Die MultiBac Protein Complex Produktion Platform am EMBL

Zusammenfassung

Protein-Komplexe katalysieren wichtige zelluläre Funktionen. Detaillierte funktionelle und strukturelle Charakterisierung von vielen wesentlichen Komplexe erfordert rekombinante Herstellung. MultiBac ein Baculovirus / Insektenzellen-System insbesondere zur Expression von eukaryontischen Proteinen und ihren Komplexen zugeschnitten. MultiBac wurde als Open-Access-Plattform, und Standard Operating Procedures entwickelt, um seinen Nutzen zu maximieren implementiert.

Zusammenfassung

Proteomics Forschung enthüllt die beeindruckende Komplexität von eukaryotischen Proteom in bisher unerreichter Genauigkeit. Es ist nun eine allgemein akzeptierte Vorstellung, dass Proteine ​​in Zellen existieren meist nicht als isolierte Einheiten, sondern üben ihre biologische Aktivität in Verbindung mit vielen anderen Proteinen beim Menschen zehn oder mehr bilden Montagelinien in der Zelle für die meisten, wenn nicht alle lebenswichtigen Funktionen. ^{1 , 2} Kenntnisse über die Funktion und die Architektur dieser Multiprotein Baugruppen erfordert ihre Bestimmung in höchster Qualität und ausreichender Menge für eine detaillierte Analyse. Der Mangel vieler Proteinkomplexe in Zellen, insbesondere in Eukaryonten, verbietet ihre Extraktion aus nativen Quellen und erfordert rekombinante Herstellung. Die Baculovirusexpressionsvektor System (BEVS) hat sich als besonders nützlich für die Herstellung von eukaryotischen Proteinen, deren Aktivität oft auf posttranslationale Prozessierung, dass andere häufig verwendete Ausdruck Systeme oft kannnicht unterstützt. ³ BEVS mit einem rekombinanten Baculovirus, in die das Gen von Interesse eingeführt wird, um Insekten Zellkulturen, die wiederum das Protein der Wahl infizieren wurde. MultiBac eine BEVS, die besonders wurde für die Herstellung von eukaryontischen Protein-Komplexe, die viele Untereinheiten enthalten zugeschnitten. ⁴ Eine wesentliche Voraussetzung für die Herstellung von Proteinen und deren Komplexe sind stabil Protokolle für alle Schritte in einem Ausdruck Experiment, das sich hervorragend als implementiert werden beteiligt Standard Operating Procedures (SOPs) und auch von Nicht-Spezialisten Nutzer vergleichsweise einfach gefolgt. Die MultiBac Plattform am European Molecular Biology Laboratory (EMBL) verwendet SOPs für alle Schritte in einer Multiproteinkomplex Ausdruck Experiment beteiligt, ab Einsetzen der Gene in einer konstruierten baculovirale Genom für die heterologe Proteinproduktion Immobilien zum kleinen Analyse des Proteins optimiert Exemplare produziert. ^5-8 Die Plattformwird in einer Open-Access-Modus bei EMBL Grenoble installiert und unterstützt viele Wissenschaftler aus Hochschule und Industrie, um Protein-Komplex Forschungsprojekte beschleunigen.

Einleitung

Biologische Aktivität von Anordnungen von Proteinen und anderen Biomolekülen, die gemeinsam wirken, um zelluläre Funktionen katalysieren gesteuert. Bemerkenswerte Beispiele sind die Maschinen, die die Erbinformation in der DNA in Boten-RNA enthalten transkribiert. Beim Menschen kommen mehr als 100 Proteine ​​zusammen in einer definierten und geregelt Verfahren, um Gene zu transkribieren, wobei große Multiproteinkomplexen mit 10 und mehr Untereinheiten, einschließlich RNA-Polymerase II und der allgemeinen Transkriptionsfaktoren wie TFIID, TFIIH und andere. ⁹ Andere Beispiele sind die Ribosomen, die aus vielen Proteinen und RNA-Molekülen, die Proteinsynthese, oder die Kernporenkomplex die für pendelt Biomolekülen durch die Kernhülle in Eukaryoten katalysiert. Eine detaillierte Architektur und biochemische Präparation von im wesentlichen Mehrkomponenten-Maschinen in der Zelle ist wichtig, um ihre Funktion zu verstehen. Die Strukturaufklärung von prokaryotischen und eukaryotic Ribosomen, zum Beispiel, bildeten Markenzeichen Ereignisse eine beispiellose Einblicke in die Funktionsweise dieser makromolekularen Maschinen führen ihre vorgesehenen Funktionen in der Zelle. ^10,11

Ribosomen in ausreichender Quantität und Qualität für detaillierte Studie durch Reinigen des endogenen Material aus kultivierten Zellen, aufgrund der Tatsache, dass bis zu 30% der Zellmasse von Ribosomen besteht, erhalten werden. RNA-Polymerase II ist bereits weniger reichlich um Größenordnungen, und viele tausend Liter Hefekultur mussten verarbeitet werden, um eine detaillierte atomare Angesichts dieser wesentlichen komplexe zentrale, um die Transkription zu erhalten. ^12. Die überwiegende Mehrheit der anderen wesentlichen Komplexe sind jedoch in viel niedrigere Mengen in nativen Zellen und somit nicht ausreichend aus nativen Ausgangsmaterial gereinigt werden. Um solche Komplexe zugänglich detaillierte strukturelle und funktionelle Analyse machen erfordert heterologe Produktion durch Verwendung von rekombinanten techniques.

Produktion rekombinanter Proteine ​​hatte einen großen Einfluss auf die Life-Science-Forschung. Viele Proteine ​​wurden rekombinant hergestellt und deren Struktur und Funktion bei hoher Auflösung seziert. Strukturelle Genomik-Programme haben den Vorteil der Aufklärung der Genome vieler Organismen, um das Genprodukt Repertoire von ganzen Organismen in High-Throughput (HT)-Modus anzugehen. Tausende von Protein-Strukturen sind damit bestimmt. Bis heute hat die produktiv genutzten System für Produktion rekombinanter Proteine ​​wurden E. coli, und viele Expressionssysteme entwickelt worden und im Laufe der Jahre verfeinert für die heterologe Produktion in diesem Wirt. Die Plasmide eine Fülle von Funktionalitäten zur Protein-Produktion in E. aktivieren coli füllen ganze Kataloge von kommerziellen Anbietern.

Allerdings E. coli sind bestimmte Grenzen gesetzt, die es ungeeignet für viele eukaryotische Proteine ​​machen und in pGelenk-Protein-Komplexe mit vielen Untereinheiten. Daher wurde die Proteinproduktion in eukaryotischen Wirten immer die Methode der Wahl in den letzten Jahren geworden. Ein besonders geeignetes System eukaryontische Proteine ​​ist das Baculovirus-(BEVS), die auf einem rekombinanten Baculovirus Durchführung der heterologen Gene für Insekten Zellkulturen im Labor gezüchtet infizieren beruht. Die MultiBac System ist ein in jüngerer Zeit entwickelt BEVS die besonders für die Herstellung von eukaryotischen Protein-Komplexen mit vielen Untereinheiten (Abbildung 1) zugeschnitten ist. MultiBac erste wurde im Jahr 2004 eingeführt. ¹³ Seit seiner Einführung hat MultiBac kontinuierlich verfeinert und gestrafft, um die Handhabung zu vereinfachen, verbessern Zielprotein Qualität und in der Regel machen das System für Nicht-Fachanwender durch die Gestaltung effizienter Standard Operating Procedures (SOPs). ⁴ MultiBac hat in vielen Laboratorien weltweit umgesetzt, in acAdemia und Industrie. Am EMBL in Grenoble, wurden grenzüberschreitenden Zugang Programme anstelle von der Europäischen Kommission bis zum Experten Ausbildung an der MultiBac Plattform für Wissenschaftler, die dieses Produktionssystem für die Förderung ihrer Forschung nutzen wollten setzen. Der Aufbau und die Funktion von vielen Protein-Komplexe, die bisher nicht zugänglich waren, indem Proben mit MultiBac produziert wurde aufgeklärt. ⁴ Im Folgenden werden die wesentlichen Schritte der Produktion MultiBac in Protokollen zusammengefasst, wie sie im Betrieb auf der Anlage am MultiBac EMBL Grenoble sind.

Protokoll

1. Tandem Recombineering (TR) für das Erstellen Multigen Expression Konstrukte

1. Planung der Co-Expression Strategie. Design-Ansatz für die Aufnahme Ihrer Gene von Interesse in Donatoren und Akzeptoren. Mögliche physiologische Submodule Ihrer komplexen sollten zusammen auf spezifische Akzeptoren und Donatoren gruppiert werden. Verwenden Multiplikation Modul bestehend aus Homing Endonuklease (HE) - BstXI Paare Expressionskassetten auf einzelne Donor und Akzeptor Plasmide kombinieren ^7,8 Erstellen Sie alle relevanten Konstrukte in silico und Validierung Strategie gründlich, bevor Sie mit experimentellen Arbeiten.. Zum Beispiel sollte die Gene von Interesse ausgewählt nicht zu enthalten HE oder andere Restriktionsstellen und die Anwesenheit der korrekten offenen Leserahmen (ORFs) validiert werden soll. Überlegen Sie daher synthetische Gene für Insekt Zelle Codonverwendung und mRNA sekundäre Struktur optimiert, um Protein-Produktion Ebenen sowie Beseitigung jeglicher exi verbessernstechen HE Websites aus den Genen von Interesse. Erwägen Sie, Reinigungs-Tags basierend auf Daten aus der Literatur über flexible oder ausgesetzt N-oder C-Termini von Proteinen Ihrer Wahl. Betrachten Sie die Anwendung polyprotein Strategien, die auf die Herstellung mehrere Protein-Untereinheiten in Ihrer komplexen zielen, wenn die relativen Mengen der einzelnen Proteine ​​aufgrund Stöchiometrie Fragen im Komplex kontrolliert werden müssen. ⁴ Ausarbeitung detaillierter "How-To"-Dokument (electronic book Labor wird empfohlen) mit Alle projiziert experimentellen Schritte des Projekts im Vorfeld der vollständigen multigene Konstrukt (n). Erstellen Sie elektronische Dateien der Cre-LoxP fusionierten Plasmide zum Beispiel mit Hilfe des Cre-ACEMBLER Software, die von der Berger Gruppe Homepage (heruntergeladen werden kann www.embl.fr/multibac/ multiexpression_technologies / cre-acembler ).
2. Legen Sie Ihre Gene von Interesse in ausgewählte Spender undAkzeptoren durch Verwendung von Restriktionsenzymen und Ligase, oder alternativ durch Ligation unabhängigen Methoden nach veröffentlichten Protokollen. ^5,6,14 Wenn Sie Zugang zu einem Liquid-Handling-Arbeitsplatz und wenn Sie planen, eine große Anzahl von Konstrukten erzeugt werden ( zum Beispiel für die kombinatorische Ansätze) erwägen Robotik Script entwickelt und von der Berger-Gruppe (Abbildung 2). ^14,15 implementiert Wenn ein Liquid-Handling-Arbeitsplatz nicht zur Verfügung steht, ermöglicht die manuelle Bedienung über Mikrotiterplatten Geninsertion in einem HT wie Mode.
3. Einschränkungen durch die Notwendigkeit, die Stöchiometrie der Untereinheiten steuern ausgedrückt auferlegt materialisieren. Im Falle der stöchiometrisch unausgewogenen Expression von einzelnen Untereinheiten eines Proteinkomplexes, in Erwägung ziehen, Polyprotein Strategien auf mehrere Untereinheiten des Komplexes und eine spezifische Protease (z. B. Tabakätzvirus NIa Protease) in einzelnen großen ORFs von s beabstandet conjoinpecific proteolytische Websites. ^4,8 Betrachten Zusammenarbeit, die ein oder mehrere Polyproteine ​​mit einzelnen Expressionskassetten wenn Sie eine sehr große Anlage mit vielen Untereinheiten und haben weit reichen Molekulargewichte der einzelnen Untereinheiten. Betrachten Koexpression mehrerer Gene, die für das gleiche Protein in ein Polyprotein oder mehrere gleiche Expressionskassetten wenn das Protein durch eine niedrige Produktion Ausbeute auszeichnet. ^4,13
4. Bestätigen Sie alle Donor und Akzeptor Konstrukte durch Restriktionskartierung (wahlweise in High-Throughput) und Sequenzierung geklont. Fahren Sie mit Donor-Acceptor-Kombinationen durch Cre-Rekombination LoxP verschmelzen, um die multigene Ausdruck Konstrukte der Wahl zu erzeugen. Bestätigen gereinigt Acceptor-Donor Fusion Plasmide durch Restriktionskartierung, verwenden elektronische Sequenzen durch Cre-ACEMBLER oder ähnlichen Programmen als Referenz erstellt.
5. Bewahren gereinigt und validiert Spender, Akzeptoren und Donor-Acceptor Fusionen bei -20 ° C oder -80 ° C. Archiv plasmids und ihre Sequenzen (Microsoft Excel, Filemaker, etc.) sorgfältig zur späteren Verwendung.

2. Composite-Multigen Baculovirus Erzeugung, Verstärkung und Lagerung

1. Integrieren multigene Transfervektoren die MultiBac baculovirale Genom durch Umwandlung in DH10-Zellen, die das virale Genom und die Funktionalitäten für Tn7 Umsetzung erforderlich. Beachten Sie, dass die MultiBac Baculovirus-Genom mit bestimmten Genen von Interesse (YFP Marker, Chaperone, etc.) in einem eigenen loxP-Stelle (entwickelt in das Genom distal zum Tn7 Bindungsstelle) durch eine in vivo Cre Reaktion vorhergehenden Tn7 Integration vorgespannt werden. ¹³ Nach Tn7 Umsetzung werden die Zellen mit Composite Baculovirus enthält die Gene von Interesse durch blau / weiß-Screening (erfolgreiche Tn7 Umsetzung führt zu einem Verlust von α-Komplementierung der β-Galactosidase, daher bleiben Kolonien mit richtigen Tn7 Umsetzung auf selektiven einem weißengar Platten mit X-gal) und das Genom wird durch alkalische Lyse und Ethanol / Isopropanol-Fällung hergestellt. ^5,6
2. Transfektion und erste Virus-Produktion. Platz 6-Well-Gewebekulturplatten in sterile Haube. Von log-Phase Sf21 Insekt Zellkultur, Samen aus Aliquots von Zellen in den Vertiefungen und Transfektion durch Zugabe des gereinigten baculovirale Genom und eine Transfektionsreagenz in Kulturmedien gemischt, wie beschrieben. ⁶ Ernte anfänglichen Virus nach 48-60 Stunden durch Entfernen der Medien ( hohe Qualität, niedrige Titer Virus V _0, in der Regel 3 ml pro Vertiefung). Beilage frisches Medium und Test für die Proteinproduktion (und, falls ein YFP Marker vorhanden ist, für die Fluoreszenz) nach weiteren 2-3 Tagen. ^6,7
3. Amplifikation von Virus, niedrige MOI Regime. Verwenden V ₀ Virus auf 25-50 ml der Zellen in der log-Phase (Zelldichte <1x10 ⁶ Zellen pro ml) in kleinen (100-250 ml) Erlenmeyer Schüttelkolben aufgeregt infizierenauf orbitale Plattform Schüttler (Abbildung 3). Zählen von Zellen aufgeteilt und alle 24 Stunden, bis die Zellen aufhören Verdoppelung (Proliferation Verhaftung). Folgen einer niedrigen MOI (Multiplizität der Infektion dh Anzahl von Viruspartikeln pro Zelle) Therapie: Die Zellen müssen verdoppeln (mindestens) einmal (MOI <1), ansonsten Wiederholen Experiment mit einem kleineren Volumen V ₀ zugegeben. Üblicherweise werden 3 ml V ₀ verwendet, um 25 ml der Sf21 Insektenzellen mit einer Dichte von 0.5x10 ⁶ Zellen / ml infiziert. Dies ist wichtig, um zu verhindern, nachteilig Überverstärkung und automatische Löschen von Viren, die zu einem Verlust der heterologen Genen von Interesse führen. Ernte-V _1-Virus (25-50 ml) nach 48-60 Stunden durch Pelletierung Zellen und Entfernen der Medien, die das Virus. Ergänzung mit frischen Medien und Test für YFP und Proteinproduktion durch Entfernen 1x10 ⁶ Zellen alle 12 oder 24 Stunden, Pelletierung und Validierung von Protein-Produktion und Marker-Protein (YFP)-Signal. ^6, Amplify Virus (zuV ₂₎ weiter, wenn größere Mengen an Expression durch Infektion bis zu 400 ml Zellen in 2 L Schüttelkolben mit V _1-Virus unter Beachtung der oben genannten niedrigen MOI Regime (Zellen muss mindestens einmal verdoppeln nach Infektion mit V ₁₎ ab. Stringent testen Proteinproduktion und Markerprotein Signal während der Amplifikation zu einer Akkumulation von defekten Viren nicht mehr mit den Genen von Interesse zu vermeiden. ^5-7 Use Zellpellets akkumulieren bei jedem Schritt bereits Verstärkungen für die Festlegung Aufreinigungsprotokolle für den Ausdruck Protein-Komplex von Interesse.
4. BIIC Lagerung von Produktion Virus. Wir empfehlen dringend, V _2-Virus, wie die Produktion Virus zu speichern, indem Sie die BIIC (B aculovirus-i nfected i nsect c Ellen)-Methode, um Änderungen (z. B. Verlust des Gens von Interesse) des rekombinanten Virus zu verhindern und hohe Expression bewahren Ebenes ¹⁶ Pellet infizierten Zellen 24 Stunden nach der Festnahme Proliferation beobachtet wird -. in diesem Stadium Zellen enthalten komplette Viruspartikel kurz bevor sie freigegeben (durch Knospung) in den Medien werden. Entfernen Medien und gefriergetrocknet Aliquots des Zellpellets in flüssigem Stickstoff und speichern unbegrenzt. ^7,16

3. Protein Produktion und Downstream Processing

1. Infizieren große (r) Kulturen und Überwachung YFP. Verwenden V _1, V ₂ oder gefroren BIIC Aliquots zu größeren Zellkulturen für die Produktion läuft (in der Regel 400 ml in 2 L Flaschen) zu infizieren. Halten Sie sich an niedrigen MOI Regime (Virus anpassen Volumen für die Infektion verwendet werden, so dass infizierte Kultur verdoppelt mindestens einmal). Vergrößern infizierten Kultur Bände, wenn durch die Anzahl der Flaschen benötigt. Wenn YFP Markerprotein vorhanden ist, in definierten Abständen 1x10 ⁶ Zellen zurückziehen, Pellet-und lysieren Zellen und überwachen Entwicklung des YFP-Signal, bis ein Plateau erreicht ist indicating maximale Produktion rekombinanter Proteine. YFP Ebenen können in einem Standard-96-Well-Platte Leser fähig zur Aufnahme Fluoreszenz-Signale (zB Tecan SPECTRAFluor) gemessen werden. Ernten Sie die Zellen in diesem Stadium. Shop Zellpellets bei -20 ° C (kurzfristig) oder -80 ° C (langfristig).
2. Zelllyse und Fraktionierung. Lyse Zellen von Ihrem Lieblings-Methode der Wahl, zugeschnitten auf die Anforderungen Ihrer Protein (Frost-Tau-, Beschallung, Französisch Presse, ua). ^5-7 Fraktionierung Cytosol und Zellkerne und Test für die Präsenz Ihrer Proteine ​​von Interesse. Entwickeln Aufreinigungsprotokolle basierend auf den Ergebnissen zur Proteinreinigung zu vereinfachen. Betrachten Sie die Anwendung Einweichen Verfahren, um Ihre Protein aus dem Kernfraktion extrahieren unter hohem KCl Bedingungen, wenn Ihr Proteine ​​im Zellkern befinden. ^7,18
3. Proteinreinigung (Mikro-Skala, in großem Maßstab). Beachten Sie, dass oft kleine Mengen (10 oder 25 ml) von Zellkultur-su sindizient für den Erhalt von Zell-Pellets zur Reinigung erhebliche Mengen an Ihre Proteine ​​von Interesse aufgrund der typischerweise hohen oder sehr hohen Produktionsniveau von heterologen Proteinen in den Baculovirus / Insektenzellen-Systeme (oft 10-100 mg Protein pro L Kultur und mehr). In Verbindung mit Mikro-Reinigung (Multiwellplatten, microtip Methoden, GE Healthcare ÄKTAmicro System, etc.) ist es möglich, biochemischen und Aktivität Daten und oft auch ausreichende Menge der gewünschten Proteine ​​und Komplexe für nanoliter Maßstab Hochdurchsatz-Kristallisation (HTX erhalten ). Betrachten unter Verwendung von Metall Affinitätsreinigung (Clonetech Takara Talon Qiagen NiNTA Metallchelator Harze) und einen Oligo-Histidin (6-10 Reste) tag auf freiliegenden Untereinheiten des Proteinkomplexes, um die Reinigung zu erleichtern, in Verbindung mit Ionenaustausch-und Größenausschluss-Chromatographie in kleinen Volumes mit zum Beispiel den ÄKTAmicro oder ein ähnliches kleines Volumen Reinigung Maschine (Abbildung 4 ). Andere Affinität Reinigungsschritte und Ionenaustausch (IEX) Schritte neben der Affinitätsreinigung mit Oligo-Histidin-Tags oder anderen Tags (von GST, MBP, CBP, andere wählen) können und sollten in Betracht gezogen werden, je nach den biochemischen Eigenschaften der Proteine von Interesse und individuellen Vorlieben. Betrachten Tagging mehr als eine Untereinheit mit Affinität Tags zu Reinigungsleistung zu verbessern. Konzentrieren Sie Ihre gereinigtes Protein-Komplexe und etablieren Storage-Protokolle wie das Einfrieren mit oder ohne Glycerin. Entwickeln Qualitätskontrolle Kriterien, die üblicherweise angewendet werden können (Aktivitäts-Assays, biochemischen und biophysikalischen Tests) zu Charge zu Charge Variation des gereinigten Proteinen zu beurteilen.

Ergebnisse

Starke Co-Expression von heterologen Proteinen durch die MultiBac System erreicht wird in 1d (Sonden gemacht 48 h nach Infektion eines Suspensionszellkultur) gezeigt. Die überexprimiert Proteinbanden eindeutig im Ganzzellextrakt (SNP) und dem geklärten Lysat (SN) erkennbar. Die Qualität und Quantität des Proteins hergestellt ist oft ausreichend, um Strukturaufklärung von Protein-Komplexen, wie der mitotischen Checkpoint komplexen MCC in 1e gezeigt aktivieren. ¹⁷

Diskussion

Video Snap-shots in den Abbildungen 2 und 3 zeigen den gesamten Prozess von Roboter-assistierte Generation von cDNA multigene Ausdruck baut den ganzen Weg nach Infektion von Insekten Zellkulturen für die Proteinproduktion. New Reagenzien (Plasmide und Viren) und robuste Protokolle wurden entwickelt, um eine Pipeline sich auf SOP ermöglichen. Die gesamte Pipeline wurde als Plattform-Technologie am EMBL in Grenoble umgesetzt. Die MultiBac Plattform wurde von vielen Wissenschaftlern aus ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bluo-Gal	Invitrogen	15519-028 (1 g)
Tetracycline	Euromedex	UT2965-B (25 g)	1,000X at 10 mg/ml
Kanamycine	Euromedex	EU0420 (25 g)	1,000X at 50 mg/ml
Gentamycine	SIGMA	G3632 (5 g)	1,000X at 10 mg/ml
IPTG	Euromedex	EU0008-B (5 g)	1,000X at 1M
Cre-recombinase	New England BioLabs	M0298
X-Treme GENE HP transfection reagent	Roche	06 366 236 001
Hyclone SFM4 Insect	Thermo Scientific	SH 30913.02
6-well plate Falcon	Dominique Dutscher	353046
2 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357507
5 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357543
10 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357551
25 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357535
50 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357550
50 ml tube Falcon	Dominique Dutscher	352070
15 ml tube Falcon	Dominique Dutscher	352096
1.8 ml cryotube Nunc	Dominique Dutscher	55005
100 ml shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211917
250 ml shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211918
500 ml shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211919
2 L shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211921
Certomat Orbital Shaker + plateau	Sartorius	4445110, 4445233
Liquid nitrogen tank dewar 35 L	Fisher Scientific	M76801
Biological Safety Cabinet Faster	Sodipro	FASV20000606
Optical Microscope	Zeiss	451207
Sf21 Insect cells
Hi5 Insect cells	Invitrogen	B855-02
Tecan freedom EVO running Evoware plus	TECAN
10 μl conductive tips (black),	TECAN	10 612 516
200 μl conductive tips (black)	TECAN	10 612 510
disposable trough for reagents, 100 ml	TECAN	10 613 049
twin.tec PCR plate 96, skirted	Eppendorf	0030 128.648
96 well V bottom, non sterile	BD falcon	353263
96 deepwell plate color natural, PP)	Fisher	M3752M
PS microplate, 96 well flat bottom	Greiner	655101
96 deepwell plate	Thermo scientific	AB-0932
24 well blocks RB	Qiagen	19583
DpnI restriction enzyme	NEB	R0176L	20 U/uL
NEBuffer 4 10X	NEB	B7004S
2X phusion mastermix HF	Finnzyme	ref F-531L
2X phusion mastermix GC	Finnzyme	ref F-532L
DGLB 1.5X	homemade		7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF
High DNA Mass Ladder for e-gel	Life Technologies	10496-016
Low DNA Mass Ladder for e-gel	Life Technologies	10068-013
E-gel 48 1% agarose GP	Life Technologies	G8008-01
Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit	Macherey Nagel	740 708.24
PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract	Macherey Nagel	740 707.2
Gotaq green master mix	Promega	M7113
T4 DNA polymerase, LIC-qualified	Novagen	70099-3
DTT 100 mM	homemade
Urea 2 M	homemade
EDTA 500 mM pH 8.0	Homemade
LB broth (Miller) 500 g	Athena ES	103