Liquid Handler oder geeigneten Stift Werkzeug, um eine entsprechende Volumen von ausgewählten Verbindungen in DMSO aus dem MLPCN Sammlung (Quelle Platten) Übertragung an das Ziel Platten Beachten Sie, dass Testverbindungen nur in den Spalten 3 bis 22;In jedem anderen auch der Spalten 1, 2, 23, fügen Sie 24 ein bekannter Inhibitor in einer Konzentration bekannt ist vollständig hemmen die Kir wie in Abschnitt 7 bestimmt. In den übrigen Vertiefungen von Spalten 1, 2, 23 und 24 die erforderliche Menge an DMSO, um DMSO Konzentration abgestimmten Fahrzeugsteuerungen erzeugen. Verdünnen Sie alle Brunnen mit Assay-Puffer mit der Multidrop Combi. Typischerweise Testverbindungen wird 20 uM, 2-fach über dem Target-Screening Konzentration.
4. Machen Tl ⁺ Stimulus Platten auf die optimale Tl ^{+-Konzentration} in Abschnitt 4 ermittelt wird.
5. Führen Sie den Pilot-Bildschirm. Achten Sie darauf, die Schritte des Protokolls der Ausführung staffeln, um konsistente Timing zwischen den Platten in der Pilot-Screening Lauf beizubehalten.
6. Sobald der Pilot-Bildschirms beendet ist, analysieren die Schachbrettmuster Vertiefungen aus den Spalten 1, 2, 23 und 24 unter Verwendung der Z-prime Gleichung. Untersuchen Platten, die Z-prime-Werte von weniger als 0,5 zeigen, um die Quelle des schlechten Trennung von Steuer Populationen zu bestimmen. Hits Kann bE ausgewählt Verwendung einer Reihe von Verfahren. Für Piloten Bildschirmen ist es üblich, den Mittelwert und die Standardabweichung der Fahrzeugkontrolle Bevölkerung berechnen und holen Zugriffe auf Brunnen Erzeugen von Werten> / = 3 Standardabweichungen vom Mittelwert der Fahrzeug-Kontrollen.
7. Nach Hit Picking, Retest ausgewählte Treffer in in 2 Sätze Teller zu duplizieren. Eine Gruppe von Platten enthält die stabile Kir Zelle in Abwesenheit von Tetracyclin und der andere enthält die stabile Kir Zelllinie in Gegenwart von Tetracyclin. Hits, die positive Retest in mindestens einer der beiden Platten Retest und nicht zu signifikanten Aktivität in den nicht induzierten Platten zeigen betrachtet werden kann verifiziert Treffern. Untersuchen Sie das überprüft Hitliste, um festzustellen, wie viele der "versteckten" Kontrollproben wurden erkannt. Failure, um die Kontrollen in der Pilot-Bildschirm zu erkennen gibt die Notwendigkeit für eine weitere Optimierung der Screening-oder Hit-Picking Parameter.

Ergebnisse

Die Verwendung eines Tetracyclin-induzierbaren Expressionssystem bietet eine bequeme interne Kontrolle für die Unterscheidung Tl ⁺ Fluß durch endogene Wege und der Kir interessierenden Kanal. Abbildung 1 zeigt einige Beispiele von Zell Plattieren Karten in verschiedenen Arten von Experimenten verwendet. Die Positionen der Vertiefungen mit induzierten oder Tetracyclin-induzierten Zellen werden mit unterschiedlichen Farben dargestellt. Abbildung 2A zeigt die Source-Platte Kar...

Diskussion

Datenverarbeitung: Sobald die Daten gesammelt werden, ein gemeinsamer Schritt in der Analyse beinhaltet Normalisierung jedes Brunnens Fluoreszenz-Antwort, F, auf den Ausgangswert zu Beginn des Experiments, F _0. Dies wird allgemein als der "statische Verhältnis" bezeichnet und symbolisiert "F / F ^_0". In Fällen, in denen F ₀ von der Indikatorfarbstoff dominiert wird die statische Verhältnis Operation wird im wesentlichen für viele Faktore...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalognummer	Kommentare
pcDNA5/TO	Invitrogen	V1033-20	Tetracyclin-induzierbarer Expressionsvektor
T-Rex-HEK293-Zellen	Invitrogen	R71007	Tetracyclin-induzierbaren Zelllinie
Lipofectamine LTX / Plus Reagent	Invitrogen	15338100	Transfektionsreagenz
FBS	ATLANTA Biologicals	S11550	Zellkulturmedien
DMEM	Invitrogen	11965	Zellkulturmedien
Hygromycin B	Invitrogen	10687-010	Zellkulturmedien
Blasticidin S	Invitrogen	R210-01	Zellkulturmedien
Penicillin / Streptomycin	Invitrogen	15140	Zellkulturmedien
HBSS-zweiwertigen kostenlos	Mediatech	21022CV	Waschen der Zellen
Trypsin-0,25%	Mediatech	25053CI	Zelldissoziationslösung
Tetracyclin-HCl	Sigma	T9823	Induction Reagenz
Dialysiertes FBS	ATLANTA Biologicals	S12650	Plattierungsmedien
FluoZin-2	Invitrogen	F24189	Fluoreszenzfarbstoff
Pluronic F-127	Invitrogen	P-3000MP	Dye Belastung
HBSS	Invitrogen	14175	Assay-Puffer
HEPES	Invitrogen	15630	Assay-Puffer
NaHCO 3	Sigma	S6297	Tl + Stimulus-Puffer
MgSO 4	Sigma	M2643	Tl + Stimulus-Puffer
CaSO 4 • 2H 2 O	Sigma	C3771	Tl + Stimulus-Puffer
D-Glucose	Sigma	G7528	Tl + Stimulus-Puffer
Thalliumsulfat	Aldrich	204625	Tl + Stimulus-Puffer
HEPES	Sigma	H4034	Tl + Stimulus-Puffer
DMSO	Sigma	D4540	Lösungsmittel
Acht-Kanal elektronische Pipette	Biohit	E300	Zelle plating in 384 -Well-Platten
BD PureCoat Amin-beschichtete 384-Well-Platten	BD Biosciences	356719	Assay Mikrotiterplatten
Echo qualifiziert 384-Well Polypropylen Microplatte (384PP)	Labcyte	P-05.525	Compound Quelle Mikrotiterplatten
384-well Mikroplatten Polypropylen	Greiner Bio-One	781280
Multidrop Combi Reagenzspender	Thermo Scientific	5840300
ELx405 Mikroplatten-Washer	BioTek	ELx405HT	Automationszelle Waschen
Echo Liquid Handler	Labcyte	Labcyte Echo 550
Bravo automatisierten Liquid-Handling-Plattform	Agilent Technologies	Standard-Modell
Hamamatsu FDSS 6000	Hamamatsu		Kinetic Imaging Plate Reader