Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers mit Microarrays

Zusammenfassung

Eine Technik namens C Mfassende M Icroarray P Olymer Profiling (Kompp) zur Charakterisierung von Pflanzenzellwand Glycane beschrieben. Dieses Verfahren kombiniert die Spezifität von monoklonalen Antikörpern, die auf definierte Glycan-Epitope mit einer Miniatur-Mikroarray analytische Plattform ermöglicht Screening Glycan Auftretens in einem breiten Bereich von biologischen Zusammenhänge.

Zusammenfassung

Pflanzliche Zellwände sind komplexe Matrizen von heterogenen Glykane, die eine wichtige Rolle in der Physiologie und Entwicklung von Pflanzen spielen und die Rohstoffe für menschliche Gesellschaften (zB Holz, Papier, Textil-und Biokraftstoff-Industrie) ^1,2. Das Verständnis der Biosynthese und Funktion dieser Komponenten bleibt eine Herausforderung.

Zellwand Glycane sind chemisch und konformativ vielfältigen aufgrund der Komplexität ihrer Bausteine, die Glycosylreste. Diese Form Bindungen an mehreren Positionen unterscheiden sich in Ringstruktur, isomerer oder anomeren Konfiguration, und darüber hinaus werden mit einer Anordnung von nicht-substituierten Zuckerreste. Glycan Zusammensetzung variiert in verschiedenen Zell-und / oder Gewebetypen oder sogar Sub-Domänen eines einzelnen Zellwand ^3. Außerdem ist deren Zusammensetzung auch während der Entwicklung ^ein, oder in Reaktion auf Umweltreize ⁴ modifiziert.

In exProzess von 2.000 Gene Pflanzliche Zellwände sind komplexe Matrizen von heterogenen Glykane wird vorausgesagt, dass in der Zellwand Glykan Biosynthese und Modifikation in Arabidopsis ⁵ einbezogen werden. Jedoch haben relativ wenige der biosynthetischen Gene funktionell charakterisiert ^4,5. Reversen Genetik Ansätze sind schwierig, da die Gene oft differentiell exprimiert werden, oft in geringen Konzentrationen, zwischen Zelltypen ^6. Außerdem sind mutierte Studien oft durch Gen-Redundanz oder kompensatorische Mechanismen behindert zur Gewährleistung einer angemessenen Zellwand Funktion ⁷ wird beibehalten. So neuartige Ansätze sind nötig, um schnell prägen die vielfältige Palette von Glykanstrukturen und funktionelle Genomik Ansätze zum Verständnis der Zellwandbiosynthese und Modifikation zu erleichtern.

Monoklonale Antikörper (mAbs) ^8,9 haben als ein wichtiges Instrument zur Bestimmung Glykan Struktur und Verteilung in Pflanzen entstanden. Diese erkennen distINCT Epitope in die Hauptklassen der pflanzlichen Zellwand Glykane, darunter Pektine, Xyloglucanen, Xylane, Mannane, Glucane und Arabinogalactane. Kürzlich ist ihre Verwendung im großen Maßstab Screening-Experimenten wurde erweitert, um die relative Häufigkeit von Glykanen in einer breiten Palette von Pflanzen-und Gewebetypen gleichzeitig ^9,10,11 bestimmen.

Hier präsentieren wir eine Microarray-basierte Glykan Screening-Methode aufgerufen Umfassende Microarray Polymer Profiling (Kompp) (Abbildungen 1 und 2) ^10,11, die mehrere Proben ermöglicht (100 Sek.) gescreent unter Verwendung einer miniaturisierten Microarray-Plattform mit reduzierter Reagenz-und Probenmengen werden. Die Spot-Signale auf dem Mikroarray kann formal quantifiziert werden, um semi-quantitative Daten über Glykan Epitop Auftreten zu geben. Dieser Ansatz wird auch zur Verfolgung Glykan Veränderungen in komplexen biologischen Systemen ¹² und bietet einen umfassenden Überblick der Zellwand Zusammensetzung geeignet vor allem, wenn Vorkenntnisse of ist nicht verfügbar.

Protokoll

Ein. Tissue Collection & Vorbereitung

1. Sammeln Sie 100 mg Frischgewicht Pflanzengewebe (ein Minimum von 10 mg Trockengewicht) in mindestens dreifacher Ausfertigung für jedes Gewebe von Interesse. Die folgenden Schritte beschreiben die Herstellung der Zellwand Material aus vegetativen Geweben. Im Falle der Lagerung Gewebe wird un-wanted Stärke enzymatisch, bevor mit der Extraktion von Zellwandpolymere wie zuvor beschrieben ¹³ entfernt.
2. Homogenisierung der Proben zu einem feinen Pulver mit flüssigem Stickstoff unter Verwendung eines Qiagen TissueLyser II, mit 24 Rohradapter Sets und 3 mm Wolframcarbid Kügelchen (30 Hz, 2 x 30 Sekunden). Alternativ, wenn nur wenige Proben verarbeitet werden, ist ein Mörser und Stößel genutzt.
3. Übertragen Sie die Homogenate in 10 ml Kunststoff-konische Röhrchen.
4. Planen Zellwandmaterial durch Waschen der Homogenate in 10 ml 80% v / v Ethanol bei RT und Vortexen kräftig für 2 min.
5. Zentrifuge Proben bei 3.500 xg und Überstand verwerfen. Wiederholen der 70% Ethanol wäscht mindestens dreimal oder bis der Überstand klar ist, insbesondere für Gewebe enthalten Chlorophyll.
6. Führen Sie eine letzte Wäsche mit 100% Aceton und lassen Sie die Pellets mit Alkohol unlöslichen Rückständen (AIR) an der Luft trocknen über Nacht.
7. Die Luftproben Sieb mit einer Maschenweite 0,4 mm ^2, um ein feines, homogenes Pulver zu erreichen und zu entfernen größeren, schlecht gemahlenen Partikel, die irgendwann verbleiben im Homogenat.
8. 10 mg wiegen AIR Probe in Mikroröhrchen auf, jeweils mit einem 3 mm Glasperlen, um das Mischen der Proben zu erleichtern.

2. Extraktion von Zellwand Glykane

1. Pektinen, und Polymere mit Pektine zugeordnet sind, aus den Proben durch Zugabe von 500 ul 50 uM CDTA (pH 7,5) zu jeder Probe extrahiert.
2. Vortexen die Rohre zu gewährleisten, ist das Lösungsmittel in Kontakt mit dem Probenmaterial und dann Mischen mit der TissueLyser 3 h bei 8 Hz.
3. Zentrifuge Proben bei 12.000 xg, sorgfältig reMove der Überstände und bei 4 ° C.
4. Waschen Pellets in 1 ml deionisiertem Wasser zu verdünnen und entfernen Sie alle verbleibenden Lösungsmittel, Wirbel und Zentrifuge bei 13.000 x g. Wiederholen Sie diesen Schritt, ohne das Pellet und entfernen Sie die gesamte Flüssigkeit aus den Rohren, bevor Sie den nächsten Schritt.
5. Vernetzen Glycane werden sequentiell von der verbleibenden Zellwand Pellet mit 500 ul 4 M NaOH extrahiert mit 0,1% w / v NaBH4, nach dem gleichen Verfahren in den Schritten 2.1 beschrieben - 2,4 für die Extraktion CDTA. NaBH ₄ zugegeben, um den Aldehyd (oder Keto)-Gruppe am reduzierenden Ende der Polysaccharide zu einer Alkohol wodurch Basis Schälen von Polysacchariden zu reduzieren.
6. Nach Zentrifugation werden Überstände wieder entfernt, gelagert bei 4 ° C, und die Pellets zweimal in deionisiertem Wasser, bevor zum nächsten Extraktion.
7. Als optionaler Schritt werden restliche Polymere wie Cellulose mit 500 ul cadoxen (31% v / v 1,2-diamin extrahiertennoethane mit 0,78 M CdO) nach dem gleichen Verfahren wie in den Schritten 2.1 beschrieben - 2.4. Alternativ können absolute Zellulose Inhalt verbleibenden Pellets ermittelt Acetic / Nitric Assays (siehe Diskussion) werden.

3. Printing Microarrays

1. Centrifuge Überstände, die Zellwandpolymere bei 13.000 xg gewonnen, um Partikel zu entfernen.
2. Legen Sie 50 ul jeder Probe in ein Polypropylen-384-Well Mikrotiterplatten mit einem pre-designed benutzerdefinierte Layout, wo Proben nach Gewebetyp und Extraktionstyp angeordnet sind.
3. Verdünnen Sie die Zellwandpolymer Probe in einer 0, 5 und 25 × seriellen Verdünnungsreihe mit destilliertem Wasser.
4. Parameter wie Pin Höhe, Erhebung und Verweilzeit und Waschschritte sind auf der Software-Steuerung des Microarrayer gesetzt.
5. Die Feuchtigkeit der Druckkammer wird mit 60% gesteuert wird, um Verdunstung zu verhindern Probe.
6. Der Druckauftrag wird gestartet mit LabNEXT software und ein Programm, das auf dem Mikroarray Layout entspricht.
7. Der Roboter verwendet Kapillarkanal Stifte, um Lösungen aus der Probe Platte auf 20 x 20 cm Nitrozellulosemembran, die zu einer flachen Platte in der Maschine befestigt ist gedruckt. Jeder Punkt auf dem Array enthält 15 nl einer Lösung und ist in dreifacher Ausfertigung gedruckt.
8. Identische Microarrays werden nebeneinander auf der Membran und Schnitt in einzelnen Arrays gedruckt, nachdem der Druckauftrag abgeschlossen ist.
9. In jedem Versuch die Arrays können modifiziert werden, um mehr oder weniger Proben, Verdünnungen oder repliziert unterzubringen.

4. Sondierung Glycan Microarrays

1. Nach dem Drucken, blockieren die einzelnen Mikroarrays in 5% w / v Magermilchpulver in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (MPBS) bei Raumtemperatur für 2 Stunden, um die unspezifische Bindung zu reduzieren.
2. Sonde Mikroarrays mit monoklonalen Antikörpern, die für Zellwand-Glykan Epitope für 2 Stunden in MPBS. Die Mehrzahl der monoklonalen antibOdies gegen Zellwand Glycane sind kommerziell von drei Unternehmen; Biosupplies ( www.biosupplies.com.au ), Carbosource Services ( www.carbosource.net ) und PlantProbes ( www.plantprobes.net ).
3. Einschließen Negativkontrolle, ein Mikroarray mit nur MPBS und keine primären Antikörper inkubiert.
4. Waschen der Mikroarrays 3mal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 5 min auf unspezifische Bindung zu entfernen.
5. Sonde der Mikroarrays mit sekundärem Antikörper, konjugiert an Meerrettichperoxidase (HRP) in MPBS für 2 Stunden. Die meisten monoklonalen Antikörper gegen Zellwand Glykane erfordern anti-Maus oder anti-Ratte Sekundärantikörper.
6. Wiederholen Waschschritte 3 mal mit PBS-Puffer für 5 min auf unspezifische Bindung zu entfernen.
7. Entwickeln Sie die Microarrays mit chromogenen (3,3-Diaminobenzidin) oder chemiluminecent (Luminol) Substraten.

5. Quantifizierung

1. Nach der Entwicklung, scannen die einzelnen Mikroarrays mit einem hochauflösenden (1.200 dpi) Desktop-Scanner und speichern Sie die Bilder als negativ, 16-Bit-TIFF-Dateien (Abbildung 3).
2. Berechnen Sie die integrale Intensität jedes Spots mit Xplore Image Processing Software (LabNEXT) mit einem automatisierten Raster-Werkzeug ausgestattet. Das Integral Spotintensität wird aus der Summe der Pixel in der Umgebung jeder Rasterfläche Spot stammt.
3. Die Grid-Daten für jeden Mikroarray als txt-Datei exportiert und kann manuell in eine Excel-Tabelle zur Analyse importiert werden. Eine Online-Werkzeug ( http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/ ) wurde entwickelt, um automatisch zu übersetzen und verarbeiten Daten einzelner txt Dateien.
4. Der integrierte Spotintensität wird über Druck repliziert gemittelt und Verdünnungen, eine "Kassamittelkurs erhaltenIntensität "Wert für jede Probe (Abbildung 2). Alternativ werden spot Signale entsprechend nur einem Verdünnungswert auf dem Array verwendet werden, um die relative Abundanz Glycan Epitop für jede Probe zu quantifizieren.
5. Die relative mittlere Spotintensitäten zwischen verschiedenen Proben werden als Heatmap (Abbildung 4) mithilfe der bedingten Formatierung in Excel oder online HeatMapper Werkzeuge (präsentiert http://bar.utoronto.ca/welcome.htm ). Die Daten für jeden Antikörperart wird auf 100 korrigiert und eine 5% Cutoff-Wert enthalten sind die Hintergrundsignals und Fehlalarme zu entfernen.

Ergebnisse

Die relative Häufigkeit von Glykanen in sechs Gewebetypen (Anthere Filamente, Pollen, Ovarien, Petalen, Sepalen und Stigmatisierung) von Nicotiana alata Blüten wurde mit Kompp. 3A zeigt eine repräsentative Mikroarrays mit mAb JIM5 spezifisch für teilweise (niedrig) methylesterified Homogalacturonan (HG), ein Epitop, das auf pektischen Polysacchariden ¹⁴ auftritt wurde sondiert. Die JIM5 Epitop in CDTA Extrakten aller Blütengeweben detektiert jedoch ist am höchsten in Pollen und niedrigsten in s...

Diskussion

Kompp ist eine schnelle und sensitive Methode zur Profilierung der Glycan Zusammensetzung von Hunderten pflanzlichen Proben in einer Angelegenheit von Tagen. Diese Methode ergänzt die bereits vorhandenen bakteriellen oder Säugetier-Glykan Array-Plattformen für das Hochdurchsatz-Screening von Kohlenhydrat-Wechselwirkungen mit Glycan-bindende Proteine ​​wie Lektine, Rezeptoren, Antikörper und ^16. Mit einer großen Vielfalt von Sonden zur Erkennung von Zellwand Glykane, ist es möglich, detaillierte Info...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
3 mm Hartmetall Perlen	Qiagen	69997
Sammlung Mikroröhrchen (1,2 mm)	Qiagen	19560	1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen können ebenfalls verwendet werden
Qiagen TissueLyser II	Qiagen	85300
3 mm Glaskugeln	Sigma Aldrich	Z143928
CDTA	Sigma Aldrich	34588
Cadmiumoxid	Sigma Aldrich	202894
1,2-Diaminoethan	Sigma Aldrich	03550
Nitrozellulosemembran (0,22 um Porengröße)	GE-Water & Process Technologies	EP2HY00010	unterschiedlichen Porengröße Membranen sind für verschiedene Pin-Typen geeignet
Xact II Microarrayer Roboter	Labnext	001A	die Xact II Roboter wurde mit einem benutzerdefinierten 20 x 20 cm Keramikplatte auf die die Nitrozellulosemembran gebunden ist eingepasst
Xtend RM Microarray Stifte	Labnext	0037-350	Pins müssen für das Auffinden von Membranen geeignet
384-Well-Mikrotiterplatten (Polypropylen)	Greiner	781207
Anti-Glycan monoklonalen Antikörpern	Pflanzen Probes / CarboSource / Biosupplies		Websites; PlantProbes ( www.plantprobes.net ), Carbosource (ww.carbosource.net "target =" _blank "> www.carbosource.net) und Biosupplies ( www.biosupplies.com.au ).
Anti-Ratten-IgG (ganze Molekül) - Peroxidase-Antikörper in Ziegen hergestellt.	Sigma	A9037	die Art der Sekundärantikörper hängt von der primären Antikörper verwendet (z. B. in Ratten-, Mäuse, Ziegen usw. erhöht).
SIGMA FAST 3,3 '-Diaminobenzidin Tabletten	Sigma	D4293	die Art des Entwicklungsreagens hängt von den sekundären Antikörper verwendet und das Nachweisverfahren (farbmetrischen oder chemiluminecent).
SuperSignal West Pico Chemilumineszenz Substrat	Thermoscientific	34080	siehe oben
Xplore Image Processing Software	LabNext	008	viele Software mit automatischer Gridding Werkzeuge stehen zur Verfügungum Pixelwert von Microarray-Spots zu messen.
Pflanzliche Polysaccharide	Sigma / Megazyme