Nicht-invasive optische Abbildung des lymphatischen Gefäßsystem eines Maus

Holly A. Robinson; SunKuk Kwon; Mary A. Hall; John C. Rasmussen; Melissa B. Aldrich; Eva M. Sevick-Muraca

doi:10.3791/4326

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In diesem Artikel

Zusammenfassung
Zusammenfassung
Protokoll
Ergebnisse
Diskussion
Offenlegungen
Danksagungen
Materialien
Referenzen
Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Kürzlich entwickelte Bildgebungsverfahren mittels Nah-Infrarot-Fluoreszenz (NIRF) kann helfen erläutern die Rolle spielt das Lymphsystem in Krebsmetastasen, Immunantwort, Wundheilung und anderen lymphatischen-assoziierten Krankheiten.

Zusammenfassung

Das lymphatische Gefäßsystem ist ein wichtiger Bestandteil des Kreislaufsystems, die Flüssigkeitshomöostase unterhält, bietet Immunüberwachung und vermittelt Fettaufnahme im Darm. Doch trotz seiner kritischen Funktion gibt es vergleichsweise wenig Verständnis dafür, wie das lymphatische System passt sich diese Funktionen in Gesundheit und Krankheit ¹ dienen. Vor kurzem haben wir die Möglichkeit, dynamisch image lymphatischen Architektur und Lymphe "Pumpen"-Aktion in normalen menschlichen Probanden sowie Personen, die unter lymphatischen Funktionsstörungen mit trace Verabreichung einer Nah-Infrarot-Fluoreszenz (NIRF) Farbstoff und eine benutzerdefinierte gezeigt, Gen III- intensiviert Bildgebungssystem ^2-4. NIRF Bildgebung zeigten dramatische Veränderungen in den lymphatischen Architektur und Funktion mit menschlichen Krankheiten. Es bleibt unklar, wie sich diese Veränderungen auftreten und neue Tiermodelle entwickelt, um ihre genetischen und molekularen Grundlagen aufzuklären. In diesem Protokoll präsentieren wir NIRF Lymph-, sMall tierischen Bildgebung mit ^5,6 Indocyaningrün (ICG), ein Farbstoff, der für 50 Jahre bei Menschen ⁷ verwendet wurde, und eine NIRF Farbstoffmarkiertes cyclischen Albumin-Bindungsdomäne (CABD-IRDye800) Peptid, vorzugsweise an Maus und Human-Albumin ⁸ . Etwa 5,5 mal heller als ICG hat Abd-IRDye800 eine ähnliche lymphatischen Lichtraumprofil und kann in kleineren Dosen als ICG ausreichende NIRF Signale für bildgebende ^{8 zu} erreichen injiziert werden. Da sowohl Abd-IRDye800 und ICG binden an Albumin im interstitiellen Raum ^8, können sie sowohl aktive Protein-Transport in die und innerhalb der Lymphgefäße darstellen. Intradermale (ID) Injektionen (5-50 ul) von ICG (645 pM) oder CABD-IRDye800 (200 pM) in Kochsalzlösung werden dorsal jedes Hinterpfote und / oder der linken und rechten Seite der Basis des verabreichten Schwanz eines Isofluran-Narkose Maus. Die resultierende Farbstoffkonzentration im Tier ist 83-1,250 ug / kg für ICG oder 113-1,700 ug / kg für'Abd-IRDye800. Unmittelbar nach Injektionen, wird die funktionale lymphatischen Bildgebung für bis zu 1 Stunde mit Hilfe einer angepassten, kleines Tier NIRF Imaging-System durchgeführt. Ganztier räumliche Auflösung darstellen kann fluoreszierenden Lymphgefäßen von 100 Mikron oder weniger, und Bilder von Strukturen bis zu 3 cm tief erworben ⁹ werden. Die Bilder werden aufgenommen mit V + +-Software analysiert und mit ImageJ oder MATLAB-Software. Während der Analyse werden aufeinander Regions of Interest (ROI), die die gesamte Gefäßdurchmesser entlang einer vorgegebenen Lymphgefäß gezogen. Die Abmessungen für jeden ROI konstant gehalten werden für ein bestimmtes Schiff und NIRF Intensität für jeden ROI gemessene die quantitative Erfassung "Pakete" von Lymphe Bewegen durch Gefäße.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Standards der University of Texas Health Science Center (Houston, TX), Abteilung für Vergleichende Medizin und Zentrum für Molekulare Bildgebung nach Prüfung und Genehmigung des Protokolls durch ihre jeweiligen Institutional Animal Care durchgeführt und Verwenden Ausschuss (IACUC) oder Animal Welfare Committee (AWC).

Ein. Vorbereitung der Tiere 24 Stunden vor dem Imaging

Die folgenden Schritte müssen getan (bei Bedarf) am Tag vor lymphatischen Abbildung erfolgt.

Tier in einer Induktion Box und sedate mit Isofluran.
Sobald das Tier in einen Zustand tiefer Narkose (überwachten mit Vorspur Pinch Manöver), Ort sedierten Tieren auf einer Windel / Flusen-Pad und der Position der Nase in einem Nasenkonus verbunden Isofluran Gas.
Clip alle Haare / Fell (falls vorhanden) in der Umgebung abgebildet werden soll.
Bewerben Enthaarungsmittel (NAIR) an der zugeschnittenen und lassen Sie es on die Haut für bis zu 3 min.
Wischen Sie alle Enthaarungsmittel mit warmen, feuchten Gaze oder Papiertuch.
Vorsichtig spülen Sie die Haut mit warmem Wasser und sanft trocknen Sie den Bereich mit Gaze oder einem Papiertuch.
Damit sich die Tiere auf einem Heizkissen oder unter einer Wärmelampe zu erholen, und kehren zu ihrem Käfig.

2. Day of Imaging

Rekonstituieren Bildgebungsmittel mit sterilem Wasser, dann verdünnt mit sterilem, normal (0,85%) Salzlösung bis 645 pM (5 &mgr; g/10 ul) für ICG oder 200 pM (6,8 &mgr; g/10 ul) zum CABD-IRDye800 erreichen. Halten Lösungen im Dunkeln Bedingungen und innerhalb von 6 Stunden nach der Rekonstitution.
Tier in einer Induktion Box und sedate mit Isofluran.
Sobald das Tier in einen Zustand tiefer Narkose (überwacht mit Toe-Prise Manöver), Ort sedierten Tier auf einer Seite auf eine Windel / Flusen Pad und Position Nase in einem Nasenkonus mit Gas Isofluran.
Schalten Sie das Licht (so der Raumdunkel). Falls erforderlich, kann ein kleiner Schreibtisch Halogenlicht für eine geringe Lichtmenge auf Injektionen siehe verwendet werden.
Verwendung eines Insulin-Spritze mit einer 31-Gauge-Nadel, injizieren ID 5 bis 50 ul ul ICG-oder CABD IRDye800 im dorsalen jedes Hinterpfote und / oder auf der linken und rechten Seite der Basis des Schwanzes, abhängig von der Bereich von Interesse (siehe Diskussion). Jede Dosis kann injiziert 0,083-1,25 mg / kg (ICG) oder 0,113 bis 1,7 mg / kg (CABD-IRDye800) reichen. Injektionsvolumina wird mit tierischen Anspannung und Injektionsstelle variieren. Für athymischen Mäusen, kann das Volumen der Einspritzung 5 ul (Hinterpfote) oder 10 ul (Rutenansatz) sein. Wenn das Tier nicht unter dem Bildgebungssystem für die Injektion (en) werden die Tiere unter dem Bildgebungssystem unmittelbar nach dem Injektion (en).
Wenn keine Farbstoffaufnahme in die Lymphbahnen zu sehen ist, wird Schritt 2.5 wiederholt zu werden brauchen, wie pro Tier-Protokoll benötigt.
Sobald Lymphbahnen zu sehen sind, die Injektionsstelle mit schwarzem Isolierband oder schwarz paper.
Erwerben lymphatischen Bilder für bis zu 1 Stunde unter Verwendung von V + +-Software und ein kleines Tier, NIRF Bildgebungssystems. (Tiere mit Isofluran sediert und Respirationen werden überwacht, während Bilder zu erwerben sind.) Während kleine Tier, NIRF Imager sind kommerziell erhältlich, nutzen wir eine angepasste Kleintier NIRF Abbildungssystem, bestehend aus einem 785-nm-Laserdiode (1005-9mm-78.503 , Intense, North Brunswick, NJ) mit einer asphärischen Linse (C24TME-B, Thorlabs, Newton, NJ), Diffusor (ED1-C20, Thorlabs) ausgestattet, und Filter (LD01-785/10-25, Semrock, Rochester, NY ), um eine gleichmäßige Anregung Feld, das Tier mit einem Einfallswinkel beleuchtet Fluenz von weniger als 1,4 mW pro Quadratzentimeter ^10. Ein Elektron Multiplikation Charged-Coupled-Gerät (EMCCD, PhotonMax512, Princeton Instruments, Trenton, NJ)-Kamera-System mit zwei 830-nm-Filter (AND11333, Andover Corp, Salem, NH) und einem 28-mm-Nikkor-Objektiv (1992, Nikon, Melville, NY) verwendet, um Bilder mit lymphatischen Integration tim einzufangenes von 200 ms für dynamische Bildgebung und 800 ms für statische Bildgebung ^5. Siehe Abbildung 1 für die Systemkonfiguration, die Tabelle für weitere Details der einzelnen Komponenten und die Diskussion für eine kurze Diskussion der wichtigsten Imager Eigenschaften.
Damit sich die Tiere auf einem Heizkissen oder unter einer Wärmelampe erholen und wieder in ihren Käfig oder einschläfern.
Analysieren von Bildern mit ImageJ oder MATLAB-Software. Siehe Abbildung 6.