Messe Cytometry: Protokoll für die tägliche Tuning und Ausführen von Zellproben auf einem CyTOF Messe Cytometer

Zusammenfassung

Die Schritte, die zur täglichen Abstimmung und Optimierung der Leistung einer CyTOF Masse Zytometer beschrieben. Kommentare zu optimalen Probenaufbereitung und Durchfluss werden diskutiert

Zusammenfassung

In den letzten Jahren hat die schnelle Analyse von Einzelzellen üblicherweise durchgeführt mittels Durchflusszytometrie und fluoreszenzmarkierten Antikörpern. Allerdings ist das Problem der spektralen Überlappung von Fluorophor-Emissionen die Anzahl der gleichzeitigen Sonden begrenzt. Dagegen ist die neue Masse CyTOF Zytometer von DVS Sciences Paare eine Flüssigkeit einzellige Einführungssystem mit einem ICP-MS. ¹ Anstatt Fluorophore werden chelatisierende Polymere enthaltenden hoch angereicherten Metall-Isotope an Antikörper oder andere spezifische Sonden gekoppelt. ^2-5 Aufgrund der Metall-Reinheit und Massenauflösung der Masse Zytometer, gibt es keine "spektrale Überlappung" von benachbarten Isotope, und daher keine Notwendigkeit zur Kompensation Matrizen. Zusätzlich, aufgrund der Verwendung von Lanthanidmetallen, gibt es keine biologischen Hintergrund und damit kein Äquivalent Autofluoreszenz. Mit einer Masse Fenster Spanning Atommasse 103-203, theoretisch bis zu 100 Etiketten könnten gleichzeitig unterschieden werden. Gegenwärtig, Mehr als 35 Kanäle zur Verfügung mit dem Chelatisierungsreagenzien ab DVS Sciences, ermöglicht beispiellose Dissektion der immunologische Profil der Proben. ^6-7

Nachteile sind die Masse Zytometrie strengen Notwendigkeit eines gesonderten Metallisotops pro Sonde (kein Äquivalent vorwärts oder side scatter), und die Tatsache, dass es ein zerstörungsfreies Verfahren (keine Möglichkeit der Sortierung Rückgewinnung) ist. Die aktuelle Konfiguration der Masse Zytometer hat auch eine Zellen-Übertragungsrate von nur ca. 25% und erfordern somit eine höhere Anzahl von Zellen-Eingang.

Optimale tägliche Leistung der Masse Zytometer erfordert mehrere Schritte. Das grundlegende Ziel der Optimierung besteht darin, die gemessene Signalintensität der gewünschten Metall-Isotope (M) maximieren, bei gleichzeitiger Minimierung der Bildung von Oxiden (M 16), daß das M Signalintensität zu verringern und stören beliebiger Signal an M +16. Der erste Schritt ist, um sich aufzuwärmen das Gerät so ein heißer, stabile ICP Plasma hergestellt wurde. Zweitens müssen die Einstellungen für aktuelle und Make-up-Gas-Strömungsrate auf einer täglichen Basis optimiert werden. Während der Probenahme wird der maximale Zelle Ereignisrate von Detektor-Effizienz und die Verarbeitungsgeschwindigkeit zu 1000 Zellen / Sekunde begrenzt. Jedoch in Abhängigkeit von der Probe Qualität, eine langsamere Zelle Ereignisrate (300-500 Zellen / Sekunde) ist in der Regel wünschenswert, damit eine bessere Auflösung zwischen Zellen Ereignisse zu maximieren und somit intaktes Singuletts über Dubletts und Schutt. Schließlich trägt angemessene Reinigung der Maschine am Ende des Tages minimieren Hintergrundsignal durch freie Metall.

Protokoll

Alle Zellproben für die CyTOF müssen fixiert und permeabilisiert werden. Dies ermöglicht eine größere Eintrag des Iridium-haltigen DNA-Interkalator, und verhindert auch, dass während der Zelllyse MilliQ Wasser waschen und Resuspension Schritte unmittelbar vor der Injektion in die Masse Cytometer.

Ein. Start-up der Messe Cytometer

1. Öffnen Sie die CyTOF Software-Programm. Wählen Sie Instrument Setup. Auf der Karte Cage Registerkarte in der rechten unteren Ecke und klicken Sie Heater "ON"-Taste. Einschalten der Heizung mindestens 15 min vor der gewünschten Zeit, um genügend Zeit für die Sprühkammer Mantels erlauben bis 200 ° C zu erreichen
2. Setzen Sie die weiße Norm-Ject 3 ml Spritze in die Spritzenpumpe mit einer frischen Spritze mit MilliQ Wasser gefüllt.
3. Reinigung Vernebler. BackFlush den Vernebler, indem die Spritze und Schlauch bis 5% Citranox 2-3 mal durch die beiden kleineren flüssigen Einführung Hafen und dem größeren Gaseinleitungsöffnung ziehen. Wiederholen Rückspülung mit MilliQ Wasser to Reste von Citranox.
4. Überprüfen Sie, um zu bestätigen, dass die Lichter auf der Vorderseite des CyTOF wie in Abbildung 1 leuchten.

Abbildung 1. CyTOF Bedienfeld leuchtet vor der Inbetriebnahme.

5. Öffnen Argongas Flaschenventil. Dies sollte die "ARGON" Licht an der Vorderseite zum Einschalten führen.
6. Befestigen Sie den Vernebler, um Make-up Gaseinlass. Lösen Sie das Make-up Gasschlauch Anschluss und entfernen Sie die schwarze Gummi-O-Ring und das weiße konische Stück Plastik. Beachten Sie den breiteren "Knöchel" auf der Gaseinleitungsöffnung Schaft des Verneblers. Legen Sie den Stecker auf der Gaseinleitungsöffnung. Setzen Sie die schwarze O-Ring über das Ende des Gases Port und zwingen den O-Ring an der breitere Teil des Hafens Stiel. Setzen Sie das weiße konische Kunststoff-Stück auf der Oberseite mit dem schmalen Ende wies darauf hin, und Schraube auf dem Make-up Gasschlauch.
7. Befestigen Sie den Vernebler in den flüssigen Einführung Schlauch. Schieben Sie den kleinen Schlauch in die Öffnung am Ende des Zerstäubers. Es werden zwei Haltestellen, ähnlich fühlen, zu den Anschlägen auf einer Mikropipette sein. Drücken Sie zunächst, bis Sie leichten Widerstand treffen, das Ende des kleinen Schlauch sollte am Ende des geraden Abschnitts aus Glas sein. Zweitens drücken Sie stärker, um das Ende des geraden Abschnitts des Glases weitere Kraft in die Armatur, und ziehen Sie die Verschraubung zu versiegeln. Stecken Sie das Ende des Zerstäubers in die weiße Öffnung im Heizmantel.
8. Auf der RFG-Controller auf der Registerkarte Instrument Setup-Fenster, drücken Sie "Start Plasma". Da der Zerstäuber bereits eingelegt ist, drücken Sie "OK". Die Software wird auf dem Kühler drehen, beginnen die Strömung des Gases, und zünden ein Plasma. Der Detektor Spannung hochfahren. Es wird ein Pop-up-Fenster mit der Meldung "Plasma Start-up-Sequenz wurde erfolgreich abgeschlossen", wenn Sie fertig sein; drücken Sie "OK". New Lichter sollten auf der Vorderseite (Abbildung 2 >).

Abbildung 2. CyTOF Bedienfeld leuchtet nach Plasma und gezündet Start-up erfolgreich abgeschlossen.

9. Einschalten Spritzenpumpe. In der oberen rechten Ecke, die grüne Taste "Play"-Taste, um die Spritze Pumpe zu starten und beginnen strömenden Flüssigkeit durch den Schlauch und Spritzen aus dem Zerstäuber. Die Standard-Spritze Einstellungen sind für 3 ml Wasser. Damit Probe durch die Probenschleife fließen muss der Spritzenpumpe periodisch geändert werden, wenn es nicht mehr genügend Wasser. Am oberen Rand des Bildschirms besteht ein Zähler angibt, wie viel Flüssigkeit aus der Spritze Pumpe geflossen ist. Die Spritzenpumpe wird gestoppt, wenn dieser Zähler "3,000" oder den Kolben erreicht trifft das Ende der Spritze. Beim Nachfüllen der Spritze, müssen Sie klicken Sie auf "Stop", anstatt das blaue "Pause"-Taste, um den Zähler zurückzusetzen.

e "> 2. Tägliche Kalibrierung der Messe Cytometer

1. Die Masse Zytometer benötigt ca. 20 min, um eine heiße, stabiles Plasma vor der Kalibrierung zu erreichen. Der Zweck der Abstimmung Schritte ist es, das gewünschte Signal der Tm169 oder Tb159 zu maximieren und gleichzeitig "Gd155" (Oxid; La139 + O16)-Signal unter 3% des höheren Wertes. Klicken Sie auf die Akquisition Schaltfläche Einstellungen, um die Datenerfassung Einstellungen Fenster zu öffnen. In der Analyten Registerkarte, klicken Sie auf das Periodensystem, um das Isotop Auswahl zu öffnen. Wählen Sie die Isotope im DVS Sciences Tuning-Lösung in der Bedienungsanleitung aufgeführt sind, klicken Sie dann auf "Speichern".
2. Klicken Sie auf die Isotope Per Lesen-Taste, um die Messe (n) Per Lesen öffnen. Wählen Sie "Impulse Count" und Skalieren der Y-Achse durch Eingabe einer neuen Nummer und drücken Sie "Enter".
3. Füllen Sie einen grünen 1 ml Norm-Ject Spritze mit Tuning-Lösung. Drehen Sie den Sample-Anschluss Wahlschalter auf "LOAD", injizieren 450 ul Tuning-Lösung, dann drehen Sie den Wahlhebel zu "injizieren". In der Messe Registerkarte Kalibrierung des Data Acquisit ion Fenster Einstellungen klicken Sie auf "Ausführen" zu überwachen, welche Massen werden durch fließt. Die linke Seite des Fensters geringer Masse, während die rechte Seite höher Masse. Anmerkung: Es wird schon Signale in der TOF 9400-9800 Region aufgrund Xenonisotope im Argongas (Abbildung 3). Warten Sie, bis Tuning-Lösung Isotopen erscheinen als Streifen in diesem Display (Abbildung 4) starten.

Abbildung 3. Massenkalibrierung Registerkarte angezeigt, der Hintergrundwerte für verschiedene Isotope nach dem Waschen und Wasser abspülen. Die Region rund um TOF 9400-9800 entspricht Xenon-Isotope in der Argon-Gas, und sollte immer vorhanden sein. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

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Abbildung 4. Massenkalibrierung Registerkarte angezeigt, der vertikale Streifen für verschiedene Isotope im DVS Tuning-Lösung. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

4. Gehen Sie zurück zu der Messe (n) Per Lesefenster und die grüne Taste "Play"-Button in der linken oberen Ecke. Jedes Isotops in Schritt 2.1 ausgewählt wird von einem anderen farbigen Linie dargestellt. Die Standard-x-Achse ist "Time", in sek. Überwachen Sie die Ebenen der verschiedenen Isotope, bis sie stabil sind.
5. Tuning des Stroms. Auf der Registerkarte Parameter des Data Acquisition Fenster, wählen Sie "Current" aus der Drop-Down-Menü. Lassen start = 0, finish = 10, Step-Wert = 0,5, Einschwingzeit = 200, und drücken Sie "speichern". Klicken Sie wieder auf der Messe (n) Per Lesefenster und Hit spielen. Die x-Achse ist nun "Current". Beachten Sie, wo die Signale der Isotope Peak (siehe Abbildung 5), und r ecord. Unter dem DAC Kanäle Registerkarte Setup des Instruments Setup-Fenster, scrollen Sie auf "Current" und geben Sie diesen neuen Wert. Drücken Sie "Stromistwert Set", dann "speichern unter".

Abbildung 5. Aktuelle Tuning-Profil.

6. Tuning der Make-up-Gas. Ändern Sie im Dropdown-Menü "Make-up-Gas." Lassen start = 0,55, end = 0,95, Step-Wert = 0,05, Einschwingzeit = 200. Drücken Sie sparen. Zurück zur Messe (n) Per Lesefenster und Hit spielen. Die x-Achse ist nun "Make-up-Gas" Durchfluss. Aufzuzeichnen, wo die Signale der Isotope Peak. Beachten Sie die rasche Zunahme der "Gd155"-Signal am Ende (Abbildung 6). Zurück zur DAC Kanäle Registerkarte Setup unten scrollen, um "Make-up-Gas", und geben Sie diesen neuen Wert. Drücken Sie "Stromistwert Set", dann "speichern unter".

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Abbildung 6. Make-up-Gas Tuning-Profil.

7. Aufzeichnungsverhältnis gewünschte Isotop vs Oxid. Machen Sie eine zweite 450 ul Injektion von Tuning-Lösung. Auf der Registerkarte Parameter, wählen Sie "Time" aus der Drop-down-Menü, lassen start = 0, end = 10, Schritt-Wert = 1, Einschwingzeit = 200. Drücken Sie auf "Speichern". Hit "Play" in Mass (n) Per Lesefenster. Nachdem die Linien stabilisiert zu haben (Abbildung 7), verwenden Sie den Cursor auf den Wert in der oberen linken Boxen für Tm169 oder Tb159 (höherer Wert) lesen und auch die "Gd155" Wert (<3% des höheren Wertes). Diese Werte können auch in einer Tuning-Datei für zukünftige Referenz gespeichert werden.

Abbildung 7. Messung der Tuning-Lösung Signalintensitäten nach Optimierung Strom-und Make-up-Gas.

8. Reinigung von samschen Schleife. Inject 3 ml MilliQ Wasser durch die Probenschleife, gefolgt von 500 ul DVS Waschlösung. Überwachen Sie den Fortschritt der Reinigung durch Drücken von "run" in der Messe Register Kalibrierung. Waschen, bis die Intensität der Streifen (Abbildung 4) abzunehmen beginnt, dann folgen von 3 ml MilliQ Wasser und Monitor bis hinunter in den Hintergrund Ebenen (Abbildung 3).

3. Laufende Proben

1. Öffnen Sie den Erwerb Fenster. Standardeinstellungen: Haben Analysis = On-The-Fly, Signal = Dual, Dual Count Kalibrierung = Daten zu analysieren. Noise Reduction ausgewählt ist. Jedes davon kann bei Bedarf geändert werden. Geben Sie den Dateinamen ein. Alle Dateien müssen auf die E :/ / Laufwerk gespeichert werden.
2. Einstellen Übernahme Verzögerungen. Es wird eine leichte Verzögerung bei der Registrierung von Ereignissen Zelle von etwa 30 sec aufgrund der Länge der Rohrleitung zwischen der Probenschleife und dem Zerstäuber sein. Daher ist die Summe der "Erwerb delay" und "Detector stFähigkeit Verzögerung "soll mindestens 30 sec betragen. Detector Stabilität Verzögerung sollte wenigstens 20 sec betragen.
3. Einstellen Datenerfassung Zeit. "Acquisition time" ist die Anzahl der Sekunden Sie möchten Ihr Beispiel auszuführen. Füllen des gesamten 450 ul Probenschleife erfordern würde 600 sec dauern. Es wird vorgeschlagen, daß 50 bis 100 sec zu dem Ende der Laufzeit hinzugefügt werden, um Probe zu minimieren Verschleppung.
4. Resuspension der Probe. Zur Minimierung Aufbau von Salzen in der Maschine wird vorgeschlagen, daß mindestens zwei Waschungen in MilliQ Wasser durchgeführt werden am Ende der Zelle Färbung, gefolgt von einer abschließenden Resuspension in MilliQ Wasser. Das Volumen der MilliQ-Wasser verwendet, um das Zellpellet in Abhängigkeit von der Anzahl von Zellen mit dem Sie angefangen und der Zelle Erholung nach der gesamten Färbeverfahrens wird resuspendieren. Ein guter Ausgangspunkt ist 10 ⁶ (Start-) Zellen / ml. Nach der Resuspension durch ein Zellsieb filtern, um Aggregate zu entfernen.
5. Ausgehend Beispiel auszuführen. Geben Sie einen neuen Dateinamen für die aktuelle Probe. Schalten Sie die Probenschleife Ventil "LOAD", injizieren die Probe, wechseln Sie zurück zu "injizieren", dann klicken Sie auf "Run" in der Akquisition Fenster.
6. Registrierung Zelle Veranstaltungen. Zellen werden in dem Snapshot-Fenster als horizontale Sammlungen von Markierungen in jeder vertikalen Isotop / Marker Kanal (8) dargestellt werden. Während die Masse Zytometer 1.000 Zellen / sec registrieren können, wird eine bessere Auflösung zwischen Zelle Ereignisse in der Regel bei 300-500 Zellen / sec erhalten. Dies entspricht einem Durchschnitt von ~ 1 Zelle / screen refresh. Es kann bis zu 30 Sekunden, bevor die Zelle Event Zähler beginnt zu klettern. Dies ist auf "On-the-fly" Datenverarbeitung; keine Zelle Event Informationen verloren gehen.

Abbildung 8. Acquisition Fenster während Probe läuft, zeigt horizontalen Reihen von Stellen entsprechend den Elementen mit drei separaten Zelle Ereignissen verbunden.ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen.

7. Qualität der Zelle Ereignisse. Beachten Sie alle Hintergrund-Streifen in jedes Isotop-Kanal sowie der Zelle Ereignisrate. Die Masse Zytometer erkennt eine "Zelle Veranstaltung" als eine gewisse Zunahme des Signals über dem Untergrund, so Hintergrundsignal aus freien Metall oder ungebundene Antikörper können die "Zelle Event" count ändern. Zusätzlich kann ausgeführt Zellen mit zu hoher Konzentration zu einer erhöhten Anzahl von Dublett Ereignisse. Hintergrund kann durch zusätzliche Wäschen oder mehr Zellverdünnung vermindert werden. Dubletts kann durch größere Zellverdünnung minimiert werden, auf Kosten eines erhöhten Laufzeit.
8. Finishing Probe Datenerfassung. Wenn die Erfassungszeit erreicht ist, wird die Datenerfassung beendet. Es wird ein wenig Verzögerung, bevor ein Pop-up-Fenster mit sein ein "OK"-Taste erscheint, wieder ist dies durch "On-the-Fly" Datenverarbeitung. Abtastmodus kann auch gestoppt Prémat werdenurely durch das Drücken der "Stop"-Taste. In diesem Fall werden alle Zellen bereits registrierten Ereignisse gezählt und in Ausgabedateien verarbeitet werden.
9. Injection von mindestens 500 ul MilliQ Wasser zwischen jeder Probe auch minimiert Probenverschleppung.

4. Reinigen des Geräts Nach dem Gebrauch

1. Waschlösung. Nach der letzten Probe wird ausgeführt und die Probenschleife mit Wasser gespült, injizieren 450 ul Waschlösung in die Probenschleife. Überwachen Sie die Freisetzung von freiem Metall in der Messe Kalibrierung der Registerkarte Data Acquisition Fenster Einstellungen wie in Schritt 2,8 (Abb. 9). Wenn das freie Metall-Signal zu verringern beginnt, mit 3 ml MilliQ Wasser spülen und zu überwachen, bis Hintergrundwerte erreicht werden.

Abbildung 9. Massenkalibrierung Registerkarte Fenster, während der Post-run Reinigung mit DVS Waschlösung. Die vertikalen Streifen im TOF Region 9800-11000 sind Antikörper-Label Isotope aus der Maschine gereinigt werden. Die vertikalen Streifen rund TOF 11500 zu den beiden Ir Interkalator Isotopen entsprechen. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

5. Abschalten der Maschine

1. In der RFG-Controller auf der Registerkarte Instrument Setup-Fenster, wählen Sie "Stop Plasma". Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, wird es ein Pop-up-Fenster mit der Aufforderung, die Vernebler entfernen. Drücken Sie auf "OK". In der Karte Cage Registerkarte schalten Sie die Heizung. Schließen Sie das Ventil auf der Argon-Versorgung.
2. Entfernen der Vernebler. Entfernen Sie den Vernebler aus der Sprühkammer durch vorsichtiges Ziehen nach hinten. Lösen Sie die Probe Einführung Schlauch aus Schritt 1,6 und legen beiseite. Lösen Sie das Make-up Gaseinleitung Verbindung zu leicht lösen, dann ziehen Sie den Vernebler aus. Verlassen die Armatur verschraubt reduziert die Chancen von lOsing den schwarzen Gummi-O-Ring und weiß konische Stück Plastik.
3. Reinigung Vernebler. BackFlush beide Ports der Vernebler mit 5% Citranox mit der Spritze und Schlauch wie in Schritt 1.3. Speichern Sie, bedeckt, in 5% Citranox bis zum nächsten Gebrauch.

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Ergebnisse

Nach dem obigen Protokoll sollte durchzuführen vier Dinge. Erstens wird damit ausreichende Aufwärmzeit für die Masse Zytometer erzeugen einen heißen, stabiles Plasma für optimales Signal und minimalen Oxidbildung. Zweitens ausreichendes Waschen der Masse Zytometer mit MilliQ Wasser und DVS Waschlösung (Abbildung 9) wird dazu beitragen, die Niveaus von Metall Adsorption an die Schläuche und andere Teile der Maschine und hilft, Hintergrund während Probenaufnahme reduzieren (Abb. 8).

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Diskussion

In den letzten Jahrzehnten hat sich Fluoreszenz-Durchflusszytometrie war ein Arbeitstier Verfahren zur Analyse von einzelnen Zellen, sowohl in Bezug auf Oberflächen-Expression und funktionelle Assays. Allerdings hat die Fragen der spektralen Überlappung der Fluoreszenzfarbstoffe die Anzahl der gleichzeitigen Marker begrenzt. Während Experimente mit mehr als 12 gleichzeitige Marker gemeldet wurden, macht die Höhe der Entschädigung notwendigen dies technisch schwierig.

Statt Fluorophore, ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
CyTOF TM Masse Zytometer	DVS Sciences
Waschlösung	DVS Sciences	201071	0,05% Flusssäure in Wasser
Tuning-Lösung	DVS Sciences	201072	0,5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, Spurenelemente Salpetersäure
Eu-haltigen Polystyrol-Kügelchen	DVS Sciences	201073	Enthält natürliche Überfluß Eu Isotopen; Perlen an rund 1 Mio. / ml geliefert
Multi-Lanthanoid-(La / Pr / Tb / Tm / Lu) - Polystyrol-Kügelchen	DVS Sciences	Noch nicht im Handel erhältlichen	Enthält natürliche Überfluß Isotope von börsennotierten Lanthaniden
Salpetersäure (konzentriert)	Fisher Scientific	A467-500	Optima Spur-Metall reinen ICP-MS Grade
Polystyrol mit rundem Boden Rohr mit Zell-Sieb cap-5mL	BD	352235	verwendet werden, um Zellproben vor der Injektion filtern
Norm-Ject Tuberkulin Spritze 1ml	Henke Sass Wolf	4010-200V0	silikonfrei, latexfrei
Norm-Ject Spritze-3 mL	Henke Sass Wolf	4010.000V0	silikonfrei, latexfrei
MilliQ Wasser			18 M reines Wasser, darf nicht in Glas-oder Plastikflaschen, die mit handelsüblichen Waschmittel (wegen ihrer hohen Barium-present) gewaschen wurden gespeichert werden.
Citranox	Sigma-Aldrich	Z273236	saures Reinigungsmittel
Argon-Gas	Praxair	AR 5.0UH-T	99,999% Ultra-hohe Reinheit