Visualisierung von endoplasmatischen Retikulum lokalisierte mRNAs in Säugerzellen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Verfahren zum endoplasmatischen Retikulum-assoziierte Säugetier-mRNAs in Gewebekulturzellen zu visualisieren. Diese Technik umfasst die selektive Permeabilisierung der Plasmamembran mit Digitonin zur cytoplasmatischen Inhalt durch fluoreszierende entfernen, gefolgt In situ Hybridisierung entweder lose Poly (A) mRNA oder spezifischen Transkripte zu erfassen.

Zusammenfassung

In Eukaryoten meisten der messenger RNA (mRNA), die sezernierte und Membranproteinen an die Oberfläche des endoplasmatischen Reticulums (ER) lokalisiert codieren. Jedoch kann die Visualisierung dieser mRNAs Herausforderung sein. Dies gilt insbesondere, wenn nur ein Bruchteil der mRNA ist ER-assoziierte und deren Verteilung zu dieser Organelle durch nicht anvisierten (dh "frei") Transkripte behindert. Um ER-assoziierten mRNAs überwachen, haben wir ein Verfahren, bei dem Zellen mit einer kurzen Belichtungszeit eine Digitonin Extraktionslösung, die selektiv permeabilisiert die Plasmamembran behandelt werden entwickelt und entfernt somit die zytoplasmatischen Inhalt, während gleichzeitig die Integrität des ER . Wenn dieses Verfahren mit Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) gekoppelt ist, kann man klar zu visualisieren ER-gebundenen mRNAs durch Fluoreszenzmikroskopie. Über dieses Protokoll der Grad der ER-Verband entweder lose Poly (A)-Transkripte oder bestimmte mRNAs beurteilt werden kannund sogar quantifiziert. Bei dem Verfahren kann man mit diesem Assay, um die Natur des mRNA-ER Wechselwirkungen zu untersuchen.

Einleitung

In Eukaryoten sekretiert mRNA und Membranproteine ​​können zum ER co-translational von dem Signalerkennungspartikel ^1,2 ausgerichtet sein und kann auf der ER aufrechterhalten werden über die direkte Wechselwirkungen zwischen Ribosomen und translocons während der Übersetzung ^3,4. Doch ob mRNAs können gezielte und gepflegt werden am ER unabhängig von entweder Ribosomen oder Übersetzung war bis vor kurzem unklar. Frühere Studien haben versucht, anzusprechen, ob es translation-unabhängige mRNA zusammen mit dem ER über zelluläre Fraktionierung Techniken. Da harten chemischen Bedingungen waren erforderlich, um Ribosomen aus ER abgeleitete Vesikel, die die potenziell heikle mRNA-ER Vereins stören könnte distanzieren, waren diese Studien nicht schlüssig, den Nachweis für ^5-8 und gegen ^9,10 ribosomalen-unabhängige Verankerung der mRNA in die Notaufnahme .

Um diese Probleme zu umgehen, haben wir einen Prototypen entwickelt,col zu isolieren und Bild ER-gebundenen mRNAs. Dieses Verfahren beinhaltet eine milde Extraktionsbehandlung, die effektiv entfernt alle cytoplasmatischen Inhalt der Zelle (einschließlich nicht-gebundenen mRNAs ER) bei gleichzeitigem Erhalt der Morphologie und ER alle verbundenen Moleküle. Mit diesem Protokoll haben wir gezeigt, dass eine Untergruppe von mRNAs werden gezielt und dann beibehalten am ER unabhängig von Ribosomen oder Translation ^11.

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Protokoll

Ein. Herstellung von Materialien für die Extraktion

1. Herstellung von Zellen
   1. Saatgut Gewebekulturzellen am säurebehandelten Deckgläser für mindestens einen Tag vor dem Experiment. Wir verwenden COS-7 oder U2OS, da diese beiden Zelllinien robuste Produktion von sekretierten Proteins aufweisen und haben einen gut definierten ER. Beachten Sie, daß eine hohe Extraktionseffizienz zu erreichen, Zellen sollten nicht mehr als 80% Konfluenz auf dem Deckglas auf dem Tag des Experiments.
   2. Wenn ein bestimmter exogenen mRNA untersucht wird, werden die Zellen transfiziert einen Tag nach Impfen mit Plasmide, die das Gen von Interesse unter Verwendung von Standardverfahren Transfektionsprotokolle. Die Zellen werden dann ließ man die mRNA für mindestens 18 Stunden vor der Extraktion auszudrücken.
2. Behandlung der Zellen mit Translation Inhibitoren
   1. Um die Wirkung der intakten Ribosomen zur Aufrechterhaltung von mRNAs Assoziation mit dem ER testen, können Zellen mit Übersetzung Inhibitoren, die die Assoziation stören behandelndenRibosomen von ^11, mit der mRNA.
   2. Inhibitoren der Translationsinitiation wie homoharringtonin (HHT), Pactamycin, oder 2 - (4-Methyl-2 ,6-dinitroanilino) - N-methylpropionamid (MDMP), verhindern, dass neue Ribosomen aus Assoziieren mit dem Transkript, während gleichzeitig in Eingriff zu Ribosomen Vollständige Übersetzung ^12-14. Da der Translationsrate für die meisten Proteine ​​in Säugerzellen ist das 5 Aminosäuren pro Sekunde, unabhängig von Codonverwendung oder mRNA Länge ¹⁵ soll eine Behandlung von 30 min klar Ribosomen off von Nachrichten mit offenen Leserastern, solange 27.000 Nukleotiden (für Proteine ​​kodieren, Solange 9000 Aminosäuren).
   3. Inhibitoren wie Puromycin fördern die vorzeitige Ausstoßen der entstehenden Kette unterbrechen und somit Polysomen ^12. Jedoch vollständig stören die Assoziation von Puromycin behandelten Ribosomen mit der mRNA, muss Magnesium Chelatoren wie EDTA zum Digitonin Extraktionspuffer ¹¹ hinzugefügt werden.
   4. In diesem Experiment werden die Zellen mit 200 pM Puromycin, 5 uM HHT, oder Kontrollmedium für 30 min vor der Extraktion behandelt.
3. Vorbereitung der Digitonin Extraction Buffer. ER-lokalisierte mRNAs ohne Behinderung der freien (dh cytoplasmatischen, nicht-ER-assoziiert) Transkripte visualisieren, wir selektiv permeabilisieren der Zelle mit Digitonin, ein Steroid Glykosid, das bevorzugt in Wechselwirkung mit 3β-hydroxysterols. Bei niedrigen Konzentrationen, Digitonin selektiv permeabilisiert Abschnitte der Plasmamembran, was 'Undichtigkeit' ^16. Im Gegensatz dazu werden die ER-Membran und Kernhülle, die arm an Cholesterin sind, intakt gelassen ^16,17.
   1. Digitonin (Sigma Aldrich) Pulver wird in destilliertem Wasser bei 5% Gewicht / Volumen gelöst und diese Stammlösung wird in kleine Volumina aliquotiert und bei -20 ° C. Nach unserer Erfahrung nimmt mehreren Gefrier-Auftau-Zyklen, die Effizienz des gelösten Digitonin.
   2. Eine Stammlösung von10x CHO-Puffer (1x Arbeitslösung Konzentration: 115 mM KAc, 25 mM HEPES pH 7,4, 2,5 mM MgCl _{2, 2} mM EGTA und 150 mM Saccharose) mit RNase-freie Reagenzien hergestellt und bei -20 ° C. Eine Arbeitslösung (1x Puffer CHO) wird durch Verdünnen der Stammlösung mit RNase-freiem Wasser hergestellt und kann bei 4 ° C gelagert werden

2. Digitonin Extraction

1. Vorbereiten Extraction Lösungen
   1. Ein Heizblock mit einer flachen Oberfläche vorgewärmt wird auf 40 ° C und bei dieser Temperatur während der Extraktion.
   2. Um eine flache Arbeitsfläche, die frei ist RNase bilden, wird der Heizblock mit etwas Wasser und überlagert mit einem frischen Stück Parafilm M (Bemis Company, Inc) befeuchtet. Luftblasen zwischen der Folie und Parafilm Heizblock werden unter Verwendung von RNase-freier Handschuhe und Kimwipes (VWR) geglättet.
   3. 1x CHO Puffer wird auf 37 ° C durch Inkubation in einem Wasserbad erwärmt.
   4. 6-Well-Platten verwendet werden, um zu waschenund fixieren die Zellen. Jede Zeile 3 Brunnen ist für ein Deckglas verwendet. Auf die ersten beiden Wells in der Reihe, wurde mit 2 ml erwärmten CHO-Puffer zugegeben. Zur letzten gut, 2 ml der Fixierungslösung (PBS + 4% Paraformaldehyd (Electron Microscope Sciences)) zugegeben. Dieses Fach kann in der 37 ° C-Inkubator aufbewahrt werden, bis die Zellen bereit für die Extraktion sind.
   5. Digitonin Extraktionslösung wird durch Verdünnen der Lösung auf Lager Digitonin 0,025% mit warmem CHO Puffer unmittelbar vor der Verwendung hergestellt. Wiederum beachten, dass für Puromycin-behandelten Zellen, der Extraktionspuffer müssen zusätzlich 20 mM EDTA, um effizient zu stören Ribosomen ^11. Drops von 100 ul der Extraktionslösung auf dem Parafilm bedeckten Heizblock unmittelbar vor Extraktion platziert.
2. Digitonin Extraction and Cell Fixation
   1. Entfernen der Zellen aus dem 37 ° C Inkubator.
   2. Während des Extraktionsvorgangs werden Deckgläser mit Hilfe der Pinzette jewler manipuliert. Mitdie Zange abholen Deckglas und tauchen sie in die erste und dann die zweite auch mit CHO Puffer des Wachstumsmediums waschen.
   3. Schnell abtupfen überschüssige Puffer von der Rückseite des Deckglases mit einem Kimwipe und sofort setzen das Deckglas, Zell-Seite nach unten auf der Extraktionslösung.
   4. Nach 10 sec, abholen Deckglas mit der Zange und sofort übertragen, Zell-Seite nach oben, der gut mit der 4% Paraformaldehyd Fixierung Puffer.
   5. Lassen Sie die Probe inkubieren in Fixativ für mindestens 15 min bei Raumtemperatur.
3. Vorbereitung der extrahierten Control Cells. Um die gesamte Menge an mRNA im Zytoplasma ist es eine gute Idee, einen extrahierten Kontrollprobe vorzubereiten bestimmen.
   1. Zellen auf Deckgläsern gewachsen sind wie oben hergestellt (siehe Abschnitt 2.2), außer dass der Digitonin Extraktionsschritt (2.2.3) übersprungen wird.
   2. Nach der Fixierung müssen die un-extrahierten Zellen in PBS permeabilisiert werden + 0,1% TritonX-100 15 min bei Raumtemperatur.

3. FISH Färbung

1. Entwerfen Sonden zur Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung
   1. Der primäre Sequenz der mRNA von interessierten gefaltet wird mittels RNA Sekundärstruktur Vorhersage-Software, wie RNAstructure 5,0 ^18. Die mRNA-Falten sind visuell beurteilt, um einen Bereich von etwa 50 Nukleotiden, die frei von größeren Sekundärstrukturen ist identifizieren.
   2. Der umgekehrte Komplement dieser Region mit einer Alexa546 Fluorophor gebunden an das 5'-Ende der Sonde (erworben von Integrated DNA Technologies) synthetisiert.
   3. Die Sonde wird mit RNase-freiem Wasser auf ein Lager Konzentration von 100 uM, die bei -20 ° C gelagert werden kann verdünnt
2. Färbung mit FISH-Sonden
   1. Beachten Sie, dass, obwohl die Digitonin-extrahierten Zellen nicht bedürfen weiterer Permeabilisierung Behandlung dieser festen Proben mit 2 ml 0,1% Triton X-100 in verdünntPBS für 15 min bei Raumtemperatur vor dem FISH-Färbung, hilft, das Hintergrundsignal zu reduzieren.
   2. Die Objektträger werden dann zweimal mit PBS gewaschen, um restliche Paraformaldehyd oder Triton X-100 zu entfernen.
   3. Die Zellen werden dann zweimal mit 25% bis 60% Formamid in 1X Natriumzitrat-Puffer (150 mM NaCl und 15 mM Natriumcitrat) gewaschen. Im Allgemeinen sind für spezifische FISH-Sonden, die 50-60 Nukleotide lang sind, 60% Formamid verwendet, sondern auch für Poly (A) mRNA Färbung mit Oligo (dT) FISH-Sonde, die Höhe der Formamid wird auf 25% reduziert.
   4. Um die Färbung Kammer herzustellen, wird der Boden einer 150 mm Petrischale mit Wasser bedeckt und ein Stück Parafilm auf dem Wasser schwamm. Das Wasser wird durch Drehen der Teller über entfernt, wodurch es dem Parafilm um zum Boden der Schale haftet. Luftblasen werden manuell mit Kimwipes entfernt.
   5. Für jedes Deckglas auf angefärbt werden, pipettieren 100 ul Tropfen der Hybridisierungslösung, die FISH-Sonde von Interesse auf die parAFILM in der Färbung Kammer. Das Lager FISH-Sonde wird mit 25% bis 60% Formamid in einem Hybridisierungspuffer (1x SSC, 100 mg / ml Dextransulfat, 1 mg / ml Hefe-tRNA, 5mM Vanadyl Ribosid Komplex, 25-60% Formamid) auf eine Arbeitskonzentration von verdünnt 0,2 uM. Man beachte, dass die Menge des für das jeweilige Formamid Sonde verwendet sollte optimiert werden und ist in der gleichen Konzentration wie in dem SSC-Waschpuffer (siehe Schritt 3.3.3) vorliegt.
   6. Das Deckglas ist Zellenseite verdeckt auf die Lösung in der FISH-Färbung Kammer und inkubiert für 5-24 Stunden bei 37 ° C in einer befeuchteten Kammer wie die Gewebekultur-Inkubator.
3. Wasch-und Montage der gefärbten Proben
   1. Um eine RNase-frei Waschplatz vorzubereiten, legte sich ein Streifen Parafilm auf einer Ebene ebenen Fläche, wie einem Labortisch. Um sicherzustellen, dass die Parafilm flach, nass die ebene Fläche ist, legen die Parafilm oben und entfernen Sie manuell alle Luftblasen mit Kimwipes.
   2. Die Färbung Kammerentfernt aus dem Inkubator und auf einer ebenen Fläche. Die Deckgläser werden dann durch Pipettieren etwa 500 ul FISH Waschpuffer nahe der Kante jedes Deckglas flotiert. Die Lösung wird in-zwischen dem Deckglas und dem Parafilm durch Kapillarwirkung gezogen werden.
   3. Für jedes Deckglas wird 1 ml Waschpuffer (1x SCC mit 25-60% Formamid, siehe Schritt 3.3.3) auf den Waschplatz Parafilm (siehe Schritt 3.4.1) pipettiert.
   4. Verwendung einer Pinzette werden die Deckgläser aus der Kammer entfernt und Anfärben jedes auf den Tropfen Waschpuffer gegeben und inkubiert bei Raumtemperatur für 5 min. Der Waschvorgang wird 3 mal wiederholt.
   5. Glasträger mit 70% Ethanol gewaschen und getrocknet, mit Kimwipes.
   6. Für jedes Deckglas wird 25 ul der Montage-Lösung (DAPI Fluoromount G, Southern Biotech) auf den Objektträger pipettiert. Beachten Sie, dass diese Lösung 4 ',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), die DNA-Flecken enthält und ermöglicht die Visualisierung von Kernen.
   7. Using Pinzette und Kimwipes wird die Rückseite des Deckglases getrocknet und überschüssiges FISH Waschpuffer wird abgetupft, ohne Trocknen der Probe. Jedes Deckglas wird dann Zelle nach unten gelegt, auf den Rückgang der Montage Lösung.
   8. Proben werden dann montiert gekennzeichneten und Speicher sein bei 4 ° C.

4. Imaging und Quantifizierung

1. Imaging
   1. Ein Epifluoreszenzmikroskop wird verwendet, um Bild die Zellen nach FISH-Färbung. Die transfizierte Zelle kann aus transfizierten Zellen durch helle Fluoreszenz-Signal in den entsprechenden Kanal unterschieden werden. Idealerweise wird jede erworbenen Feld enthalten auch einen untransfizierten Zelle verwendet, um die Hintergrund-Fluoreszenz für die Quantifizierung zu bestimmen.
   2. Für jedes Feld Bilder der FISH und DAPI-Kanal erworben werden. Darüber hinaus, wenn die Zellen mit Proteinmarker gemeinsam gefärbt wird ein Bild des Immunfluoreszenz Kanal auch erworben. Beachten Sie, dass Digitonin Extraktion kann auch verwendet werdenER-gebundenen Ribosomen und Proteine ^​​11 visualisieren.
   3. Um sicherzustellen, dass die Fluoreszenz-Intensitäten zwischen Halbbildern verglichen werden kann, sollte die Belichtungszeit für jeden Kanal bleibt für jeden Satz von Experiment konstant.
   4. Erneut, um sicherzustellen, dass die Fluoreszenz-Intensitäten zwischen den Zellen auf verschiedenen Deckgläser verglichen werden können, sollten die Tag-zu-Tag Veränderungen in epiluminescence Intensität oder Verfall in der FISH-Signal durch bildgebende alle der Deckgläser in einer einzigen Sitzung minimiert werden.
2. Quantifizierung. Um die Menge an mRNA, die an der ER lokalisiert ist quantifizieren, verwenden wir Nikon NIS Element Software. Aber auch andere Bildanalyse-Software wie ImageJ verwendet werden.
   1. Mit der Nikon NIS ELEMENT Bild-Analyse-Tool, sind die Zelle Peripherie und der Kern als separate Region of Interest (ROI) skizziert.
   2. Für jeden ROI, der Fluoreszenzintensität (I _T für die gesamte Zelle Intensität und I _N für dienuklearen Intensität) und die Fläche (A _T und A _N) werden aufgezeichnet und exportiert in eine Excel-Tabelle.
   3. Für jedes Bild wird der Hintergrund fluoreszierende Intensität (I _B) durch die Erfassung der Intensität einer nicht-transfizierten Zelle bestimmt. Wenn Poly (A) mRNA analysiert wird, wird ein zellfreier angewählt.
   4. Die Gesamtmenge des ER (in extrahierten Zellen) oder cytoplasmatische (in nicht extrahierten Zellen) Fluoreszenz wird durch die Formel berechnet wird:
      [A _T] [I _T - I _B] - [A _N] [I _N - I _B]
   5. Die Kernfärbung Intensität kann ebenfalls berechnet werden und als interne Kontrolle zwischen verschiedenen Behandlungen. Da Kerne nicht durch Digitonin Behandlung ¹⁷ oder Ribosomen Unterbrechungen ¹¹ betroffen sind, sollte die Menge des nuklearen mRNA konstant zwischen diesen Behandlungen. Um Kernfluoreszenz die folgende Formel verwendet wird berechnet:
      [A _N] [I _N - IB]
   6. Der prozentuale Anteil der zytoplasmatischen mRNA, die den ER-bezogenen ist, kann durch Ermitteln des Durchschnitts ER Fluoreszenz von 30-40 extrahierten Zellen (siehe 4.2.4) von der durchschnittlichen zytoplasmatischen Fluoreszenz 30-40 extrahierten Zellen (siehe wieder 4.2.4) dividiert werden . Es ist wichtig, dass die extrahierten und nicht extrahierten Zellen hergestellt werden, gefärbt und abgebildet sind.

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Ergebnisse

Um den Prozentsatz der mRNA, die den ER-assoziierten ist, COS-7-Zellen, die mit Plasmiden, die die plazentale alkalische Phosphatase (ALPP) oder Cytochrom P450-8B1 (CYP8B1) wurden entweder mit Digitonin extrahiert und dann fixiert oder direkt befestigt enthaltenen transfiziert wurden bestimmen (siehe Abbildung 1, siehe "unextrahierten Ctrl" auf "Extrahierte Ctrl"). Die nichtnuklearen Fluoreszenz wurde in beiden Proben und die Fraktion von ER-assoziierten mRNA wurde ...

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Diskussion

Die Lokalisierung von mRNAs zu verschiedenen subzellulären Seiten, durch das Zusammenspiel von Transkripte mit mRNA Lokalisation Proteinen ist ein weit verbreitetes Phänomen wichtig für die richtige Sortierung von Proteinen an ihren endgültigen Bestimmungsort und für die Feinabstimmung der Genexpression zu den lokalen Anforderungen an eine subzelluläre Region ^19,20.

Verwendung der hier beschriebenen Assays können wir die Frage, ob mRNAs, die sekretorische Proteine ​​kod...

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