Laser-Schädigung der Zebrafisch Embryonale Skeletal Muscle

Zusammenfassung

Die hier vorgestellte Methode umfasst die genaue Verletzung des Lebens Zebrafischembryonen mit hochenergetischer Laserpulse und der anschließenden Analyse dieser Verletzungen und deren Wiederherstellung mit der Zeit. Wir zeigen auch, wie genetisch markierten einzelne oder Gruppen von Skelettmuskelzellen kann während und nach der Laser-Licht induzierten Schäden verfolgt werden.

Zusammenfassung

Verschiedenen experimentellen Ansätze wurden in Maus verwendet worden, um Muskelverletzung mit dem Ziel, Muskelregeneration studieren, einschließlich myotoxin Injektionen (Bupivacain, Cardiotoxin oder notexin), Muskel Transplantationen (Denervierung-devascularization induzierte Regeneration), intensive Bewegung zu induzieren, sondern auch murine Modelle Muskeldystrophie wie der mdx-Maus (für eine Überprüfung dieser Ansätze siehe ^1). Im Zebrafisch beinhalten genetische Ansätze Mutanten, die Phänotypen Muskeldystrophie (wie Runzel ² oder sapje ³⁾ aufweisen und Antisense-Oligonukleotid, das die Expression Morpholinos der Dystrophie-assoziierten Genen ⁴ blockieren. Außerdem sind chemische Ansätze auch möglich, z. B. mit Galanthamin, eine chemische Verbindung Hemmen Acetylcholinesterase, wodurch hypercontraction, die schließlich führt zu Muskeldystrophie ^5. Allerdings, genetische und pharmakologische Ansätze generally betreffen alle Muskeln innerhalb eines einzelnen, während das Ausmaß der körperlich zugefügten Verletzungen leichter kontrolliert werden räumlich und zeitlich ^ein. Lokalisierte Körperverletzung erlaubt die Beurteilung der kontralateralen Muskel als interne Kontrolle. Tatsächlich haben wir kürzlich Laser-vermittelte Zell-Ablation zur Skelettmuskel Regeneration im Zebrafischembryo ⁶ studieren, während eine andere Gruppe kürzlich berichteten über die Verwendung eines Zwei-Photonen-Laser (822 nm) bis sehr lokal beschädigt Plasmamembran der einzelnen embryonalen Zebrafisch Muskel Zellen ^7.

Hier berichten wir über eine Methode für die Verwendung der Mikrospitze Laser (Andor Technology) für Skelettmuskel Zellschädigung im Zebrafisch. Die Mikrospitze Laser ein Hochenergielaser die geeignet Zielzelle Ablation bei einer Wellenlänge von 435 nm ist. Der Laser ist mit einem Mikroskop verbunden (in unserem Setup, einem optischen Mikroskop von Zeiss) auf solche Weise, dass das Mikroskop gleichzeitig f genutzt werden kannoder Fokussierung des Laserlichts auf der Probe und zur Visualisierung der Auswirkungen der Verwundung (Hellfeld oder Fluoreszenz). Die Parameter zur Steuerung Laserpulse umfassen Wellenlänge, Intensität und Anzahl der Impulse.

Aufgrund seiner Transparenz und externe Embryonalentwicklung, ist die Zebrafisch-Embryos sehr zugänglich sowohl für Laser-induzierten Verletzungen und zur Untersuchung der anschließenden Erholung. Zwischen 1 und 2 Tagen nach der Befruchtung, somitic Skelettmuskelzellen fortschreitend unterziehen Reifung von anterior nach posterior durch die Progression der Somitogenese aus dem Kofferraum zum Heck ^{8, 9.} Bei diesen Stufen, Embryonen spontan zucken und zu initiieren Schwimmen. Der Zebrafisch vor kurzem als ein wichtiges Wirbeltier Modellorganismus zur Untersuchung der Geweberegeneration erkannt worden, da viele Arten von Geweben (Herz, neuronale, vaskulären etc.) kann nach einer Verletzung im erwachsenen Zebrafisch ^{10, 11} regeneriert werden.

Protokoll

Ein. Kennzeichnung Einzelzellen

Injizieren Eins-Zellen-Embryos mit einem Plasmid oder einem GFP GFP-Fusionsprotein unter der Kontrolle eines β-Actin-Promotor. Während der Entwicklung wird GFP dann in einem Mosaik Weise exprimiert. Hier haben wir das transgene Konstrukt Tg [β-Aktin: α-actinin-GFP], welche Orte die α-Actinin-GFP-Fusionsprotein unter der Kontrolle des β-Aktin-Promotors.

2. Embryo Embedding

1. Sammle Zebrafischembryonen und pflegen unter normalen Bedingungen bis 28 hpf (Staging nach ^12).
2. Dechorionate Embryonen unter dem Stereomikroskop mit einer Pinzette (Dumont # 5).
3. Bereiten Sie einen Objektträger mit einer Vaseline Ring.
4. Eine 1% mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose / 10% Tricain Lösung mit E3-Medium: 100 mg Sieden Agarose in 10 ml E3-Lösung, um eine flüssige und homogene Agarose Lösung zu erhalten; Aliquot und lagernunbenutzten Agarose-Lösung bei -20 ° C für die weitere Verwendung. Für den sofortigen Einsatz, lassen Sie die gekochte Lösung abkühlen und halten bei max. 39 ° C. Hinzufügen Tricain Stammlösung, um eine Endkonzentration von 10% Tricain erhalten. Beide Tricain und Agarose sind notwendig, um embryonale Bewegungen zu verhindern.
5. Einbetten eines einzigen Embryos in 1% niedrig schmelzender Agarose / 10% Tricain / E3 Medium innerhalb der Vaseline Ring, mit der Embryo über natürlich auf der Seite; vorsichtig mit einem Deckglas abdecken, nur um den Embryo in Position zu halten und um eine konvexe vermeiden Oberfläche, die das Licht brechen würde. Idealerweise sollte der embryonalen Muskelgewebe, die gezielt werden berühren das Deckglas.

3. Embryo Laser-Verwundung

1. Bereiten Sie die Mikrospitze Laser und Mikroskop:
   1. Bitte beachten Sie die Mikrospitze Laser Handbuch für detaillierte Anleitungen zum Einrichten und Verwenden der Laser in Verbindung mit dem Mikroskop.
   2. Wählen Sie den richtigenFarbstoff zur Erzeugung einer Wellenlänge 435 nm Laserstrahl.
   3. Passen Sie die Laserleistung durch die Dämpfung Schieberegler. Die Laserleistung sollte stark genug sein, um eine Glasoberfläche mit einem einzigen Impuls (zB Fokus auf dem Deckglas Ihrer Probe, dies zu testen) brechen. Dies ist die Laserleistung für Ablation Zelle erforderlich.
2. Konzentrieren Sie sich auf die Region oder Zelle von Interesse über das Absehen in das Okular des Mikroskops eingebaut. Verwenden Sie ein 20x-Objektiv (40x wird genauer Schäden ermöglichen, aber oft der Arbeitsabstand ist nicht ausreichend für dieses Objektiv).

Anmerkung 1: Der Laser wird nicht nur schädigen Zellen innerhalb der Fokusebene, aber auch Zellen, oberhalb und unterhalb, die innerhalb des Laserstrahls sind. Stellen Sie sicher vor dem Experiment, dass der Laser optimal aufgebaut und angepasst für eine maximale Fokus innerhalb der z-Achse. Am besten ist es, um die Tiefe des Lasers Schädigung vor der Durchführung des Experiments, um zu wissen, zu bestimmen, welche Zelles genau verletzt werden.

3. Richten Sie das Licht für die Visualisierung des Experiments benötigt: Hellfeld für den normalen Gebrauch oder Fluoreszenz, wenn Targeting einen fluoreszenzmarkierten Zelle.
4. Senden eines Impulses von Laserlicht an die Zielregion oder mehrere Impulse, abhängig von dem gewünschten Grad der Verletzung.

4. Analyse der Verwundung und Recovery

1. Falls gewünscht, kann das Verfahren der Laser-Schädigung lebenden (zB unter Verwendung des Stroms Akquisition Option des Metamorph Software). ⁶ aufgezeichnet werden
2. Unmittelbar nach der Verletzung sollte der Embryo vorsichtig aus dem Agarose entfernt werden mit einer Pinzette und zurück in Ei Wasser für Erholung gelegt.

Anmerkung 2: Muskulös Aktivität (Schwimmen und Zuckungen) ist besonders wichtig für Skelettmuskel Erholung. Da der Embryo kann nicht wegen Tricain Exposition und der steifen Agarose Einbettung zu bewegen, ist es nicht EMPFEHLUnded die Embryonen zwischen Objektträger und Deckglas zu lange zu halten.

3. Nach der Bergung kann der Embryo fixiert und analysiert werden, wie gewünscht durch Licht-, Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskopie, wie angegeben.

Ergebnisse

Laser-vermittelte Verletzung wurde an immobilisiertem 1 Tag alten Embryonen durchgeführt. Wie in 1 gezeigt, kann ein paar Laserimpulse erzeugen eine kleine Wunde, leicht erkennbar an der beschädigten, gedreht, Actin-reiche Myofibrillen, die normalerweise zwischen den somite Grenzen gestreckt wird. Eine höhere Anzahl von Laserpulsen wird jedoch in einem massiv geschädigt somite Block, wo die meisten Myofibrillen zerstört führen. Dennoch können wir buchstäblich beobachten, dass "Zeit alle Wun...

Diskussion

Laser-vermittelte Verletzung ist eine leistungsfähige Methode zur zuzufügen Wunden einer gewünschten Größe durch Abtragen Zellen, um die Regeneration unter kontrollierten Bedingungen in der Zebrafisch-Embryos zu studieren. Bemerkenswert ist, können die Zellen genau ausgerichtet werden (Abbildung 2) und beide die Verletzung Bereich sowie Zeitpunkt gesteuert werden kann. Anschließend werden die verletzte Stelle und Regeneration Prozesse einfach überwacht, aufgezeichnet (Abbildung 3)

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heizblock
Paar Nr. 5 Zangen	Dumont
Glasobjektträger	Menzel		76 x 26 mm
Deckgläser	Roth		50 x 24 mm # 1
Vaselin
Stereomikroskop	Leica		MZFLIII
Micropoint Laser	Andor Technology
Fluoreszenzmikroskop	Zeiss		Axioplan II
Metamorph-Software	Molecular Devices
			Reagenzien Niedrigschmelzende Agarose (# 50081,Lonza) Tricaine Stammlösung: 400 mg Tricaine (# A-5040, Sigma-Aldrich) / 100 ml dH 2 O, pH 9,0 E3 Medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4)