Neonatal Subventrikulärzone Elektroporation

Zusammenfassung

Wir zeigen eine minimal-invasive Technik genannt Neugeborenen Subventrikulärzone Elektroporation. Die Technik besteht aus Einspritzen Plasmid-DNA in den lateralen Ventrikel neonataler Welpen und Anlegen von elektrischem Strom zu liefern und genetisch zu manipulieren Nervenstammzellen

Zusammenfassung

Neurale Stammzellen (NSCs) säumen die postnatale Seitenventrikel und führen zu mehreren Zelltypen, die Neuronen, Astrozyten und Ependymzellen ¹ enthalten. Das Verständnis der molekularen Mechanismen, die für NSC Selbsterneuerung, Engagement und Differenzierung ist entscheidend für die Nutzung der ihr einzigartiges Potenzial, um das Gehirn zu reparieren und besser zu verstehen Erkrankungen des zentralen Nervensystems. Bisherige Verfahren zur Manipulation von Säugersystemen erforderte die zeitaufwendig und teuer Bestreben der Gentechnologie am Ganztier Ebene ^2. Somit haben die meisten Studien die Funktionen des NSC-Molekülen in vitro oder in wirbellosen erforscht.

Hier zeigen wir die einfache und schnelle Methode, um Neugeborenen NPCs, die als Neugeborene subventrikulären Zone (SVZ) Elektroporation bezeichnet manipulieren. Ähnliche Techniken wurden vor einem Jahrzehnt zu embryonalen NSCs zu studieren entwickelt und unterstützt Studien über cortical Entwicklung ^3,4. In jüngerer Zeit wurde dies angewendet zu studieren die postnatale Nager Vorderhirn ^5-7. Diese Technik führt zu robusten Kennzeichnung von SVZ NSCs und deren Nachkommen. So bietet postnatalen SVZ Elektroporation eine Kosten-und Zeitaufwand effektive Alternative für Säugetierzellen NSC Gentechnik.

Protokoll

Diese Vorgehensweise ist im Einklang mit Yale IACUC Anforderungen. Wissenschaftler sollten sicherstellen, dass IACUC Richtlinien zugelassen sind und nach ihrer institutionellen Voraussetzungen gefolgt.

Ein. Abschnitt 1. Herstellung von DNA, Lösungen und Glaspipetten

1. Generieren hoher Reinheit (OD 260/280> 1,80) hoher Konzentration (ug / ul> 2,5) Endotoxin-freien DNA.
2. Planen 0,9% iger Kochsalzlösung und steril filtriert durch ein 22 pm-Filter.
3. Platz 10 cm feuerpolierte Borosilikatglas Kapillarrohre (OD: 1,5 mm, ID: 1,10 mm) in ein Modell PP-830 Narishige PC-10 Glaspipette Abzieher mit einem Kanthal Draht. Set Abzieher einem Schritt gewichteten Pull bei 70,5 ° C. Brechen Sie Tipps mit kreisförmigen Pinzette und überprüfen unter einem Binokular für gezackte Ränder. Bevel Tipps und unter einer UV-Lampe für 15 min. Gezogen Pipetten sollte bei 2 mm von der Kante der Spitze zu kennzeichnen.
4. Bereiten 0,1% Gewicht / Volumen schnell grün Löauf durch Mischen sterilfiltriert 0,9% iger Kochsalzlösung mit trockenem schnell grün.

2. Abschnitt 2. Tierische Vorbereitung, Glaspipette Laden und Plasmid Injection

1. Entfernen postnatalen Tag 0-1 Welpen einzeln aus Käfigen, statt auf eine Glas-Petrischale vorgekühlt auf 4 ° C, und legen Sie dann auf nassem Eis.
2. Nach ca. 5 min, bestimmen den Zustand der Betäubung durch die Nutzung der Fuß Prise Antwort. Wenn keine Bewegung auftritt, unterliegen Welpen zu intraventrikuläre Injektion.
3. Es ist wichtig zu beachten, dass die Kombination von schnell grün, DNA und Salzlösung kann in schneller Verdampfung, Kristallisation und Blockade Glaspipetten führen. Daher erzeugen eine Stammlösung und aliquoten 1-2 ul auf Parafilm unmittelbar vor Injektionen.
4. Saugen Sie die gesamte aliquotierten Lautstärke mit dem gezogenen Glaspipette.
5. Halten Sie den Kopf des Welpen zwischen Daumen und Zeigefinger der weniger dominanten Hand.
6. Schalten Sie Lampe eind Halten Sie den Kopf des Welpen etwas außerhalb des Lichtstrahls. Falls erforderlich, setzen auf den Kopf Kochsalzlösung, um die Menge an Licht, das von pup wider reduzieren. Die Ventrikel sollte nun beleuchtet werden.
7. Mit Ihrer dominanten Hand, die Nadel in lateralen Ventrikel am nächsten zu Ihnen (1A und 1B). Die Injektionsstelle sollte ungefähr gleich weit von der Lambdanaht und Auge und 2 mm lateral zur Sagittalnaht. Legen Sie zog Pipette auf die 2 mm Marke für eine P0 Welpen, die sollten das Eindringen in den lateralen Ventrikel zu gewährleisten. Zufällig, sehen Sie möglicherweise Verfüllen von CSF in die Pipette aus der Auflösung von Hirndruck. Um Hirndruck, die Injektion von Plasmid hilft zu reduzieren, lockern Sie Ihren Griff auf den Kopf des pup.Step 2,8. Inject rund 0,5 ul Plasmid in lateralen Ventrikel mit einem Luft-Druck-Injektor (Picospritzer, Parker).

3. Abschnitt 3. Elektroporation und Recovery

1. Set die Spannung des Generators Elektroporation für 5 Rechteckimpulsen, 50 msec / Impuls bei 100 Volt mit 950 msec Intervallen. Die räumliche Spezifität von Plasmid Elektroporation wird durch die Bündelung von Charge-Transfer diktiert. Besondere Aufmerksamkeit sollte auf die Platzierung angesichts der Heterogenität der Stammzell-Populationen entlang der SVZ ⁸ gegeben. Unterschiede in den Raten von Proliferation und das Schicksal der Zelle haben ventral-dorsal und rostral-kaudale Standorten ^9,10 identifiziert worden.
2. Sobald das Plasmid injiziert wird, dip Pinzette Elektroden in PBS. Dieser Schritt dient dazu Ladungstransfer zu maximieren und Verbrennungen durch Widerstand zu verhindern.
3. Platzieren Sie die positive Elektrode auf der dorsalen seitlichen Wand des pup nahe dem Ohr ipsilateral zur Stelle von Plasmid-Injektion (1C und 1D). Zeigen die negative Elektrode auf der kontralateralen ventralen seitlichen des pup Schnauze.
4. Initiieren Stromübertragung durch Drücken der Puls footsHexe Pedal und fegen die Elektroden von dorsal nach lateral mit ~ 25 °-Winkel Abständen.
5. Ort elektroporiert Jungtieren auf ein Heizkissen für 5 min. Drehen Sie vorsichtig Welpen alle 30 sec mit einer milden Stimulation.

Ergebnisse

Neonatal Subventrikulärzone Elektroporation Ergebnisse bei der Etikettierung von fast allen radialen Gliazellen zusammenhängend mit dem Rücken, dorsal lateral und lateral Subventrikulärzone nach dem "Sweeping" Bewegung der Pinzette Elektrode (1E). Allerdings kann Elektroporation der Anforderung des jeweiligen Experiments zugeschnitten werden, aber nicht Fegen der Elektrode und unter Verwendung spezifischer Anordnung und Ausrichtung, wie in dem Video. Da beispielsweise dorsal örtlichen rad...

Diskussion

Hier im Einzelnen die Technik der neonatalen SVZ Elektroporation, eine Technik, um schnell und robust beschriften und manipulieren SVZ Stammzellen und deren Nachkommen. Es gibt mehrere Vorteile, die Elektroporation im Vergleich zu anderen Techniken aufweist. Erstens, da der Schwerpunkt Markierung von Zellen, ist man in der Lage zu Zelle autonom und nicht zellautonomen Effekte zu erkennen. Zweitens genetischen Manipulation unter Verwendung induzierbare Systeme ermöglicht es, Effekte vor oder nach Integration synaptische...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
Schwere Polished Borosilikat Tubing	Sutter Instrument	BF150-110-10
Dual-Stage Glas Feinpipettenziehvorrichtung	Narishige	PC-10H
Fast Green	Fischer Scientific	0521192205
ECM 830 Square Wave Impulsgeber	Harvard Apparatus	45-0052
Tweezertrodes	Harvard Apparatus	45-0488
Fiber-Optic Light Source	Fisher Scientific	12-562-36
Tungsten HalogenLampe	USHIO America, Inc	1002247
Picospritzer II	Parker Instruments	052-0312-900