Genomweiten Gen-Deletionen in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Von High Throughput PCR

Zusammenfassung

Eine effiziente genomweiten Gen-Mutation Methode ermittelt worden Streptococcus sanguinis Als Modellorganismus. Diese Methode wurde über einen hohen Durchsatz rekombinanten PCRs und Transformationen erreicht.

Zusammenfassung

Transposon-Mutagenese-und Single-Gen-Deletion gibt zwei Methoden in genomweiten Gen-Knockout in Bakterien ^1,2 angewendet. Obwohl Transposon-Mutagenese ist weniger zeitaufwendig, weniger kostspielig und erfordert keine abgeschlossene Genom Informationen gibt es zwei Schwachstellen in diesem Verfahren: (1) die Möglichkeit einer unterschiedlichen Mutanten in der gemischten Mutantenbibliothek daß der Zähler-wählt Mutanten mit verminderter Wettbewerb; und (2) die Möglichkeit eines teilweisen Geninaktivierung wobei Gene nicht vollständig verlieren ihre Funktion nach dem Einsetzen eines Transposons. Single-Gen-Deletion Analyse kann für die Nachteile, die mit der Transposon-Mutagenese zu kompensieren. Um die Effizienz der genomweiten einzigen Gen-Deletion zu verbessern, versuchen wir, einen hohen Durchsatz Technik für genomweite einzigen Gen-Deletion mit Streptococcus sanguinis als Modellorganismus zu etablieren. Jedes Gendeletion in S. konstruieren sanguinis Genom soll 1 umfassen-Kb stromaufwärts des Zielgens, das aphA-3-Gen, kodierend Kanamycinresistenz Protein und 1-kb stromabwärts des Zielgens. Drei Sätze von Primern F1/R1, F2/R2 und F3/R3 sind jeweils entworfen und synthetisiert in einer 96-Well-Platte Format für PCR-Amplifikationen von diesen drei Komponenten jedes Deletion konstruieren. Primer R1 und F3 enthalten 25-bp-Sequenzen, die komplementär zu Regionen der aphA-3-Gen an ihrem 5'-Ende sind. Eine große Skala PCR-Amplifikation des aphA-3-Gen wird einmal für die Erstellung aller Single-Gendeletion Konstrukte durchgeführt. Der Promotor aphA-3-Gen wird zunächst ausgeschlossen, um das Potenzial polaren Effekt Kanamycinkassette minimieren. Um die Gendeletion Konstrukte zu erzeugen, werden Hochdurchsatz-PCR-Amplifikation und Reinigung in einem 96-Well-Platten-Format durchgeführt wird. Eine lineare rekombinante PCR Amplikon für jedes Gen Löschung wird nach oben durch vier PCR-Reaktionen mit High-Fidelity DNA-Polymerase erfolgen. Die anfängliche exponential Wachstumsphase S. sanguinis in Todd-Hewitt-Brühe kultiviert, ergänzt mit 2,5% inaktiviertem Pferdeserum wird verwendet, um die Zuständigkeit für die Transformation von PCR-rekombinante Konstrukte zu erhöhen. Unter dieser Bedingung bis zu 20% von S. sanguinis transformierten Zellen können unter Verwendung ~ 50 ng der DNA werden. Basierend auf diesem Ansatz wurden 2.048 Mutanten mit Single-Gen-Deletion letztendlich von den 2.270 Gene in S. erhalten sanguinis außer vier Gen-ORFs, die vollständig innerhalb anderen ORFs in S. sanguinis SK36 und 218 potentielle essentiellen Gene. Die Technik zur Erstellung von Gen-Deletion Konstrukte ist mit hohem Durchsatz und könnte leicht in genomweiten Gen Löschungen für alle transformable Bakterien verwenden.

Protokoll

Ein. Primer Design

1. Grundierungen werden unter Verwendung im Haus der Script basiert auf der S. sanguinis SK36 Genomsequenz. Drei Sätze von Primern, F1/R1, F2/R2 und F3/R3 sind zur Amplifikation des 1-kb stromaufwärts Sequenz des Ziel-Gens, das aphA-3 kodierenden Gens Kanamycinresistenz (Km ^r) Protein ³ und der 1 ausgelegt -kb stromabwärts Sequenz des Zielgens, bzw. (Abbildung 1). Unter dieser Primer sind F1 und R3 entwickelt mit ePrimer3 im EMBOSS Suite von Programmen ( http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html ) an flankierenden Regionen stromaufwärts oder stromabwärts zu verstärken des Ziels Gen. Genspezifischen Primern, R1 und F3, werden basierend auf der 5 'und 3'-Sequenzen des Zielgens gestalten. R1 und F3 Primer enthalten 25-bp-Adapter-Sequenzen an ihrem 5'-Ende, die komplementär zu dem aphA-3 sindGen. Die Schmelztemperaturen von jedem Primer wurden entwickelt, um so nah wie möglich auf 60 ° C um die Verwendung eines einheitlichen Glühtemperatur für alle PCR-Reaktionen in 96-Well-Format zu ermöglichen.
2. F1, R1, R3 und F3 Primer werden in 96-Well-Platten auf ein Gen Reihenfolge basierend synthetisiert. Jede Platte enthält eine Art von Primer im gleichen Gen sortiert. Verdünnt den Primer in 96-Well-Platte arbeitet Primer zu einer Endkonzentration von 10 uM zur PCR-Amplifikation unter Verwendung einer Mehrkanalpipette.

2. High-throughput PCR-Amplifikation und Reinigung

1. Mit hohem Durchsatz amplifizieren 1-kb stromaufwärts oder stromabwärts des Ziels S. sanguinis Gene, montieren ein PCR-Cocktail Mischung auf Eis in einem 15-ml konischen Röhrchen mit 1640 ul ddH ₂ O, 250 ul 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 200 ul 10 mM dNTP-Gemisch, 100 ul 50 mM MgSO _4, 100 ul 10 ng / ul S. sanguinis SK36 genomische DNA und 10 ul Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity und Transfer 23 ul des Gemisches in jedes Well auf 96-well PCR-Platte mit einer Mehrkanalpipette. Übertragen 1 ul jeder F1 und R1 (oder F3 und R3) aus den 10 uM arbeiten Primer Platten der PCR-Platte mit Mehrkanalpipette. Abzudichten und die PCR-Platte durchzuführen Amplifikation bei 94 ° C für 1 min und 30 Zyklen von 94 ° C für 30 sec, 54 ° C für 30 sec und 68 ° C für 1,5 min.
2. Bereiten 1% Agarosegel mit Ethidiumbromid mit 48 Kavitäten Montage Mehrkanalpipette loading. Mix 4 ul PCR-Produkt mit 1 ul 5xDNA Ladepuffer auf 96-Well-Platte und laden Sie die Proben auf Agarosegel unter Verwendung eines 10-ul Mehrkanalpipette. Führen Elektrophorese bei 135 V für 30 min. Untersuchen Sie das Band auf Gel unter UVP Dokumentation und Analyse-System.
3. Reinigen die PCR-Produkte durch PureLink 96 PCR Purification Kit unter Verwendung von Zentrifugation nach der Anleitung des Herstellers. Zum Eluieren DNA, fügen Sie 40 ul sterilem ddH ₂ O zum Wohl des binding Platte.
4. Zufallsprinzip auswählen mehreren gereinigten Amplifikate auf der Platte, um die DNA-Konzentrationen mit NanoDrop Spektralphotometer prüfen. Die Konzentration der Amplikons auf Platte zu ~ 10 ng / ul.
5. Ein Plasmid enthaltenden Km ^r Kassette mit EcoR I verdaut als PCR-Template. Die verdaute Plasmid wird durch QIAquick PCR Purification Kit gereinigt und das lineare Plasmid-DNA wird auf DNA-Endkonzentration 10 ng / ul eingestellt. Montieren Sie 25 ul Mischung Kilometer ^r Kassette Amplikon einschließlich 16,4 ul ddH ₂ O, 2,5 ul 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 ul 10 mM dNTP-Gemisch, 1 ul 50 mM Mg SO _4, 1 ul 10 uM F2, 1 ul 10 uM R2, 1 ul lineare Plasmid-DNA und 0,1 ul Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity. Eine PCR-Amplifikation bei 94 ° C für 1 min und 30 Zyklen von 94 ° C für 30 sec, 55 ° C für 30 sec und 68 ° C für 1 min. Untersuchen des PCR-Produkts durch Gelelektrophorese an 1% Agarose. Poola Großteil des Km ^r Kassette Amplikon aus 10 einzelnen PCR gereinigte von QIAquick-PCR. Passen Sie die Amplikon-Konzentration auf 10 ng / ul.
6. Um die endgültige lineare rekombinante PCR Amplikon erhalten, werden drei PCR Amplikons mit je 1 ul (in fast gleich-molaren Mengen) in ein PCR-Platte sowie die PCR-Vorlage kombiniert. Andere PCR-Komponenten, einschließlich 14,4 ul ddH ₂ O, 2,5 ul 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 ul 10 mM dNTP-Gemisch, 1 ul 50 mM Mg SO _4, 1 ul 10 uM F1, 1 ul 10 uM R3, 0,1 ul Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity. PCR-Amplifikation bei 94 ° C für 2 min, 30 Zyklen von 94 ° C für 30 sec 55 ° C durchgeführt für 30 sec und 68 ° C für 3,5 min und schließlich 68 ° C für 4 min.
7. Untersuchen Sie die PCR Amplifikate im Agarosegel. Läutern und Quantifizierung der PCR-Amplikons wie oben beschrieben. Einfrieren der rekombinierten PCR Amplikons bei -20 ° C.

3. Comzuständigen Cells Vorbereitung

1. Todd-Hewitt-Bouillon hergestellt wird, auf 7,6 eingestellten pH-Wert mit 10 N NaOH, erhitzt zum Sieden und kühlt dann auf Raumtemperatur und sterilisiert unter Verwendung 0,22 um Polystyrol-Filter ^4. Fügen Sie 300 ul hitzeinaktiviertem Pferdeseren (Endkonzentration 2,5%) auf 11,7 ml Todd Hewitt Broth in 15-ml konischen Röhrchen, um Make-up TH + HS Medium. Aliquot TH + HS Medium in 2 ml und 10 ml in Tuben.
2. Beimpfen 5 ul Lager S. sanguinis SK36 bei -80 ° C in 2 ml TH + HS Medium eingefroren und inkubiere die Kultur über Nacht mit Capping fest bei 37 ° C, durch Vorinkubieren der 10 ml-TH + HS Rohr begleitet.
3. Nachdem über Nacht übertragen 50 ul Kultur in 10 ml TH + HS und inkubieren des Rohres bei 37 ° C für 3 Stunden (entspricht OD ₆₆₀ von 0,07 bis 0,08), sofort mit der Transformation.

4. Zelltransformation und Antibiotika-Selektion

1. Add 2 ul 70 ng S. sanguinis SK36 Kompetenztenz stimulierende Peptid (CSP) und 2 ul linearen rekombinanten PCR Amplikon (~ 50 ng) in Eppendorf-Röhrchen auf 96-Well-Block und Pre-warm sie bei 37 ° C. Übertragen 330 ul 3 hr-inkubierten SK36 Kultur in jedes Röhrchen. Bei 37 ° C für 1 Stunde. Ersetzen DNA mit sterilem ddH ₂ O als Kontrolle.
2. Legen Sie den Block auf Eis und verteilt 100 ul jeder Transformation auf Hirn-Herz-Infusion (BHI)-Agar-Platte mit 500 ug / ml Kanamycin. Die Inkubation erfolgt bei 37 ° C für 2 d unter mikroaeroben Bedingungen.

5. Mutant Bestätigung und Lagerung

1. Für jeden Ersatz Mutante, zufällig abholen 2 einzelnen Kolonien, impfen die Kolonie in 5 ml BHI mit 500 ug / ml Kanamycin und inkubieren das Inokulum mikroaerob über Nacht bei 37 ° C. Kryokonservierung jede Kultur in 30% Glycerin bei -80 ° C
2. Um zu untersuchen, ob die Mutante, die die erwartete Gen-Ersatz, führen Kolonie-PCR für jede Mutante mit F1 und R3Primer in 96-well PCR-Platte. Etwa 1 ul-Übernachtkultur von einzelnen Kolonie wird als DNA-Matrize in 25 ul-PCR-Amplifikationsreaktion verwendet. PCR wird bei 94 ° C für 5 min, 35 Zyklen von 94 ° C für 30 sec, 55 ° C für 30 Sekunden durchgeführt und 68 ° C für 3,5 min und schließlich 68 ° C für 4 min.
3. Zur genauen Bestimmung Doppelbandpresse Mutanten oder Verunreinigung PCR Amplikon, prüft die PCR-Amplicon durch Elektrophorese für 4 h auf> 12 cm lang 2% Agarosegel mit Ethidiumbromid. Unter diesem Agarosegelelektrophorese Zustand, wurden alle Amplikons mit ≥ 100 bp Unterschied eindeutig identifiziert. Wenn Bands aus Amplifikation der Km ^r Kassette und dem Wildtyp-Gen werden voraussichtlich durch <100 bp, ein interner T1 Primer verwendet, um festzustellen, ob eine Wildtyp-Gens durch PCR nachgewiesen werden kann unterschiedlich sein.
4. Zur weiteren bestätigen Sie den Löschvorgang werden die Fragmente durch PureLink 96 PCR Purification Kit gereinigt und sequenziert mit dem P1-Primer,bindet an das Km ^r Kassette. Halten einzig richtige Mutanten durch Sequenzierung bestätigt.

Ergebnisse

Nach der PCR-Amplifikation unter Verwendung der Primer und R1 F1 und F3 und R3, etwa 1-kb stromaufwärts und stromabwärts jeder S. sanguinis Gen wurden in 96-Well-Format bzw. (2A) erhalten. Unter unserer PCR-Bedingungen und mit entworfenen Primern wurde ein bestimmtes Produkt aus S. verstärkt sanguinis genomischen DNA in jeder PCR-Reaktion. Dieses Ergebnis zeigt die Primer waren sehr spezifisch für die Ziele der S. sanguinis. Durch PCR-Amplifikation mit erneute Pri...

Diskussion

Um die möglichen polaren Effekte der Ersatz eines Zielgens mit exogenen Antibiotika-Gen auf benachbarten Genen zu minimieren, sind zwei Schritte gemacht, während erste Primer entwerfen. Für die meisten der Gene gelöscht werden der Primer R1 und F3 entworfen, um die codierende Region von 6 bp nach dem Startcodon und 30 bp vor dem Stopcodon löschen. Die letzten 30 Basenpaare zurückgehalten werden, um potenzielle ribosomale Bindungsstelle durch das benachbarte, nachgeschaltete Gen verwendet schützen. Das verbliebene...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primer F2	Integrated DNA Technologies	TGACTAACTAGGAGGAATAAATG GCTAAAATGAGAATAT
Primer R2	Ibid	CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA CAATTCATCCAGT
Primer F2p	Ibid	GATAAACCCAGCGAACCATTTGA
Primer P1	Ibid	GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA
Primer P2	Ibid	GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC
Primer 5 'end_R1_seq	Ibid	GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA
Primer 5 'end_F3_seq	Ibid	GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG
Primer 5 'end_R1p_seq	Ibid	CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC
CSP	Synprep	Sequenz: NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH
DNA Polymerase	Invitrogen	11304-102	Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity
EcoRI	New England Biolabs Inc	R0101S	Restriktionsenzym
Agar	American Bioanalytical	AB01185
Agarose	Promega	V3125
BHI	BD Biosciences	237500	Brain Heart Infusion
Pferdeserum	Fisher Scientific	SH3007403	Pferdeserum
Km	Fisher Scientific	BP906-5	Kanamycin
TH Brühe	BD Biosciences	249240	Todd Hewitt Broth
PureLink 96	Invitrogen	K310096	PureLink 96 PCR Purification Kit
QIAquick	Qiagen	28106	QIAquick PCR Purification Kit
Filter	Corning	431117	0,22 um Polystyrol-Filter
Anoxomat-System	Mart Microbiology bv	Anoxomat Mark II
Tischzentrifuge	Thermo Scientific	75004377	Sorvall Legend RT Plus Mikrotiterplatten Rotors
Gel-Dokumentation	UVP LLC	BioDoc-It 210
Incubator	Fisher Scientific	11-690-625D	Isotemp
Labnet die Gel XL	Labnet	E0160	Labnet die Gel XL
Microcentrifuge	Eppendorf	22621408	Mikrozentrifuge 5415 R
Mehrkanalpipetten	Thermo Scientfic	4661040, 4661020	Finnpipette F1
Thermal Cycler	Applied Biosystems Inc.	N805-0200	GeneAmp PCR-System 9700