Orthotopen Mausmodell der Darmkrebs-

Zusammenfassung

Zwei Techniken können verwendet werden, um dieses Modell zu etablieren werden: Injektion einer Krebszelle Suspension in den Blinddarm Wand oder Transplantation von einem Stück des subkutanen Tumor auf den Blinddarm. Dieses Modell ist nützlich für die Untersuchung der natürlichen Entwicklung von Darmkrebs und Erprobung neuer Therapeutika gegen den Darmkrebs.

Zusammenfassung

Die traditionellen subkutanen Tumor-Modell ist weniger als ideal für das Studium des kolorektalen Karzinoms. Orthotopen Mausmodell des kolorektalen Karzinoms, die Krebszellen wachsen in ihrem natürlichen Standort-Funktion, replizieren menschlichen Krankheiten mit hoher Wiedergabetreue. Zwei Techniken können verwendet werden, um dieses Modell zu etablieren. Beide Techniken sind ähnlich und erfordern Maus Anästhesie und Laparotomie für die Exposition des Blinddarms. Eine besteht darin, Injektion eines kolorektalen Karzinoms Zellsuspension in den Blinddarm Wand. Krebszellen werden zuerst in Kultur angebaut, geerntet, wenn subkonfluenten und hergestellt, wie eine einzelne Zelle Suspension. Ein kleines Volumen der Zellen wird langsam, um ein Auslaufen zu vermeiden injiziert. Die andere Technik beinhaltet die Transplantation von einem Stück des subkutanen Tumor auf den Blinddarm. Eine Maus mit einem vorher festgelegten subkutane kolorektalen Tumor eingeschläfert und der Tumor wird entfernt, indem sterile Technik. Der Tumor Stück ist in kleine Stücke für die Transplantation zu einem anderen Maus unterteilt. Vor der Transplantation wird der Blinddarm Wand leicht beschädigt, um Tumor-Zell-Infiltration zu erleichtern. Die Zeit bis zur Entwicklung von Primärtumoren und Lebermetastasen hängt von der Technik-, Zell-Linie, und die Maus Arten verwendet. Diese orthotopen Mausmodell ist nützlich für die Untersuchung der natürlichen Entwicklung von Darmkrebs und Erprobung neuer Therapeutika gegen den Darmkrebs.

Protokoll

I. Cell Preparation

1. Darmkrebs-Zellen in Kultur gezüchtet und geerntet werden, wenn subkonfluenten.
2. Eine einzelne Zelle Suspension wird in Phosphat-gepufferter Saline und auf Eis gehalten.

II. Tumor Vorbereitung

1. Eine Maus mit einem vorher festgelegten subkutane kolorektalen Tumor eingeschläfert.
2. Die subkutane Tumor wird entfernt, indem sterile Technik und in 2-3 mm Stücke geteilt
3. Der Tumor Stücke sind in Phosphat gehalten Kochsalzlösung auf Eis.

III. Maus Vorbereitung

Hinweis: In unserem Labor verwenden wir eingeatmet Isofluran, um die Maus zu betäuben, alternativ kann man Injektionsnarkosemittel verwenden, um denselben Effekt zu erzielen

1. Die Narkosetiefe wird anhand Zehen klemmen. Es sollte keine zurückzutreten Reflex mit Zehen klemmen.
2. Antibiotika können an dieser Stelle gegeben werden.
3. Die narkotisierten Maus, die vorher rasiert wurde, richtig positioniert ist.
4. Der Bauch ist mit einem betadine Lösung vorbereitet.
5. Die Bauch-und OP-Gebiet sind in einer sterilen Mode drapiert.

IV. Laparotomie

1. Eine kleine Nick ist in die Haut gemacht
2. Die Bauchwandmuskulatur begriffen und hob
3. Die Bauchhöhle wird eingegeben und ein einziges Blatt der Schere wird verwendet, um die intra-abdominale Inhalte wegschieben
4. Der Schnitt wird um 2-3 cm verlängert

V. Exposure des Blinddarms

1. Der Blinddarm mit seinen blind endende Tasche identifiziert und exteriorisierten
2. Der Blinddarm ist vom Rest der Maus über einen pre-cut, sterile Gaze isoliert
3. Warm Kochsalzlösung wird verwendet, um den Blinddarm feucht zu halten

VI. Injektion von Zellen in den Blinddarm Wand

1. A 27 G oder feiner Nadel wird benutzt, um eine 50 ul Volumen von Zellen in den Blinddarm Wand spritzen
2. Die Nadel wird entfernt
3. Die Einstichstelle wird überprüft, um sicherzustellen, keine Leckage
4. Der Blinddarm ist es, die Bauchhöhle zurück

VII. Die Transplantation von Tumor auf den Blinddarm

Hinweis: Zusätzlich zu injizieren Zellen in den Blinddarm Wand, ist ein alternativer Ansatz zur Tumor auf den Blinddarm Transplantation

1. Eine Figur von 8 Stich ist auf den Blinddarm mit 6-0 oder 7-0 große Naht gelegt
2. Der Blinddarm Wand ist leicht beschädigt
3. Dann wird der Tumor Stück positioniert
4. Der Stich ist festgebunden
5. Der Blinddarm ist es, die Bauchhöhle zurück

VIII. Maus Bauchwand Closure and Recovery

1. Die Maus Bauchdecke geschlossen ist mit drei Stichen unterbrochen mit 3-0 oder 4-0 große Naht
2. Alternativ kann man mit einem einfachen Laufstich
3. Postoperative Schmerzmittel und ein Flüssigkeitsbolus kann an dieser Stelle gegeben werden
4. Die Maus ist erlaubt, aus der Narkose zu erholen.

Hinweis: Bei Inhalationsanästhetika dies in der Regel dauert 30 Sekunden

IX. Ergebnisse - Primärtumor und Lebermetastasen

Primary Tumor - in situ gezeigt (A) und mit dem Nachweis der Gefäßneubildung (B), auf H & E-Färbung, sind Tumoren lokal invasive (C)

Lebermetastasen - gezeigt, ex vivo (D)

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Diskussion

Obwohl Maus subkutanen Tumor-Modellen leicht festzustellen und zu überwachen sind, ist es klar, dass dieses Modell nicht replizieren kann die ursprüngliche anatomische Stelle von Darmkrebs. Aufgrund der Differenz in Mikroumgebung haben kolorektalen Krebszellen wachsen unter der Haut gezeigt, ihren Phänotyp zu ändern und fast immer keine Fortschritte und metastasieren ^1,2. In der Tat können Ansprechen des Tumors auf die Therapie erheblich variieren je nachdem, ob Krebszellen in einer Eileiterschwangerschaft (subkutan) versus ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture media and components			will vary depending on cell line used
Phosphate Buffered Saline	BioWhittaker	17-512F	also sold by a number of other vendors
15 mL centrifuge tubes, polypropylene	Corning	430790
6 well plates with lid	BD Biosciences	353046
Iris forceps, straight, serrated tips	World Precision Instruments, Inc.	15914	best to have a pair of these instruments
Iris dissecting scissors, straight, sharp	World Precision Instruments, Inc.	14393
Needle Holder (regular)	World Precision Instruments, Inc.	14109
Needle Holder (Castroviejo)	World Precision Instruments, Inc.	14137
Cidex Plus	World Precision Instruments, Inc.	7364	instruments should be autoclaved periodically, but may also be sterilized by soaking in Cidex
6-0 or 7-0 suture			for cecum; courtesy of Department of Surgery, UCSF
3-0 or 4-0 suture			for abd wall; courtesy of Department of Surgery, UCSF
Anesthetic machine / Isoflurane	J.A. Baulch and Associates	3206	also sold by a number of other vendors
Heating Pad, disposable, 6" x 6"	Prism Technologies	20419
Tape, orange, 13 mm x 13 m	Fisher Scientific	15901F	for restraining anesthetized mouse
Pro-Cord/Cordless Trimmer	Oster Professional Products	78997-010	for shaving mouse fur
Betadine	Fisher Scientific	19-027132	may also be purchased at any medical supply store
2 x 2 gauze, 3-ply	Johnson & Johnson	7635	may also be purchased at any medical supply store
Sterile Field, Barrier, 16" x 29"	Johnson & Johnson	0905	may also be purchased at any medical supply store
Cotton tipped applicators, 6"	Fisher Scientific	14-960-3Q	may also be purchased at any medical supply store
Syringe, 10 cc, Luer lock tip	BD Biosciences	309604
Syringe, 1 cc, tuberculin, slip tip	BD Biosciences	309602
27 1/2 G needle	BD Biosciences	305109
30 G needle	BD Biosciences	305106