Optimierte System for Cerebral Perfusion Überwachung im Rat Stroke Modell Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion

Zusammenfassung

Zerebrale Perfusion Überwachung wurde gezeigt, dass die Genauigkeit des ischämischen Schlaganfalls Modelle zu verbessern. Technische Schwierigkeiten oft die Begrenzung der Verwendung dieses unverzichtbares Werkzeug für zerebrovaskuläre Forschung. In diesem Video wird ein optimiertes System gezeigt, dass eine Einzel-oder Multi-Site hämodynamische Monitoring bei intraluminalen Mitte Zerebralarterie bei Ratten zu erhalten.

Zusammenfassung

Die translatorische Potenzial der prä-klinischen Schlaganfall-Forschung hängt von der Genauigkeit der experimentellen Modellierung. Hirndurchblutung Überwachung in Tiermodellen von akutem ischämischem Schlaganfall ermöglicht eine erfolgreiche Arterienverschluss bestätigen und auszuschließen Subarachnoidalblutung. Zerebrale Perfusion Überwachung kann auch verwendet werden, um intrakranielle Kollateralkreislauf, die als entscheidender Faktor für einen Schlaganfall Ergebnis und einer möglichen therapeutischen Angriffspunkt abzeichnet studieren. Trotz einer anerkannten Rolle der Laser Doppler Perfusion Überwachung als Teil der aktuellen Richtlinien für experimentelle zerebrale Ischämie, gibt es eine Reihe von technischen Schwierigkeiten, die Grenze ihrer Verbreitung. Eines der Hauptprobleme ist der Erhalt eines sicheren und verlängerte Befestigung eines Tiefschweißen Laser-Doppler-Sonde an das Tier Schädel. In diesem Video zeigen wir unseren optimiertes System für die zerebrale Perfusion Überwachung während transienter Mitte Zerebralarterie durch intraluminale Faden in der Ratte. Wir entwickelten in-Haus eine einfache Methode, um eine maßgeschneiderte Halter für Twin-Faser (Tiefenwirkung) Laser Doppler-Sonden, die Multi-Site-Überwachung zu ermöglichen, wenn nötig zu erhalten. Eine kontinuierliche und anhaltende Überwachung der zerebralen Perfusion könnte leicht über den intakten Schädel gewonnen werden.

Einleitung

Translationale Forschung auf hämodynamische Faktoren Schlaganfall Pathophysiologie und Therapie umgesetzt werden muss, da diese wichtige Frage wird oft paradoxerweise durch Grundlagenuntersuchungen ¹ vernachlässigt.

Zerebrale Perfusion Überwachung ist ein wesentlicher, aber wenig genutzt, Werkzeug für präzise ischämischen Schlaganfall Modellierung ^2. Abgesehen von der Bestätigung der arteriellen Gefäßverschluss und Ausschluss von Subarachnoidalblutung ^3, kann eine kontinuierliche zerebralen Perfusion Überwachung nützliche Daten über den Grad und die Konsistenz der Perfusionsdefizit, der funktionelle Status des intrakraniellen Kollateralen und die hämodynamische Wirkung neuer therapeutischer Ansätze.

Eine aktuelle Studie aus unserer Gruppe zeigen, dass Multi-Site hämodynamischen Monitoring verwendet werden, um intrakranielle Kollateralkreislauf beurteilen und kann Infarktgröße und funktionale Defizit ⁴ vorherzusagen. Diese experimentellen Befunde sind consiStent mit klinischen Studien, dass die funktionelle Leistungsfähigkeit der zerebralen Kollateralkreislauf prädiktiven klinischen Verlauf von Patienten mit ischämischem Schlaganfall ^{5, 6} ist gezeigt. Aus diesem Grund wurden cerebralen Kollateralen als potentielle Therapeutika Target in der Akutphase von ischämischen Schlaganfall ⁷ empfohlen worden.

Laser-Doppler (LD) Instrumente sind die häufigste Werkzeug zur zerebralen Perfusion im experimentellen Schlaganfall und ihre Verwendung ist durch die jüngsten Leitlinien zu diesem Thema ⁸ empfohlen messen. LD Geräte messen mikrovaskulären Durchblutung in einem kleinen Volumen kortikalen, die Tiefe des aufgezeichneten Signals abhängig ist von der Breite der Fasertrennung, mit zwei Sonden LD Faser ermöglicht eine größere Penetration im Vergleich zu einzelnen Faser LD Sonden ^9. Blutfluss Werte werden als willkürlich Perfusion (VE), die relative anstelle von absoluten zerebralen Blutflusses geben ausgedrückt. Kalibrierung von PU ist in der Regel usin durchgeführtg Motilität Normen, nach den Anweisungen des Herstellers. LD Flowmetrie ermöglicht eine kontinuierliche dynamische Überwachung und Generierung von quantitativen Daten in der gleichen Sitzung.

Zu den technischen Problemen, die derzeit die Begrenzung der Verwendung von LD ist ein wichtiges Thema erhalten eine sichere und anhaltende Befestigung einer tiefen Durchdringung Laser-Doppler-Sonde an das Tier Schädel. Dies ist wichtig für eine längere Überwachung und, wenn mehrere Sonden für verschiedene zerebrale arterielle Gebieten verwendet werden, wie wir in unserem Labor durchführen.

Insbesondere wird verlängerte Operationszeit erforderlich, wenn Sonden mit dem Schädel mittels Bohrlöchern oder Schädel Schrauben befestigt sind, während schlechte Signalqualität und unsicheren Befestigung erfolgt, wenn einzelne Faser (low-Penetration) LD Sonden an dem Schädel durch einfache chirurgische Kleber befestigt sind. Twin Faser (Tiefenwirkung) LD Sonden eine höhere und gleichmäßigere Signal, aber sie sind größer als einzelne Faser Sonden und kann nicht sein,schraubten Schädel mit chirurgischen Kleber nur.

In diesem Video zeigen wir unseren optimiertes System für die zerebrale Perfusion Überwachung während transienter Mitte Zerebralarterie durch intraluminale Faden in der Ratte. Wir beschreiben eine einfache Methode, um eine effiziente, maßgeschneiderte, kostengünstige Halterung für einzelne oder mehrere Doppel-Faser (Tiefenwirkung) LD-Sonden, für längere Überwachung der zerebralen Perfusion über den intakten Schädel verwendet werden erhalten.

Das chirurgische Verfahren zur transienten MCAO in der Ratte konnte in dem Video-Artikel durch Uluç und Mitarbeiter ¹⁰ gesehen werden kann und nicht in diesem Video gezeigt.

Protokoll

Ein. Wie man die Probe Halter (Single-Site oder Multi-Site)

1. Die benötigten Materialien sind Naturkautschuk, Kunststoffröhrchen und einem Metall Stilett. Der Sondenhalter an die Größe des Tiers, die Anzahl und Größe der Laser-Doppler-Sonden und dem zerebralen vaskulären Territoriums zur überwacht werden muss angepasst werden.
2. Ausschneiden der Naturkautschuk der benötigten Größe (etwa 10 mm x 10 mm für eine 300 g Ratte).
3. Die Positionen der Sonde (n) und dem auf dem Bregma Naturkautschuk, je nach den gewünschten stereotaktischen Koordinaten; für mittlere Zerebralarterie die typische Koordinaten für den ischämischen Kern an Bregma -1 mm, 5 mm seitlich von der erwartete Mittellinie; für einen peripheren ischämischen borderzone Gebiet können die erwarteten Koordinaten an Bregma 2 mm, 2 mm lateral zur Mittellinie liegen.
4. Markieren sehr deutlich die Position des Bregma mit X, das ist die Landmarke zum Anbringen der Sondenhalter zum Schädel.
5. Legen des Stiletts in ein kleines Kunststoffrohr (dessen Größe benötigt, um die Größe der Sonde entsprechen).
6. Legen der Mandrin in dem Naturkautschuk an dem Punkt, wo die Sonde positioniert zu werden; schieben Mandrin in den Kautschuk, bis das Kunststoffrohr in das Gummi auch eingesetzt worden.
7. Ziehen Sie den Mandrin.
8. Wenn mehrere Sonden benötigt werden, wiederholen Sie die Schritte 1,5-1,7 für andere Sonde Positionen.
9. Optional für mehrere Sonden: wickeln Sie ein Maßband um den Kunststoffrohren, um eine bessere Stabilisierung der Sonden zu gewährleisten.
10. Optional: Führen Sie die chemische Sterilisation von mehreren Sondenhalterungen für zukünftige Nutzungen.

2. Präoperative Vorbereitung

1. MCAO Hubmodell wird in der Regel als Überlebensstrategie Operation durchgeführt. In diesem Fall, wie in unserem Video gezeigt (Überlebenszeit 24 Stunden nach der Operation), benutzt der Chirurg eine aseptische Technik mit sterilisierten Instrumente und Verbrauchsmaterialien.
2. Anesthetize die Ratte mit Isofluran (3% induction Phase, 1,5% Wartung).
3. Legen Sie die Ratte in Bauchlage auf dem OP-Tisch.
4. Sanft rasieren den Kopf der Ratte.
5. Tragen Sie eine antiseptische Lösung zu einem Gaze und desinfizieren die Haut.
6. Applizierhilfe Lidocaine 2% 5 mg / kg subkutan im Schädelbereich.

3. Probe Positionierung und Sicherung über die intakte Schädel

1. Biegen Sie rechts paramedian Hautschnitt (für rechts MCAO) und zerlegen das subkutane Gewebe um den kranialen Faszie (galea aponeurotica) zu erreichen.
2. Biegen Sie rechts paramedian Einschnitt in der kranialen Faszie und führen stumpf, um den Schädelknochen erreichen; bereiten ein Schädelknochen Fläche, die groß genug ist für die Anwendung der Sondenhalterung.
3. Bitte beachten Sie: keine Notwendigkeit für Bohr-oder Knochenschwund.
4. Bewerben Merbromin Lösung desinfizieren und trocknen den Schädel Oberfläche.
5. Nutzen Sie einen Fön (Satz für kalte Luft) zur Beschleunigung der Trocknung der Kopfoberfläche.
6. An diesem Punkt sind die Schädelnähte und der Bregma deutlich sichtbar.
7. Passen Sie die Sondenhalterung, indem Sie die Ränder mit einer sterilen Schere.
8. Tragen Sie eine kleine Menge der chirurgischen Kleber (Cyanacrylat-, Veterinär-Zulassung) auf der Oberfläche unter dem Sondenhalter, sorgfältig vermieden die untere Öffnung der Kunststoffrohre (bitte beachten Sie: wenn eine signifikante Menge des Klebers bleibt zwischen der optischen Oberfläche der Sonde und der Schädel, kann dies zu einem Low-Signal und kann die Sonde nach mehreren Anwendungen beschädigen).
9. Übernehmen Sie die Sonde Halter an der Kopfoberfläche, die sorgfältige Abstimmung der bregma mit dem X Wahrzeichen. Sanften Druck auf den Sondenhalter.
10. Nutzen Sie einen Fön (Satz für kalte Luft) zur Beschleunigung der Trocknung des chirurgischen Klebers.
11. Sichern Sie die Sondenhalterung durch Anbinden eines chirurgischen Faden um den Sondenhalter und dem Kopf des Tieres; vorsichtig sein, um den chirurgischen Faden über den Unterkiefer zu positionieren, die Vermeidung der Submandibulärregion und the Hals.
12. Optional füllen den Kunststoffschlauch (en) der Sondenhalterung mit einem optischen Gel (z. B. eine gemeinsame Ultraschall oder Elektrokardiographie Gel), was die Qualität des LD-Signals zu erhöhen.
13. Legen Sie die Sonde (n) in der Sondenhalterung und überprüfen Sie die aktuelle Lesung des LD-Durchflussmesser. Verwenden Sie den LD-Durchflussmesser nach den Anweisungen des Herstellers.
14. Befestigen Sie die Sonde (n) binden sie um den Kopf des Tieres; vorsichtig sein, um den chirurgischen Faden über den Unterkiefer zu positionieren, die Vermeidung der Submandibulärregion und den Hals.

4. Cerebral Perfusion Monitoring Während MCAO

1. Legen Sie die Ratte in der Rückenlage, sorgfältig vermieden Zugkräfte auf die Sonde (n) oder Sondenhalter.
2. Starten zerebralen Perfusion Überwachung während MCAO.

5. Die Entfernung der Sonde (n) und Sondenhalter

1. Schneiden die Fäden um die Sonde (n), dem Sondenhalter und dem Kopf des Tieres.
2. Sanft abzustumpfen sezieren kranialen Weichteile und Haut um den Naturkautschuk Basis der Sondenhalterung.
3. Entfernen Sie den Sondenhalter.
4. Tragen Sie eine antiseptische Lösung der Kopfoberfläche.
5. Naht der Schädelbasis Haut.

6. Post-operative Pflege

1. Verwalten 2,5 ml Kochsalzlösung subkutan zu Dehydrierung vorzubeugen und die Tier warm mit einem Heizkissen nach dem Anhalten gasförmigen Anästhesie.
2. Für das Überleben der Operation: bieten präventive Analgesie mit Ketoprofen 4 mg / kg subkutan und wiederholen Sie die gleiche Dosis bei 12 Stunden nach der Operation
3. Unter unseren experimentellen Bedingungen wurde Euthanasie bei 24 Stunden nach der Operation durch CO _2-Inhalation durchgeführt.

Ergebnisse

Transient MCAO (60 min) wurde durch Einsetzen eines silikonbeschichteten Filament in der Arteria carotis externa induziert. Der Faden wurde dann durch das Abschlussende der Arteria carotis interna bis zum Ursprung der MCA geschoben, unter LD Überwachung. A. carotis communis und pterygopalatin Arterie wurden transient während des chirurgischen Einsetzen des Filaments verschlossen. Eine schematische Darstellung des chirurgischen Eingriffs ist in 1A gezeigt.

Der kraniale Koordinaten für die Positionierung der zwei LD-Sonden wurden gemäß dem zugrundeliegenden arteriellen Gebiet gewählt. Vorläufige Experimente mit Gelatine-ink Perfusion (Abbildung 1B) zeigten, dass die ischämischen Kern in der zentralen MCA Territorium (bregma -1 mm, 5 mm von der Mittellinie; Probe 1) Es wird erwartet, während die Sicherheiten Strömung im borderzone Gebiet zwischen dem erwartet wird, kortikalen Bereichen der mittleren und vorderen Hirnarterien (bregma 2 mm, 2 mm von der Mittellinie; Probe 2).

Zerebraler Hämodynamik wurde mittels Multi-Site-Laser-Doppler-Fühler während der gesamten Dauer des chirurgischen Eingriffs, also vor, während und nach MCAO (Abbildung 2). Der zerebrale Perfusion Defizit während MCAO war kleiner und zeigten eine höhere Variabilität in Probe 2 im Vergleich zu Probe 1, was darauf hindeutet, inter-individuelle Unterschiede in der funktionellen Leistung von intrakraniellen Sicherheiten unter ischämischen Bedingungen. Die Multi-Site-Laser-Doppler-Überwachung ermöglicht auch die zerebralen hämodynamischen Veränderungen während der Okklusion proximal extrakraniellen Hirnarterien (Arteria carotis communis, A. carotis interna, pterygopalatin Arterie) zu studieren.

Stroke Ergebnis wurde 24 Stunden nach der Reperfusion untersucht, indem Infarktvolumen, berechnet auf 19 aufeinander folgende Abschnitte mit Kresylviolett (Abbildung 3), und Garcia funktionale neuroscore ¹¹ gefärbt. Immunhistochemie für spezifische Marker associated mit ischämischer Hirnverletzung wurde durchgeführt, um eine topographische Verteilung der neuronalen Verlust (Mikrotubulus-assoziiertes Protein 2, MAP2) und ischämischen Penumbra (Hitzeschockprotein-70, Hsp70) in Bezug auf die Multi-site hämodynamischen Überwachung des intrakranialen Zirkulation zu erhalten (Abbildung 4).

Abbildung 1. Zerebrale Perfusion Überwachung während intraluminale MCAO bei der Ratte. A. Schematische Darstellung des chirurgischen Eingriffs für transiente MCAO. Ein silikonbeschichteten Filament wurde verwendet, um den Ursprung des MCA verschließen, nachdem sie in der externen Karotis-Arterie eingeführt und geschoben durch die Arteria carotis interna. Proximal Halsarterien wurden entweder ligiert (Arteria carotis externa) oder transient verschlossenen (pterygopalatin Arterie und A. carotis communis) während des VerfahDure. B. Ein Vertreter des Gehirns nach Gelatine-Ink-Färbung dargestellt. Transcardiac Perfusion von Gelatine-Tinte Lösung wurden 60 min nach dem Beginn der Ischämie durchgeführt, ohne Reperfusion. Die normalerweise perfundiert Gehirn wurde durch Gelatine-Tinte gefärbt und erschien als graue Farbe mit schwarz gebeizt Schiffe, während der ischämischen (nicht durchbluteten) Bereich blieben ungefärbt (pink-farbig). Kranialen Koordinaten für die Positionierung der zwei LD-Sonden dargestellt sind. Probe 1 = -1 mm von bregma, 5 mm von der Mittellinie; Sonde 2 = 2 mm von bregma, 2 mm von der Mittellinie.

Abbildung 2. Cerebral hämodynamischen Aufnahmen mit Multi-Site-Laser-Doppler-Sonden. Ein typisches hämodynamischen Muster, das funktionell aktive intrakraniellen Sicherheiten schlägt unter ischämischen Bedingungen gezeigt. In diesem Tier zeigte LD Kurven eine kleineer Perfusionsdefizit in Probe 2-Kanal, im Vergleich zu 1-Kanal, sowohl während der CCA Okklusion und MCA-Okklusion Sonde. MCA-O = mittel Zerebralarterie. CCA-O = A. carotis communis Okklusion. VE = Perfusion Einheiten.

Abbildung 3. Repräsentative Gehirnschnitte zur Berechnung Infarktvolumen Histologische Kranzschnitte (50 um, n = 19 mit 250 um Intervall; Bregma 2,5 mm bis -3,0 mm). Werden in 4% Paraformaldehyd fixiert und mit 0,1% Kresylviolett fixiert. Infarktvolumen errechnet ImageJ Bildverarbeitungssoftware für inter-hemisphärische Asymmetrien auf Hirnödem korrigiert und ausgedrückt in mm ^3. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen

Abbildung 4. Immunfärbung von molekularen Markern von Neuronenverlust und Penumbra Repräsentative aufeinanderfolgenden Gehirnschnitte gezeigt sind, wurden mit welcher Kresylviolett 0,1% (A) gefärbt oder mit Markern immungefärbt des neuronalen Verlustes (Mikrotubulus-assoziiertes Protein 2, MAP2, B). Und ischämischen Penumbra (Wärme shock protein-70, Hsp70, C).

Diskussion

Wir entwickelten in-house eine einfache und kostengünstige System für eine sichere Befestigung von einem oder mehreren Doppel-Faser (tiefe Penetration) LD Sonden an den intakten Schädel von Ratten während der MCAO Verfahren. Wenn auch scheinbar triviale Problem, wodurch eine sichere Befestigung des LD-Sonde auf den Schädel ist eigentlich ein großes Problem in diesem experimentellen Einstellung, da sie die Voraussetzung für einen reibungslosen Signalerfassung und eine erfolgreiche Überwachung der zerebralen Perfusion ist.

Invasiven Verfahren, wie Bohrlöcher und Knochenschrauben, üblicherweise verlängern die Operationszeit und einführen experimentellen Variablen bezüglich Kraniotomie, und dies kann Forscher abzuschrecken und unterlassen sie von den LD-Überwachung. Andererseits ergibt die Verwendung einer einzelnen Faser (Low Penetration) Sonden, die dünner und relativ leichter sind direkt an der Kopfoberfläche geklebt werden, niedriger Qualität empfängt und nicht verlässlich mit erwachsenen Ratten verwendet werden, ohne Bohren oder Verdünnen des Schädels.

Wir verwendeten einfache und preiswerte Materialien wie Naturkautschuk, Kunststoffröhrchen und einem Metall Stilett. Ein maßgeschneidertes Sondenhalter kann in wenigen Minuten hergestellt werden und an die experimentellen Bedingungen. Diese Sondenhalterungen Platz eins oder mehr Tiefenwirkung LD Sonden für klassische Single-Site-Monitoring auf der ischämischen Kern oder für mehrere Kontrollen vor Ort in verschiedenen arteriellen Gebieten in derselben Hemisphäre oder über den beiden Hemisphären. Viele Sondenhalterungen könnte hergestellt, chemisch sterilisiert werden und zur späteren Verwendung gespeichert. Veterinär-zugelassene chirurgische Kleber (cyanoacrilate), durch kalte Luft beschleunigt wird, wird verwendet, um den Sondenhalter zum intakten Oberfläche der Ratte Schädels anzubringen, je nach den gewünschten kranialen Koordinaten. Schließlich wird die Sonde Aufbau ferner anstelle von gemeinsamen Nähte befestigt.

Die Gesamtzeit dieser LD-Sonde Set-up, nachdem die Beherrschung dieser Technik ist etwa 10 min.

Wie gezeigt in Dieses Video haben wir routinemäßig überwachen zerebralen Perfusion im zentralen MCA Territorium (LD Sonde 1: ischämische Kern) und im peripheren MCA Territorium (LD-Sonde 2: hauptsächlich eine penumbral Bereich). In unserer Studie zeigten wir, dass die Variabilität des Blutflusses in LD Sonde 2 (Mittelwert 52% ± 16% SD, verglichen mit der Grundlinie) höher ist im Vergleich zu LD Sonde 1 (Mittelwert 31% ± 6% SD, verglichen mit der Ausgangswert) und können zur Schlaganfall Ausgang ⁴ vorherzusagen.

Möglicherweise stellen wir einige der Fehlersuche Ratschläge für Forscher, die gerne unsere in-house entwickelte System verwenden möchten. Zu Beginn des Experiments wurden vorsichtig sein, um sehr gut trocknen Kopfoberfläche (mit Merbromin und kalte Luft) vor dem Anbringen der Sondenhalterung eine vorzeitige Ablösung vermeiden. Darüber hinaus sicher sein, um den Kleber auf der Naturkautschuk anzuwenden, Vermeidung von Kontakt mit dem offenen Ende des Kunststoffrohrs und die optische Oberfläche der LD-Sonde, zu schlechten Signal und eine mögliche Beschädigung der Sonde zu verhindern. Wenn binden die Naht um den Kopf des Tieres, sein, um Luftwege vorsichtig (dies wird durch die Positionierung des Fadens über den Unterkiefer Knochen verhindert). Nach dem Positionieren und Befestigen der Sonden, darauf achten, nicht die Traktion Sondenkabel beim Drehen das Tier in Rückenlage für Gebärmutterhalskrebs Chirurgie; dieser Schritt erfordert in der Regel zwei Personen, eine Person, die das Tier und eine zweite Person, die Fühlerkabel und sanft positionieren sie an die gewünschte Position. Schließlich wird eventuelle Kontamination mit Blut des Twin-Faser-LD-Sonde einfach nach den Reinigungshinweise des Herstellers verwaltet.

Unser optimiertes System für zerebrale Perfusion Überwachung, wie in diesem Video gezeigt, könnte eine einfachere, schnellere und zuverlässigere Alternative zu der Sonde Set-up-Systeme, die derzeit von Unternehmen der gewerblichen Wirtschaft sind in diesem Bereich verkauft. Darüber hinaus glauben wir, dass die Verwendung dieses Systems durch andere Forscher haben möglicherweise das Gestüt zu verbesserny von zerebraler Hämodynamik im experimentellen Schlaganfall Feld, das zur Entwicklung einer neuen Generation von cerebralen Sicherheiten Therapeutika.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Ausrüstung
MoorVMS-LDF 2-Kanal-Laser-Doppler-Monitor	Moor Instruments
VP12-Sonde	Moor Instruments
			Reagent / Material
Doccol silikonbeschichtetes Filamentgröße 4-0, Durchmesser mit Beschichtung 0.39mm	Doccol Konzern	403956PK10
Naturkautschuk, zB gemeinsame Schnuller für Neugeborene			MehrereLieferanten
Metall Stilett, zB aus Spinalnadel 18 GA x 90 mm			Mehrere Lieferanten
Kunststoffrohre, zB aus der Vene zur Infusion 25 GA x 20 mm eingestellt			Mehrere Lieferanten
Resorbierbaren Nahtmaterial, beschichtet, geflochten aus Seide			Mehrere Lieferanten
Cyanoacrylat chirurgischen Leim			Mehrere Lieferanten
Isofluran (100% v / v) für den tierärztlichen Gebrauch			Mehrere Lieferanten