Gleichzeitige Intrazelluläre Aufnahme eines Lumbar Motoneuron und dem Force durch seine Motor Unit in der adulten Maus Produziert<em&gt; In vivo</em

Zusammenfassung

Dieses neue Verfahren erlaubt die gleichzeitige intrazelluläre Aufnahme eines einzigen erwachsenen Maus Motoneuron und die Messung der Kraft, die von seiner Muskelfasern hergestellt. Die kombinierte Untersuchung der elektrischen und mechanischen Eigenschaften der Motoreinheiten in normalen und genetisch modifizierten Tieren ist ein Durchbruch für das Studium des neuromuskulären Systems.

Zusammenfassung

Das Rückenmark Motoneuron ist seit langem ein gutes Modell für die Untersuchung neuronaler Funktion, weil es ein Neuron des zentralen Nervensystems mit den einzigartigen Eigenschaften von (1) mit leicht identifizierbaren Ziele (die Muskelfasern) und daher eine sehr bekannte Funktion ist (die Muskelkontraktion steuern), (2) dass die konvergente Ziel vieler Wirbelsäulen-und absteigend Netzwerke, daher der Name "gemeinsame Endstrecke" und (3) mit einem großen soma, die es möglich, sie mit scharfen intrazellulären Elektroden eindringen lässt . Weiterhin, wenn es in vivo untersucht, ist es möglich, gleichzeitig aufnehmen die elektrische Aktivität der Motoneuronen und der Kraft, die durch ihre Muskelkraft Ziele entwickelt. Durchführen intrazelluläre Ableitungen von Motoneuronen in vivo daher legte den Experimentator in der einzigartigen Position, in der Lage zu studieren, zur gleichen Zeit, all die Fächer des "Motor-Einheit" (der Name des Motoneuron, dessen Axon unddie Muskelfasern es innerviert ^1): Die Eingänge Auftreffen auf die Motoneuronen, die elektrophysiologischen Eigenschaften der Motoneuronen, und die Auswirkungen dieser Eigenschaften auf die physiologische Funktion der Motoneuronen, also die Kraft, durch die Motor-Einheit produziert. Allerdings ist dieser Ansatz sehr schwierig, da die Zubereitung nicht sein kann gelähmten und damit die mechanische Stabilität für die intrazelluläre Aufnahme reduziert wird. So hat diese Art von Experimenten nur bei Katzen und Ratten erzielt worden. Jedoch könnte die Untersuchung der Wirbelsäule motorische Systeme stellen eine enorme Sprung wenn es möglich war, ähnliche Experimente in normalen und genetisch modifizierten Mäusen durchzuführen.

Aus technischen Gründen, die Untersuchung der Wirbelsäule Netzwerke in Mäusen meist hat für Neugeborene in vitro Präparaten, wo die Motoneuronen und die Wirbelsäule Netzwerke sind unreife beschränkt, werden die Motoneuronen von ihren Zielen getrennt, und wenn sie in Scheiben, die mo studierttoneurons werden von den meisten ihrer Eingänge getrennt. Bis vor kurzem waren nur ein paar Gruppen gelang es, intrazelluläre Ableitungen von Motoneuronen in vivo ^2-4 durchzuführen, einschließlich unserem Team, ein neues Präparat, das uns zu einer sehr stabilen Aufnahmen von Motoneuronen in vivo zu erhalten, in erwachsenen Mäusen ^5,6 erlaubt veröffentlicht. Allerdings wurden diese Aufnahmen in gelähmten Tieren, dh ohne die Möglichkeit, die Kraft Ausgang dieser Motoneurone aufzunehmen. Hier präsentieren wir eine Erweiterung dieser ursprünglichen Zubereitung, in denen wir waren in der Lage, um die gleichzeitige Aufnahmen der elektrophysiologischen Eigenschaften der Motoneurone und der Kraft, die durch ihre motorischen Einheit entwickelt zu erhalten. Dies ist eine wichtige Errungenschaft, da es uns um die verschiedenen Arten von Motoneuronen auf der Grundlage ihrer Kraft Profil zu identifizieren und damit Offenlegung ihrer Funktion ermöglicht. Gekoppelt mit genetischen Modellen stören Wirbelsäule segmentale Schaltung ^7-9 oder Reproduktions menschlichen disease ^10,11 rechnen wir diese Technik ein wesentliches Instrument für die Untersuchung der spinalen motorischen Systems.

Protokoll

Ein. Step One

Pre-Anästhesie Medikamente: 10-15 min vor der Einleitung der Narkose, injizieren Atropin (0,20 mg / kg) und methylprenidsolone (0,05 mg) subkutan den Speichelfluss und Ödeme bzw. zu verhindern.

2. Schritt Zwei

Narkoseeinleitung: injizieren Pentobarbital-Natrium (70 mg / kg) oder ein Gemisch von Ketamin / Xylazin (100 mg / kg und 10 mg / kg) intraperitoneal. Lassen Sie die Maus unter, bis keine toe Prise reflex erhalten werden können gehen. Wenn der Anästhesie scheint zu hell, mit 1/4 der Dosis ergänzen.

3. Schritt Drei

* Hinweis: Diese Operation ist ein Terminal Verfahren.

Wenn ein chirurgischer Ebene der Anästhesie erreicht wurde, übertragen Sie die Maus auf einer erhöhten warme Decke in Bauchlage.

1. Decken die Schnauze des Maus mit einer Maske liefert reines O ₂ mit einer Strömungsgeschwindigkeit etwa 100 ml / min.
2. Mit einem Haarschneider, rasieren die dorsale Region aus dem Nacken an der Basis des Schwanzes.
3. Rasur auch das Recht Hinterlauf.
4. Flip Maus Rückenlage, aber darauf achten, dass die Sauerstoffmaske an ihrem Platz bleiben.

4. Schritt Vier

Sichern Sie die Maus anstelle mit Nähten rund um die Glieder geschlungen und gesichert an den vier Ecken der Arbeitsfläche.

5. Schritt Fünf

Legen Sie einen Temperaturfühler, um die Maus Kerntemperatur überwachen. Passen Heizdecke / Lampenleistung auf Kerntemperatur zwischen 36 ° C und 38 ° C zu halten

6. Tracheotomie und Beatmung

1. Mit stumpfen Schere, einen Schnitt über die Luftröhre und ziehen die Haut weg auf beiden Seiten.
2. Mit stumpfen Pinzette, zerreißen die Speicheldrüsen, um so zwei dünnen Muskeln (M. sternohyoideus), die die Luftröhre aussetzen.
3. Mit stumpfen Pinzette, trennen die beiden muscles entlang ihrer medialen Trennung der Luftröhre zu offenbaren.
4. Mit Hilfe eines Dumont 7 Pinzette, schieben zwei Längen von 4,0 Seidennaht unter der Luftröhre.
5. Machen Sie eine transversale Schnitt in die Luftröhre zwischen zwei Knorpelringe aber darauf achten, nicht völlig Abschnitt der Luftröhre.
6. Legen Sie die Trachealtubus sich die Luftröhre, dann sichern Sie sie auf beiden Seiten der Einführöffnung durch Anbinden die Nähte über sie. Der Trachealtubus mit einer Maus Ventilator (SAR-830/AP, CWE Inc.) und einer Capnograph (μcapstar, CWE Inc.) verbunden. Das Beatmungsgerät angeschlossen ist, durch einen Compliance-Beutel, mit einer Quelle aus reinem O _2. Passen Sie die Parameter des Ventilators (Atemfrequenz 100-150 bpm, end-Tidalvolumen 170-310 ul), so dass die Maus nicht im Kampf gegen die künstliche Beatmung und die endexspiratorischen pCO ₂ ist zwischen 4 und 5% stabil.

7. Platzierung der intravenösen

1. Mit stumpf Techniken, aussetzen VenaAder auf einer Seite des Halses. Auf dieser Stufe teilt sich der Jugularvene in zwei große Stämme, die vordere und hintere Gesichtsvenen.
2. Führen Sie die folgenden Schritte zweimal, ein Set für jedes dieser Stämme:
   1. Mit Dumont 4 oder 5 Zangen, trennen Sie sorgfältig die Vene aus den umliegenden Bindegewebes.
   2. Mit Dumont 7 Pinzette, schieben zwei Längen von 6,0 Seidennähte unter der Vene. trennen sie so weit wie möglich entlang der Länge der Vene.
   3. Setzen Sie einen kleinen Behälter Clip auf der proximalen Seite der Vene (die Seite, die das Herz), und binden Sie die distale Seite der Vene.
   4. Mit sehr feinen Iris Schere, einen kleinen Querschnitt im Vene, unter größter Sorgfalt nicht Abschnitt der Vene komplett.
   5. Einfügen eines vorgefüllten 1Fr Katheter (premicath, Vygon) in der Öffnung, bis das Gefäß-Clip.
   6. Halten Sie die Vene und den Katheter zusammen in einem Dumont 4 Pinzette vorsichtig entfernen das Schiff Clip, und drücken Sie dann den Katheter ein paar more Millimeter in die Vene.
   7. Befestigen des Katheters durch das Binden mit beiden Nähte auf beiden Seiten der Insertion.
3. Einer der Katheter an eine Spritze oder eine Spritzenpumpe mit ergänzenden Dosen von Anästhetika Bedarfsfall (normalerweise alle 10-30 min). Injizieren Der IV beträgt entweder 6 mg / kg Pentobarbital-Natrium oder 1250 40 ug / kg / min von Ketamin / Xylazin ^12. Der andere Katheter wird an einer Spritzenpumpe für eine langsame intravenöse Infusion (50 ul / h) einer 4% Glucose enthaltenden Lösung NaHCO ₃ (1%) und plasmion (14%) verbunden.

8. Schließen Sie die Haut des Halses mit Nadel und Faden, und gibt die Maus Bauchlage

9. Dissektion der Hind-Schenkel Muskeln und Nerven

1. Mit Schere, einen Einschnitt von der Spitze des Oberschenkels der Achillessehne. Trennen Sie die Haut von den darunter liegenden Muskeln, kümmert sich nicht um die Blutgefäße schädigen. Kauterisieren nach Bedarf.
2. Identifizieren Sie die vordere Kante des Biceps femoris, die als weiße Linie liefen den Oberschenkel erscheint. Mit einer Schere vorsichtig entlang der Linie öffnen vom Knie bis hin zu den Hüftknochen. Trennen Sie die Muskeln. Der Ischiasnerv ist nun sichtbar unter dem Biceps femoris.
3. Sorgfältig sezieren die Biceps femoris. Cauterize / Ligatur wie notwendig, um Blutungen zu verhindern. Der Biceps femoris kann vollständig entfernt werden oder einfach zurückgelehnt, um den Ischiasnerv und die Triceps surae Muskeln freizulegen.
4. Sezieren das Sural Nerv.
5. Mit 8/0 Seidenfaden, binden den distalen Teil des Nervus peroneus communis und schneiden distal der Knoten. Sezieren die Nerven den ganzen Weg bis, so nah an der Hüfte wie möglich.
6. Identifizieren Sie die N. tibialis zwischen den peroneus communis und Sural Nerven. Unter den verschiedenen Zweigen des N. tibialis, identifizieren die Zweige innervieren den M. triceps surae von den Zweigen, die tiefer (im Folgenden als N. tibialis genannt) gehen.
7. Mit 8/0 SeideGewinde, zusammen binden alle Zweige des Nervus tibialis, während intakt zu halten die Zweige innervieren den M. triceps surae. Schneiden Sie den Nervus tibialis distal der Knoten und sezieren den Nerv so weit wie möglich.
8. Decken das gesamte Hinterlauf mit einem Gaze mit Kochsalzlösung getränkt, um Austrocknung zu verhindern, während Sie mit dem nächsten Schritt.

10. Laminektomie

1. Mit Schere, einen Einschnitt entlang des Rückgrats. Trennen Sie die Haut von den darunter liegenden Muskeln.
2. Make zwei Einschnitte auf jeder Seite der Wirbel um die subkutane Muskulatur trennen. Dann schneiden sich Sehne der Muskeln, die auf der Seite der Wirbelsäule auf jeder Seite anschließen.
3. Mit stumpfen Pinzette und einer feinen Kürette, entfernen Sie den Rest des Muskels auf der Rückenseite der Wirbel um die Dornfortsätze eindeutig zu identifizieren jeden einzelnen Wirbel.
4. Identifizieren Wirbeln T13 und L1. T13 ist der letzte Wirbel zu haben Rippen befestigt. Die Wirbelsäule will immobilisiert mit den Cunningham Spinal Cord Wirbelkörper Klemmen (Stoelting Co.) werden. Zeigen die spinalen Klammern auf jeder Seite des T13 und L1. Achten Sie darauf, das Rückenmark komprimieren, sondern setzen ein wenig Spannung in der Längsachse. Überprüfen Sie, dass die Wirbelsäule auch durch Drücken sanft mit einer Pinzette gesichert.
5. Mit feinen rongeurs, entfernen Sie die Dornfortsätze dann die Lamellen über T13 und L1, wodurch die Wirbelsäule.
6. Bedecken Sie den exponierten Rückenmarks mit kleinen Stückchen aus Baumwolle oder spongel mit Kochsalzlösung getränkt, um ein Austrocknen zu verhindern.
7. Legen Sie eine maßgeschneiderte Kunststoff-Bad auf der Rückseite, um das Rückenmark. Sichern Sie das Bad im Ort mit 4/0 seidenen Faden. Stellen Sie sicher, dass das Bad wasserdicht durch Versiegelung mit Kwik-Cast Dichtmittel (WPI) ist.
8. Sobald der Kwik-Cast getrocknet ist, entfernen Sie die Watte bedeckt das Rückenmark, und füllen Sie die Badewanne mit Mineralöl.
9. Mit Dumont 5 Zangen und sehr feine Iris Schere, sanft auf der Dura Kumpel ziehenr um ​​das Rückenmark, und öffnen Sie sie so weit wie möglich in beiden Richtungen. Falten Sie die Dura auf jeder Seite des Rückenmarks.
10. Senken der erhöhten Plattform, auf der die Maus liegend so zusammengestellt ist, damit es durch den Wirbelkörper Klammer suspendiert.
11. Verwenden Sie eine andere Wirbelsäule Klammer um einen Dornfortsatz des Sakralbereich den Rücken des Tieres unterstützt spannen.
12. Eine dritte Klemme verwendet wird, um das Recht Hinterbein und Knöchel immobilisieren, gebogen in einem 90 ° Winkel am Knie.

11. Achillessehne Dissection

1. Mit der Schenkel um 90 ° gebogenen am Knie und am Sprunggelenk, entfernen Sie die Gaze für den Hinterlauf Bereich und sezieren die Achillessehne frei von umgebenden Gewebe. Dissect so viel wie möglich der Triceps surae vom umgebenden Gewebe als gut.
2. Schneiden Sie die Sehne des plantaris Muskel in der Nähe der Kalkaneus, dann schneiden Sie es erneut, um die Sehne vollständig zu entfernen.
3. Mit einem Gewinde Nadel legen 6/0 Seidenfaden durch the Achillessehne und machen eine dreifache Knoten um die Sehne.
4. Legen Sie die Kraftaufnehmer in der Nähe der knoten, schneiden den distalen Teil der Sehne und befestigen Sie es an den Kraftaufnehmer mit dem seidenen Faden.
5. Legen Sie zwei Längen von Draht aus nichtrostendem Stahl unter der Faszie des Triceps surae Muskeln. Diese Drähte werden auf einer extrazellulären AC Verstärker für EMG-Aufzeichnung verbunden.
6. Setzen Sie den Nervus peroneus communis und N. tibialis auf zwei bipolare Haken Elektroden.
7. Setzen Sie den Triceps surae Nerven an der Kathode eines Hakens Elektrode, die Anode berühren einen nahe gelegenen Muskeln.
8. Schließen Sie alle stimulierenden Elektroden zu einer Isolierstation.
9. Platzieren einer Kugel Elektrode auf der dorsalen Fläche des Rückenmarks, mit einer extrazellulären Wechselstromverstärker zur Schnur Dorsum Potentiale aufzuzeichnen. Legen Sie eine Ag / AgCl-Referenzelektrode in Kontakt mit einem Rückenmuskulatur.

12. Schritt Zwölf

Stimulieren des Triceps surae NervenVerwendung einer 50 usec Rechteckimpuls zunehmender Intensität bei einer niedrigen Frequenz (<1 Hz), bis die maximale Amplitude twitch beobachtet wird. Bewegen Sie den Kraftaufnehmer den Muskel zu dehnen, während die Überwachung der Amplitude des Zuckungsantwort bis das Zucken Amplitude ein Maximum erreicht.

13. Intrazelluläre Aufnahmen von Motoneuronen

Von diesem Zeitpunkt an werden Standard elektrophysiologischen Techniken verwendet werden, um eine intrazelluläre Elektrode herzustellen, dringen ein Neuron im Rückenmark und identifizieren es als ein Motoneuron.

1. Ziehen Sie einen Glasmikropipette zu einer ~ 1 um tip mit einer Pipette Puller (P-97 Feinpipettenziehvorrichtung, Sutter Instruments). Füllen Sie die Elektrode mit einem KCl 3M-Lösung (Widerstand der Elektrode 10-20 MOhm).
2. Mit einem Mikropositionierer, fahren die Mikropipette, verbunden mit einem intrazellulären Verstärker (Axoclamp 2B, Axon Instruments) in das Rückenmark. Überwachen Sie die lokalen Feldpotentiale hervorgerufen durch die Stimulation von each Nerven, um die Fahrbereitschaft des Triceps surae zu lokalisieren.
3. Vorsichtig nähern putativen Motoneuronen während der Überwachung des Widerstandes der Mikroelektrode. Beim Schieben gegen eine Membran, steigt der Widerstand. Penetration kann irgendwann mit der "Buzz"-Funktion des intrazellulären Verstärker erleichtert werden.

14. Euthanasie Procedure

Am Ende des Versuchs wird das Tier durch eine Überdosis Pentobarbital (210 mg / kg IV), gefolgt durch Enthauptung getötet.

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Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt, wie ein Motoneuron aus dem Triceps surae Gruppe nach dem Eindringen zu identifizieren. Bei niedrigen Stimulationsintensität, kann nur ein monosynaptischen EPSP (Abbildung 1A). Bei höheren Intensität könnte der EPSP groß genug sein, um eine "orthodromen" spike (1B) auszulösen. Bei noch höheren Stimulationsintensität, erscheint eine Alles-oder-Nichts-antidrome Spitze, mit einer kürzeren Latenzzeit als die monosynaptischen EPSP

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Diskussion

Die Herstellung hier beschrieben ist das erste, das erlaubt, in der erwachsenen Maus, simultane Aufzeichnung eines intrazellulären lumbalen Motoneuron und die Messung der Kraft, die durch den Muskelfasern durch seine Axon innerviert hergestellt.

Aufgrund der kleinen Größe des Tieres können die chirurgischen Fähigkeiten für diese Zubereitung zu schwierig zu erwerben. Sobald jedoch diese Fähigkeiten beherrscht werden, kann die gesamte Operation in drei Stunden durchgeführt werden, und ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
Atropinsulfat	Aguettant
Methylprenidsolone	Pfizer	Solu-Medrol
Natriumpentobarbiton	Sanofi-Aventis	Pentobarbital
Ketamin
Xylazin
Glucose
Plasma-Expander	Roger Bellon	Plasmagel
Blunt Scheren	FST	14079-10
Blunt feinen Schere	FST	15025-10
Vannas Federschere	FST	15002-08
Feinen Pinzette gezahnt	FST	11370-32
Feinen Pinzette gezahnt	FST	11370-31
Cunningham Spinal Adapter	Stoelting Co.
Kwik-Cast Dichtstoff	WPI	# KWIK-CAST
Ventilator	CWE Inc	SAR-830/AP
Kapnograph	CWE Inc	μcapstar
Heizdecke	Harvard Apparatus	507221F
Intrazelluläre Verstärker	Axon Instruments	Axoclamp 2B
Pipette puller	Sutter Instruments	P-97
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G