Intravaskuläre Perfusion von Carbon Black Ink ermöglicht eine zuverlässige Visualisierung der Hirngefäße

Zusammenfassung

Analyse von Nagetier zerebrovaskulären Anatomie spielt eine wichtige Rolle bei experimentellem Schlaganfall Forschung. In diesem Zusammenhang hat intravaskulären Perfusion mit gefärbten Latex als Standard-Tool für mehrere Jahre betrachtet worden. Allerdings impliziert diese Technik verschiedene technische Beschränkungen, die ihre Reproduzierbarkeit zu untergraben. Hier beschreiben wir eine einfache Methode, um Hirngefäße in reproduzierbarer Weise zu visualisieren. Einspritzen einer Mischung aus zwei handelsüblichen Ruß Tinten durch die linken Ventrikels führt zu myokardialer ausreichende Füllung der cerebralen Gefäße mit hohem Kontrast Visualisierung. Wir haben erfolgreich diese Technik angewendet, um Anastomosen Punkte zwischen zerebrale vaskuläre Territorien von Mäusen mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen zu identifizieren. Wir haben endlich belegen, dass diese neuartige und einfache Methode zur Schiffes Färbung mit Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) Färbung kombiniert werden können - ein weit verbreitetes Instrument zur Beobachtung und Analyse Infarkt Volumina bei Mäusen.

Zusammenfassung

Die anatomische Struktur der Hirngefäße ist ein entscheidender Faktor für Gehirn Hämodynamik sowie die Schwere der Verletzungen nach ischämischen Insulten. Der zerebrale Gefäßsystem dynamisch auf verschiedenen pathophysiologischen Zuständen und es zeigt erhebliche Unterschiede zwischen den Stämmen und unter Bedingungen von genetischen Manipulationen. Im Wesentlichen ist eine zuverlässige Technik für intrakraniellen Gefäß Färbung, um die Pathogenese des ischämischen Schlaganfalls zu studieren unerlässlich. Bis vor kurzem wurde eine Reihe verschiedener Techniken eingesetzt, um die zerebralen Gefäßsystem einschließlich Injektion von niedrigviskosen Harzes, Araldit F, Gelatine vermischt mit verschiedenen Farbstoffen ¹ (dh karminrot, Tusche) oder Latex mit ² oder ³ ohne Ruß. Visualisieren Perfusion von weißen Latex Verbindung durch die aufsteigende Aorta wurde zuerst von Coyle und Jokelainen ^{3 angegeben.} Maeda et al. ² das Protokoll modifiziert durch Zugabe carbon schwarzen Tinte zu dem Latex-Compound zum verbesserten Kontrast Visualisierung der Schiffen nach Kochsalzlösung Perfusion des Gehirns. Allerdings sind ineffizient und unzureichender Perfusion Befüllung der Gefäße häufig erfahren aufgrund der hohen Viskosität des Latex-Compound ^4. Daher haben wir ein einfaches und kostengünstiges Verfahren mit einem Gemisch aus zwei handelsüblichen Ruß Tinten (CB1 und CB2), um die zerebralen Gefäßsystem in reproduzierbarer Weise visualisieren ⁵ beschrieben. Wir haben gezeigt, dass Perfusion mit CB1 + CB2 in Mäusen führt gezeigt in Färbung wesentlich kleiner Hirngefäße mit einer höheren Dichte im Vergleich zu Latex Perfusion ^5. Hier beschreiben wir unsere Protokoll, um die Anastomosen Punkten zwischen dem vorderen (ACA) und mittleren Hirnarterien (MCA) in den Behälter Variationen in Mäuse mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen studieren zu identifizieren. Schließlich zeigen wir die Machbarkeit unserer Technik in einer transienten fokalen zerebralen Ischämie-Modell bei Mäusen durch die Kombination von CB1 +CB2-vermittelte Gefäß Färbung mit TTC-Färbung in verschiedenen Graden von ischämischen Verletzungen.

Protokoll

Ein. Tiere

1. Die Experimente wurden nach den NIH-Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und genehmigt durch die lokalen Behörden. Für alle Versuche C57Bl6 / J Wildtypmäusen, ApolipoproteinE ^{- / -} (ApoE KO) und SV129-Mäusen (12 bis 16 Wochen alt, 26-30 g Körpergewicht, 5-6 Tiere pro Versuchsgruppe) verwendet.

2. Die Färbung der Hirngefäße mit farbigen Latex

1. Bereiten Sie eine Mischung von 25 ul Ruß Tinte (Herlitz, Deutschland) mit 0,5 ml des Latex-Compounds (Pebeo, Frankreich) bei einem Verhältnis 1:20 in einem EP Rohr und erwärmen die Mischung bei 37 ° C in einem Wasserbad. Sammeln des Gemisches in einer 2 ml-Spritze mit einer Nadel von 28-30G vor Betäuben das Tier.
2. Man löst 50 mg des Pulvers in papavarine Hydrochlorid 1 ml steriler physiologischer Kochsalzlösung. Sammeln der Lösung in einer Insulinspritze. Brechen Sie die Nadel aus einem anderen sterilen Insulinspritze. Platzieren dieses Nadel am Ende einer 20 cm langen PE10 Rohr. Nun fügen diese PE10 Rohr auf der Nadel der Spritze, die Insulin papavarine Hydrochlorid-Lösung, um durch die Oberschenkelvene injiziert werden, um Vasodilatation und ordnungsgemäße Befüllung der Gefäße zu gewährleisten.
3. Bereiten Sie zwei weitere Insulinspritzen mit jeweils 1 ml Kochsalzlösung. Insulinspritzen ermöglichen eine reibungslose Lieferung der injizierten Flüssigkeit an einer präzisen Stelle. Allerdings sollte aufgrund der hohen Viskosität des Latex, alternative 1 ml Spritzen mit auswechselbarer breiter Nadeln verwendet werden.
4. Nehmen Sie alle Spritzen und sterilisiert Sezieren Instrumenten in der Nähe der Betriebsphase. Verteilen Sie eine chirurgische draper Blatt um den Betrieb der Bühne. Der Betrieb Stufe sollte ausreichend beleuchtet werden und ein Operationsmikroskop verwendet werden, wenn es erforderlich ist.
5. Jetzt kann der Körpergewicht eines C57Bl6 / J-Maus und dann induzieren Narkose mit Isofluran verdampft 5% in 70% N ₂ O und 30% O _2. Anästhesie weiterhin mit 1% Isofluran verdampft. Nach ordnungsgemäßer POSITIONIEg der Maus auf den Rücken und Fixierung der Extremitäten, beurteilen die Tiefe der Narkose. Dann schneiden Sie die Haut über der linken Vena femoralis und suchen Sie die Vene. Legen Sie die scharfe Spitze der Nadel auf PE10 Röhrchen gegeben und injizieren Sie langsam papavarine Hydrochlorid-Lösung mit einer Rate von 100 ul pro min (50 mg / kg Körpergewicht).
6. Nach der Injektion, schneiden Sie die Bauchhöhle und durchbohren die Membran. Schneiden Sie die Rippen, um das Herz ohne Beschädigung oder Blutergüsse es freizulegen. Clip die absteigende Aorta mit einer Arterienklemme. Eine scharfe Schnitt über den rechten Vorhof, damit das venöse Blut ablaufen lassen. Injizieren 2 ml Kochsalzlösung in den linken Ventrikel, gefolgt von Einspritzen des gefärbten Latex manuell mit leichtem Druck über 18-20 sek. Verwenden Sie die Fertigspritzen nacheinander. Vermeiden Sie die Injektion keine Blasen.
7. Nach Injektion von Latex, verlassen das Tier für 5 min. Enthaupten das Tier und entfernen Sie vorsichtig das ganze Gehirn. Hüten, das Schiff Architektur und corte verletzenx beim Entfernen der Schädelknochen und der Hirnhäute. Legen Sie das Gehirn in einer 60 mm Zellkulturschale mit 6-8 ml 4% PFA um ein Foto aufzunehmen. Legen Sie eine Meßlineal unter der transparenten Schale. Nehmen eines Photos bei 25facher Vergrößerung der dorsalen und der ventralen Oberfläche des Gehirns mit einer Kamera, die an dem Operationsmikroskop. Fotos sollten bei 90 ° Winkel zwischen der Petrischale und dem Mikroskopobjektiv ergriffen werden, um den ursprünglichen Abstand zu quantifizieren.
8. Wiederholen Sie den Vorgang in einem anderen 4-5 Tieren.

3. Die Färbung der Hirngefäße mit einer Mischung aus Carbon Black Tinten

1. Um das Ergebnis von Latex basierenden zerebrale vaskuläre Färbung mit unserem Protokoll zu vergleichen, bereiten eine Mischung von 100 ul Herlitz Stempelfarbe Tinte (CB1) mit 900 ul Pelican Scribtol Schwarz Tinte (CB2) in einem 1,5 ml EP Röhre. Bereiten Sie zwei EP Rohren bis zu einem Gesamtvolumen von 2 ml Mischung aus CB1 und CB2 bei einem 1:9-Verhältnis zu machen. Sammeln Sie die Mischung in zwei getrennten Insulinspritzen (1ml). Verschließen Sie die Spritzen und legen Sie sie in einem Wasserbad zu erwärmen bis zu 37 ° C. Sammle 2 ml Kochsalzlösung in zwei weiteren Insulinspritzen, und legen Sie sie in einem Wasserbad als gut.
2. Anesthetize das Tier und wiederholen Sie den Vorgang wie oben, außer für die Injektion von papavarine Hydrochlorid beschrieben. Nach Injektion von 2 ml salaine in den linken Ventrikel, injizieren eine 2 ml Gemisch aus Ruß Tinten anstelle des gefärbten Latex. Führen Sie die Injektion von Hand mit leichtem Druck über 18-20 Sekunden pro ml. Clip der absteigenden Aorta vor den Injektionen.
3. Opfert das Tier, entfernen das Gehirn und Fotos zu machen.
4. Für die langfristige Erhaltung des Gehirns, legte das Gehirn in 4% PFA über Nacht durch Inkubation mit Saccharose mit allmählich zunehmender Konzentration bis die schwimmenden Gehirn taucht völlig (5% von 15% gefolgt und dann 30%). Gehirne der Tiere mit dem gefärbten Latex perfundiert können auch in der gleichen Weise erhalten werden.
5. Führen Sie dieVerfahren in einer anderen 4-5 Tiere. Um den Unterschied in zerebrale vaskuläre Anatomie aufgrund unterschiedlicher genetischer Hintergrund oder Stämme zu vergleichen, wiederholen Sie das Protokoll in gleicher Zahl von ApoE KO und SV129-Mäusen sind.
6. Um die Gefäßanatomie unter ischämischen Bedingungen zu studieren, induzieren transienten fokalen zerebralen Ischämie für 45 min oder 90 min gemäß einem Standardprotokoll von intraluminale Okklusion der MCA unter tiefer Anästhesie (eine ausführliche Beschreibung der Operation ist nicht Gegenstand dieses Artikels, der Leser auf Doeppner et al., 2010) genannt. Am Ende des Zeitraums geplant Reperfusion (1 Tag bis 5 Tage), führen die vaskuläre Färbung mit CB1 + CB2 Tinten nur und färben die gesamte Gehirn mit 2% TTC-Lösung bei 37 ° C für 5-10 min, um die Identifizierung Infarktvolumen . TTC wird auf rot gefärbten Formazan durch die mitochondrialen Enzyme (insbesondere Succinatdehydrogenase) reduziert. Nach TTC-Färbung, die metabolisch aktives Gewebe Flecken tief rot, während der Infarkt Gewebe bleibt unstainiert und weiß erscheint aufgrund der dysfunktionalen und denaturiertes mitochondrialen Enzyms. Collect Bilder in der gleichen Weise wie oben beschrieben.

4. Study of Cerebral Vascular Territories

1. Um die makroskopischen Anatomie der Hirngefäße, Bilder von der dorsalen Oberfläche des Gehirns entweder gebeizt mit farbigen Latex oder CB1 + CB2-Tinten mit ImageJ-Software (eine Java-basierte Public Domain Software zur Bildverarbeitung und-analyse) analysiert werden können analysieren. Brains mit farbigen Latex perfundiert kann zeigen variable Grad des Schiffes Färbung auf der dorsalen Oberfläche befindet, während CB1 + CB2 Perfusion alle Schiffe auf beiden ventralen und dorsalen Oberflächen Flecken wird.
2. Öffnen Sie eine Bilddatei mit ImageJ Software. Identifizieren Sie alle Anastomosen Punkte zwischen ACA und MCA. Eine Anastomoseninsuffizienz Punkt wird als der Ort, wo der Gefäßdurchmesser ist die schmalste oder die halbe Distanz zwischen den nächsten Verzweigungspunkte der ACA und der MCA Niederlassungen bzw. ² definiert. ^{Ziehen Sie eine imaginäre Linie (Anastomosen Linie) durch Markieren der Anastomosen Punkte mit Hilfe der Zeichnung segmentierte Linie Werkzeug und dem Plugin "Dotted Line".}
3. Stellen Sie die Skala in mm. Messen des Abstands zwischen der anastomotischen Linie und der Mittellinie an 4 mm kaudal der frontalen Pol des Gehirns über Gerade Ziehwerkzeug und "messen" Werkzeug. Machen Sie dasselbe mit 6 mm kaudal vom frontalen Pol. Analysieren 3-4 Bildern pro Tier und berechnen den Mittelwert. Vergleichen der Werte zwischen den verschiedenen Gruppen von Tieren, um die Variation von zerebrovaskulären Anatomie identifizieren. In C57Bl6 / J Tieren kann die Anastomosen zwischen ACA und MCA näher an der Mittellinie bei 4 mm als bei 6 mm kaudal vom frontalen Pol zurückverfolgt werden. ApoE KO-Mäuse präsentieren sich kein signifikanter Unterschied in dieser Hinsicht. Im Gegenteil, in SV129 Mäusen die anastomotische Linie weiter und parallel zu der Mittellinie sowohl bei 4 mm und 6 mm liegen kaudal aus dem frontalen Pol.
4. Um die Gefäßanatomie analysieren in ischämischen Bedingungen, führen die gleichen Berechnungen erwähnt. Identifizieren Sie die Infarkt Grenze als die roten und weißen farbigen Gewebe-Marge repräsentiert metabolisch aktives Gewebe und nekrotischem ungefärbten Gewebes sind. Den Abstand des Infarkts Rand von der Mittellinie bei 4 mm und bei 6 mm kaudal aus dem frontalen Pol des Gehirns. Sammeln Sie den Mittelwert von 3 bis 4 Bilder pro Tier. Vergleichen Sie die Ergebnisse zwischen verschiedenen Ischämie und Reperfusion Perioden.

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Ergebnisse

Das hier beschriebene Protokoll überwindet die technischen Grenzen der herkömmlichen Latex-basierte Visualisierung von Nagetier zerebrale Gefäßsystem. 1A zeigt, dass nach Perfusion der gefärbten Latex, sind nur die großen Schiffe auf der ventralen Oberfläche gebeizt, so dass die gesamte dorsale Oberfläche ungefärbt. Das Ergebnis ist auch sehr variabel. Nur ein Tier von sechs zeigt partielle Färbung von ACA und MCA sichtbar auf der dorsalen Fläche des Gehirns (Daten nicht gezeigt). Umgekehrt C...

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Diskussion

Perfusion von CB1 + CB2 durch manuelle Injektion erfolgreich durchgeführt werden können, ohne durch intensives Training durchgeführt, wie es sich nicht um irgendeine spezifische Gerät auf bestimmte Druck ^2,3 implizieren. Die Heterogenität der Perfusion Ergebnisse in unserem Protokoll ist ebenfalls vernachlässigbar. Nur 1 Tier aus 16 nicht-ischämische Tiere und 3 von 20 ischämischen Tieren haben gezeigt, unvollständige Perfusion. In diesen Fällen war Einarbeitung von Luftblasen während Kochsalzlösu...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Namen Reagenz	Firmenname	Katalog-Nr
Scribtol Schwarz (CB2)	Pelican, Deutschland	221 135
Stempelfarbe (CB1)	Herlitz PBS AG, Deutschland	10417202
Gedeo Latex	Pebeo, Frankreich	13042B