Identifikation der olfaktorischen Flüchtige mittels Gaschromatographie-Multi-unit Recordings (GCMR) im Insect Antennallobus

Zusammenfassung

Geruchssinn vermitteln viele verschiedene Verhaltensweisen bei Insekten, und sind oft komplexe Mischungen von Dutzenden bis Hunderten von flüchtigen Verbindungen bestehen. Mittels Gaschromatographie mit Multi-Kanal-Aufnahme in das Insekt Antennallobus beschreiben wir eine Methode zur Identifizierung von biologisch aktiven Verbindungen.

Zusammenfassung

Alle Organismen leben in einer Welt voller Sinnesreize, die ihre Verhaltens-und physiologische Reaktion auf ihre Umgebung zu bestimmen. Der Geruchssinn ist besonders wichtig bei den Insekten, die ihre olfaktorischen Systeme verwenden, um zu reagieren, und zu unterscheiden zwischen komplexen Geruch Reize. Diese Gerüche hervorrufen Verhaltensweisen, die zu vermitteln Prozesse wie Wiedergabe und Habitatwahl ^1-3. Zusätzlich chemischen Sensorik durch Insekten vermittelt Verhaltensweisen, die von großer Bedeutung für die Landwirtschaft und die menschliche Gesundheit, einschließlich der Bestäubung ^4-6, Herbivorie von Nahrungspflanzen ⁷ und Übertragung von Krankheiten ^8,9. Bezeichnung des olfaktorischen Signale und ihre Rolle im Verhalten von Insekten ist somit wichtig für das Verständnis sowohl ökologische Prozesse und menschliche Nahrung Ressourcen und Wohlbefinden.

Bis heute hat die Identifizierung der flüchtigen das Verhalten von Insekten zu fahren war schwierig und oft langwierig. Übliche Techniken umfassenGaschromatographie-gekoppelte Elektroantennogramm Aufnahme (GC-EAG) und Gas einzigen Sensillum Aufnahmen (GC-SSR) ^10-12 Chromatographie gekoppelt. Diese Techniken erwies sich bei der Identifizierung von bioaktiven Verbindungen von entscheidender Bedeutung. ^13,14; Wir haben eine Methode, die Gas-Chromatographie gekoppelt Multi-Channel-elektrophysiologischen Ableitungen (sog. 'GCMR') von Neuronen im Antennallobus (das Insekt primäre Riechzentrum AL) verwendet entwickelt. Das state-of-the-art Technik ermöglicht es uns zu sondieren, wie Geruch Informationen im Insektengehirn vertreten ist. Darüber hinaus, weil neuronalen Reaktionen auf Gerüche auf dieser Ebene der olfaktorischen Verarbeitung hochsensibler wegen der Grad der Konvergenz der Antenne Rezeptor-Neuronen in AL Neuronen sind, wird AL-Aufnahmen ermöglichen den Nachweis der aktiven Bestandteile natürlicher Gerüche effizient und mit hoher Empfindlichkeit. Hier beschreiben wir GCMR und geben ein Beispiel für seine Verwendung.

Mehrere allgemeinen Schritte sind INVOLved bei der Detektion von bioaktiven flüchtigen und Insektenzellen Reaktion. Volatile müssen zunächst aus den Quellen von Interesse gesammelt werden (in diesem Beispiel verwenden wir Blumen aus der Gattung Mimulus (Phyrmaceae)) und gekennzeichnet nach Bedarf mit Standard-GC-MS-Techniken ^14-16. Insekten sind für die Studie unter Verwendung minimal Dissektion, wonach eine Aufnahme-Elektrode in die Antennallobus und Multi-Channel neuronalen Aufnahme beginnt eingesetzt ist. Post-Processing der neuronalen Daten dann verrät, welche insbesondere Geruchsstoffe signifikanten neuronalen Reaktionen führen durch das Insekt Nervensystem.

Obwohl das Beispiel präsentieren wir hier ist spezifisch für die Bestäubung Studien können GCMR auf ein breites Spektrum der Studie Organismen und volatile Quellen erweitert werden. Zum Beispiel kann dieses Verfahren bei der Identifizierung von Geruchsstoffen anziehenden oder abstoßenden Wirtsinsekten und Pflanzenschädlinge eingesetzt werden. Darüber hinaus können GCMR auch verwendet, um Lockstoffe für Nützlinge, wie po identifizierenllinators. Die Technik kann auf nicht-Insekt Themen ausgebaut als gut.

Protokoll

Ein. Volatile Follection

1. In diesem Beispiel verwenden wir flüchtigen Proben von M. lewisii Blumen - eine alpine Wildblumen Kalifornien beheimatet ist. Volatile werden mittels dynamischen Sorption Methoden nach Riffell et al. ^14. Kurz gesagt, werden bei dieser Methode eine geschlossene Schleife Trapping System, wo Blumen in einem Teflon Beutel eingeschlossen sind. Verwendung eines inerten Vakuumpumpe, wird die Luft um die Blumen durch eine "Falle" einer Pasteurpipette zusammen mit Q Porapak Matrix gefüllt gesaugt. Die Abluft aus der Pumpe wird über Aktivkohle filtriert. Nach einer vorgeschriebenen Zeitperiode, in unserem Fall 24 h wird die Porapak Q-Matrix mit einem nicht-polaren Lösungsmittel, typischerweise Hexan eluiert, um das konzentrierte Extrakt sammeln. Der Extrakt wird dann im -80 ° C bis zur Analyse gelagert. Falls erforderlich, können die Proben vor der Analyse unter einem Strom von Stickstoffgas konzentriert werden. Sofern die Probe ist bereits gut charakterisierte, führen ein Aliquot der es durch eineGaschromatograph-Massenspektrometer (GC-MS), um flüchtige Komponenten zu identifizieren, bevor mit der Probe.

2. Elektrophysiologische Vorbereitung

1. Geschnitten etwa 1 cm vom Ende des 1000 ul Pipettenspitze. Legen Sie eine Hummel (Bombus Impatiens) in der Basis der Pipettenspitze und sanft in Richtung der gegenüberliegenden Ende der Spitze drücken, bis nur noch der Kopf ausgesetzt ist.
2. Melt Dentalwachs und formen es um den freigelegten Kopf, um sicherzustellen, dass das Wachs klebt auf den Facettenaugen für Sicherheit und um die Biene den Kopf völlig unbeweglich. Achten Sie darauf, keine Wachs auf der Antenne der Biene zu bekommen.
3. Sobald der Kopf gesichert ist, einen quadratischen, fensterartige, Inzision in den Kopf Kapsel mit einer Rasierklinge Leistungsschalter oder die entsprechende Größe Skalpells um die Kutikula geschnitten. Mit der Blade-Leistungsschalter, von der dorsalen Seite des Kopfes Kapsel starten, unmittelbar hinter der Antenne und benachbart zu einer der Facettenaugen. Schneideneine gerade Linie, von einer Verbindung zur kontralateralen Auge Facettenauge. Nach dem Schneiden einer geraden Linie auf der gegenüberliegenden Facettenauge, beginnen einen Einschnitt dorsal bis die Kopfkapsel Kurven und Enden in der Nähe seines Brustkorbs. An diesem Punkt beginnen, auf das gegenüberliegende Ende des Kopfkapsel geschnitten. Schließlich, sobald eine Leitung mit dem gegenüberliegenden Ende geschnitten worden ist, eine Linie geschnitten wieder auf die Ausgangsposition der anfängliche Einschnitt. Es ist wichtig, die Kutikula, die benachbart zu der Antenne zu entfernen, wie dies das Einsetzen der Elektrode behindert wird.
4. Sobald die Nagelhaut geschnitten wird, verwenden Sie eine Pinzette, um die Biene Kutikula, die dann aussetzen sollte der Biene Gehirn und, noch wichtiger, die Antennalloben entfernen. Sofort beginnen Superfusion das Gehirn mit Insekten Kochsalzlösung, so dass das Gehirn nicht zu dessicated. Nachdem sich das Gehirn ausgesetzt ist, sorgfältig mit einem Paar sehr feinen Pinzette die perineural Scheide unmittelbar über den Antennalloben entfernen. Seien Sie sehr vorsichtig nicht zuPunktion der Biene Gehirn mit der Zange.

3. Gas-Chromatographie mit Multi-Channel-Recording

1. Die Biene "Vorbereitung" - in einem Rohr mit seinem Gehirn ausgesetzt fixiert - ist nun bereit für die elektrophysiologische Ableitung. Platzieren der Biene in einer Klemme, die an einem magnetischen Basis, die auf einem Luftkissentisch befindet.
2. Anordnen einer IV Beutel, Durchflussregler, und Schläuche (gefüllt mit Insekt Kochsalzlösung), so daß die Salzlösung kontinuierlich superfuses das Gehirn.
3. Mit einem Mikromanipulator insertareference Elektrode aus Wolfram Draht, in der Biene ins Auge.
4. Mit einem separaten Mikromanipulator, legen Sie die Multi-Channel-Elektrode, wie einer gewickelten Draht Tetrode oder Silizium Multi-Channel-Elektrode (Neuronexus Technologies), in die Antennalloben der Biene. Diese Elektrode ist mit einem Vorverstärker wie die TDT Systems S-3 Z Serie mit dem Z-Bus bioamp Prozessor der TDT angeschlossen. Ausgabe vom Gas Chromatogram den Detektor über ein abgeschirmtes HF-Kabel kann eine Schnittstelle mit dem Verstärker und Datenerfassungssystem, so daß sowohl das neuronale und GC-Signal synchronisiert ist.
5. Warten Sie ca. 30-60 Minuten für die neuronalen Aufnahmen zu stabilisieren. Sobald die spontane Aktivität und Wellenform von Einheiten in den Aufnahme-Kanäle geworden konsistente, verwenden Sie einen Geruch Spritze, um die Bienen zu stimulieren und beobachten Sie die Reaktion der Aufzeichnungskanäle der Geruch.
6. Aufzuzeichnen extrazellulären Spitzen von Neuronen durch die automatische Schwellwertbildung Aufzeichnungskanäle, die 3,5 bis 5 Sigma des Signals auf den einzelnen Aufzeichnungskanäle. Manuelle Thresholding können für einige Kanäle benötigt werden, um eine Kontamination durch elektrische Störungen zu vermeiden. Die Aktionspotentiale von Neuronen wird als Spannungsspitzen in der Aufnahme Kanal angezeigt. Wenn des Kanals Spannung den Schwellenwert überschreitet, puffert das System und speichert die einige Millisekunden vor und nach dem Überschreiten der Schwelle, wodurch takinga Snap-shot der Wellenform oder Spike.
7. Unmittelbar neben der Luft-Tabelle ist die GC. Vor dem Einspritzen des floral Extrakt in den GC, um sicherzustellen, dass das Verfahren für die Temperaturrampe Lauf des GC korrekt ist. In unserem Beispiel verwenden wir eine Temperatur Methode beginnend bei 50 ° C für 4 min durch eine Erhöhung der Temperatur mit einer Geschwindigkeit von 10 ° C / min. bis 220 ° C, wobei zu diesem Zeitpunkt halten wir den GC für zusätzliche 6 min. Wir verwenden eine DB-5 GC-Säule (J & W Scientific, Folsom, CA, USA), mit Helium als Trägergas. Der Einlass ist Splitlos mit einer Temperatur auf 200 ° C. Der Flammenionisationsdetektor Temperatur auf 230 ° C eingestellt
8. Injizieren die Extraktprobe des Blumenarrangements Kopfraum in die erhitzte Einspritzöffnung der GC, um die adsorbierten flüchtigen Bestandteile in die GC-Säule zu lösen. Das Abwasser aus der Säule wird 1:1 zwischen dem Flammenionisationsdetektor (FID) und der Biene-Antenne mit einem Glas "Y"-Anschluss (J & W Scientific) aufgeteilt. Beginnen recording von der Elektrode, wie Sie eine Probe zu injizieren in die GC.
9. Nach der GC-Lauf abgeschlossen ist, lassen Sie die Vorbereitung Rest für 5 bis 15 min. Dann ist entweder zu injizieren ein weiteres Beispiel in den GC oder stimulieren die Vorbereitung mit einzelnen flüchtigen Verbindungen oder Mischungen von Verbindungen. In diesem letzteren Verfahren zur Stimulierung der Herstellung werden Luftimpulse von einem konstanten Luftstrom durch eine Glasspritze enthaltend ein Stück Filterpapier, die den Verbindungen hinterlegt umgeleitet. Der Geruch Stimulus wurde mittels eines Solenoid-Ventils durch die aktivierte Software gesteuert gepulst.
10. Wenn das Gerät Aktivität plötzlich stoppt oder Änderungen, überprüfen Sie die Tropf mit Kochsalzlösung und lassen die Vorbereitung Rest für 15 min. Wenn die spontane Aktivität nicht wieder das seinen previous level wird die Zubereitung sollte verworfen und anderen Bienen verwendet werden, wenn verfügbar.
11. Nach dem Experiment zu fixieren das Gehirn mit 5% Formalin für 20 min mit der Sonde immer noch im Gewebe. Weiter, Verbrauchssteuern das Gehirnund legen Sie sie in 2% Glutaraldehyd für 4 Stunden, und anschließend machen einen abgestuften Ethanol Dehydration Serie und deaktivieren Sie das Gehirn mit Methylsalicylat. Bezogen auf die Fixierung und Löschen des Gewebes, die Orte in der AL, wo die Elektroden punktiert das Gewebe sollte klar erkennbar durch konfokale Mikroskopie.

4. Data Analysis

1. Gesammelten Daten nach dem Versuch zu trennen und zu identifizieren, die aufgezeichneten neuronalen Einheiten zu analysieren. Verwenden typische Software-Programme (Offline Sorter, MClust und SClust) an getrennten Wellenformen oder "Spikes" auf Spike Formen wie Peaks oder Tal-Amplitude, Peak Halbwertsbreite usw. oder vermindertem Maßnahmen beruht (Hauptkomponenten) ^{17 , 18} (Abb. 2). Nur solche Cluster von Spikes, dass im dreidimensionalen Raum getrennt (PC1-PC3) und sind statistisch verschieden voneinander (multivariate Varianzanalyse, p <0,05) (Abbildung 2) für eine weitere Analyse. Bitte beachten SieZitat # s 17-19 für die vollständige Beschreibung der Tetrode Aufnahme und Spike-Sortier-Methoden.
2. Zeitstempel Spitzen in jedem Cluster, und exportieren diese Daten für die Analyse mit MATLAB oder Neuroexplorer (Nex Technologies, Winston-Salem, NC) zur Raster-Plots und Feuerrate Antworten (2, 3A) zu erstellen.
3. Identifizieren Sie die Retentionszeiten der flüchtigen mit den gleichzeitig aufgezeichnet GC-Daten. Mit den Retentionszeiten der flüchtigen Stoffe, die von der Spitze des Peaks des Chromatogramms bestimmt, zu Einheit Reaktionen an denjenigen Zeitpunkten untersuchen.
4. Um einzelne Einheit Reaktionen durch die GC-Lauf zu untersuchen, BIN die Anzahl der Spitzen in 100 msec Intervallen und untersuchen den zeitlichen Verlauf der Feuerungsrate Antworten anhand der Retentionszeit von flüchtigen Eluieren. Die Binning von Spikes in 100 msec Intervallen genügend Detail, oder das Signal, um die Zeit-Verlauf des neuronalen Reaktion auf ein Odorans Eluieren vom GC.
5. Um exaMine Die Population Reaktionen auf die verschiedenen eluierenden flüchtigen, integrieren die Feuerungsrate Reaktionen der einzelnen Einheiten über eine 3 sec Abtastfenster, 1,5 sec vor und 1,5 Sek. nach, die Retentionszeit der flüchtige (Abbildung 3). Dieser Zeitraum ist charakteristisch für die Dauer eines eluierenden flüchtigen vom GC. Wir zeigen Feuerungsrate Reaktionen der Einheiten durch Farbcodierung ihnen (Rot ist eine hohe Feuerungsrate Antwort; blau ist eine geringe Reaktion) und Anordnen derselben als Aktivität Matrix mit jeder Reihe, die die Reaktion auf das Ensemble GC Abstrom (Spalten) ( Abbildung 3).

Ergebnisse

In der GCMR Assay unter Verwendung des M. lewisii blumigen Duft, spritzen wir 3 ul der Extrakt in der GC. Die Gesamtzahl der flüchtigen Eluieren durch den GC beträgt typischerweise 60-70 flüchtigen. Der Duft von M. lewisii überwiegend aus Monoterpenoide zusammengesetzt, darunter β-Myrcen (azyklische) und α-Pinen, wobei der Rest der Duft von sechs Kohlenstoffatomen flüchtigen, wie 2-Hexanol und Sesquiterpene, die <1% der Kopfraum umfassen zusammengesetzt.

Diskussion

Insect olfaktorischen-vermittelte Verhaltensweisen treiben viele verschiedene Prozesse, einschließlich der Reproduktion, Host-Auswahl des Standortes, und die Identifizierung von geeigneten Lebensmitteln Ressourcen. Die Untersuchung dieser Prozesse erfordert die Fähigkeit, die flüchtigen Bestandteile aus der Quelle, als auch die Fähigkeit, diese Verbindungen, die Vermittlung der Verhaltensweisen identifizieren emittierten identifizieren. Erschwerend ist, dass Gerüche Dutzende bis Hunderte von einzelnen Verbindungen,...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bezeichnung des Gegenstands	Firma	Catalog Number	Kommentare
Porapak Typ Q 80-100 mesh	Fluten	WAT027060
Reynolds Backofen Taschen	Reynolds
GC	Agilent	7820A
GC-Säule	J & W Scientific, Folsom, CA, USA	DB-5 (30 m, 0,25 mm, 0,25 um)
Analytische Heliumträgergas	Praxair	HE K	1 ml / min
16-Kanal-Silizium-Elektrode	Neuronexus Technologien	a4x4-3mm50-177
Feindraht NiCr, 0,012 mm Durchmesser)	Sandvik Kanthal HP Reid	PX000004	Für die Herstellung benutzerdefinierte Tetroden und stereotrodes
Vorverstärker	Tucker-Davis-System	PZ-2
Verstärker	Tucker-Davis-System	RZ-2
Datenerfassungssystem - OpenEx suite	Tucker-Davis-System
Online spike-Sortierung Software - SpikePac	Tucker-Davis-System
Offline-spike-Sortierung Software - Mclust Spike-Sortier-Toolbox	David Redish, Department of Neuroscience, Universityof Minnesota	Kostenloser Download unter http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html	MATLAB-Toolbox