Einführung in die Festkörperphysik Unterstützte Membrane Basierend Elektrophysiologie

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen eine elektrophysiologische Verfahren auf festen unterstützt Membranen mit Fokus auf ihre Anwendungen für die Charakterisierung von elektrogenen Membrantransportern basiert.

Zusammenfassung

Die elektrophysiologischen Verfahren präsentieren wir auf einer festen Membran unterstützt (SSM) eines Octadecanthiol Schicht auf einem mit Gold beschichteten Sensorchip und einem Phosphatidylcholin Monoschicht auf chemisorbierten komponiert wurde. Diese Anordnung wird in eine Küvette, enthaltend die Bezugselektrode, ein chlorierter Silberdraht befestigt.

Nach der Adsorption von Membranfragmente oder Proteoliposomen mit dem Membranprotein von Interesse, ist eine schnelle Lösung Austausch verwendet werden, um den Transport Aktivität des Membranprotein zu induzieren. In der einzigen Lösung Austauschprotokoll beiden Lösungen werden eine nicht-aktivierende und eine aktivierende Lösung benötigt. Die Strömung wird durch Druckluft und ein Ventil und Schlauchsystem in einem Faraday-Käfig gesteuert.

Die Kinetik der elektrogenen Transportaktivität wird über eine kapazitive Kopplung zwischen der SSM und die Proteoliposomen oder Membranfragmente erhalten. Das Verfahren wird daher ergibt nur transient Ströme. Der Spitzenstrom stellt den stationären Transport-Aktivität. Die zeitabhängige Transporter Ströme können durch die Schaltung Analyse rekonstruiert werden.

Diese Methode ist besonders für prokaryotische oder eukaryotische Transporter Transporter von intrazellulärer Membranen, die nicht durch Patch-Clamp-oder Spannungsbegrenzer Methoden untersucht werden kann geeignet.

Einleitung

Hier zeigen wir eine neue elektrophysiologische Ansatz auf einem festen Träger Membran (SSM) für die Charakterisierung von Membranproteinen elektrogenen basiert.

Der feste Träger aus einer dünnen Goldschicht auf einem Glasträger, wobei der Sensor-Chip. Die hydrophile Goldoberfläche wird die Thiolgruppe eines alcanethiol Reagenz zu binden. Danach schließt Selbstmontage einer Phosphatidylcholin monolyer die Bildung der SSM.

Um elektrogenen Reaktionen von Membranproteinen zu messen, werden Proteoliposomen oder Membranfragmente der SSM (Abbildung 1) adsorbiert. Die Protein enthaltenden Membran und die SSM bilden dann einen kapazitiv gekoppelten Membransystem. Daher kann Ladung Translokation an der Protein enthaltenden Membran durch kapazitive Kopplung über den SSM detektiert werden. Diese Methode liefert nur transienten Strömen. Der Spitzenstrom stellt den stationären Transport-Aktivität. Die zeitabhängige Transporter currents kann durch die Schaltung Analyse rekonstruiert werden.

Der Sensor-Chip in eine Küvette (Abbildung 2) angebracht ist. Die Küvette weist eine zylindrische Küvette Volumen von 17 ul (Nettovolumen mit O-Ring montiert). Federkontaktstift schafft den Kontakt mit dem Verstärker. Ein Auslass-Anschluss an der Oberseite des Hauptteils angeschraubt und führt die Bezugselektrode, ein chlorierter Silberdraht.

Die Küvette wird in einem Faradayschen Käfig montiert. Es ist mit einer Fluidleitung, die verwendet werden, um den Transport Aktivität des Membran-Protein in Reaktion auf eine schnelle Lösung Vermittlungsstelle (3) induziert ist. In der einzigen Lösung Austauschprotokoll beiden Lösungen werden eine nicht-aktivierende und eine aktivierende Lösung erforderlich. Die Strömung wird durch Druckluft über eine Steuerungssoftware auf einem Computer oder Handschalter auf einem Interface-Box gesteuert.

Protokoll

1. Einrichten einer Vorrichtung zum SSM-basierte Elektrophysiologie

Einzelheiten sind in zwei unserer technischen Publikationen, die auch schematische Zeichnungen und Fotografien von unseren Küvetten und Einrichten ^{1, 2} gegeben. Unterschiedliche Konfigurationen Lösung Austausch und Durchfluss-Protokolle sind auch in unserer Methode Papier ² diskutiert.

Im Folgenden wollen wir noch ein paar letzte Verbesserungen und technische Details, die von unmittelbarer Bedeutung für die Video-Präsentation sind.

Ventilsteuerung und Datenerfassung

Die Interface-Box enthält einen handelsüblichen USB-Digitalausgang / Analog-Input-Schnittstelle (NI USB 6009 National Instruments) und die Ventil-Treiber. Es steuert die Lösung fließen und ist verantwortlich für die Datenerfassung. Ventile werden in der Regel mit 12 angetrieben V. Doch für schnelle Schaltzeiten der Ventile mit einer Spannung von bis zu 18 gefahren werden V. In dem Video verwenden wir eine 12 V Spannungsversorgung.

Das Ventil Treiber Leiterplatte betreiben vier Ventile. Es wurde von der Werkstatt des Max-Planck-Institut für Biophysik hergestellt. Ventile können per Computer oder manuell über Schalter an der Frontplatte gesteuert werden. Letzteres ist zum Spülen-und Reinigungsarbeiten-Verfahren bequem. Während der Messung ist die Interface-Box computergesteuerten mit einer Ventilsteuerung und Datenerfassungs-Software (SURFE ² R-Software, IonGate Biosciences).

2. Vorbereitungen

In diesem Abschnitt werden die verschiedenen Protokolle für die Herstellung eines SSM-basierte Elektrophysiologie Experiment genannt.

2.1 Herstellung der Lipid-Lösung für die Bildung des SSM

1. Mix 25 ul Octadecylamine (5 mg / ml in Chloroform) und 375 ul Diphytanoylphosphatidylcholine (20 mg / ml in Chloroform) in einem Glas Fläschchen.
2. Unter Verwendung eines Rotationsverdampfers und kontinuierlichen Strom von Stickstoffgas, dampft das Chloroformca. 30 min.
3. Entfernen Sie das Lipid aus den Wänden der Glasampulle durch Schütteln mit 500 ul n-Dekan. Die endgültige Lipidkonzentration 15 mg / ml mit 1:60 (w / w) Octadecylamin.
4. Die Lösung wird in das Glas Lagervials. Bewahren Sie die Lipid-Lösung bei -20 ° C.

2.2 Chlorierung des Referenz-Elektrode

Die Referenzelektroden müssen in regelmäßigen Abständen durch Abrieb chloriert werden.

1. Entfernen Sie den Rest des alten Silberchlorid Schicht mit feinem Sandpapier vor der Chlorung.
2. Setzen Sie den Silberdraht zusammen mit einem Platin-Elektrode in eine 1 M Salzsäure-Lösung und chloren für 15 min bei 0,5 mA. Nach Chlorierung, ändert der Silberdraht seine Farbe zu einer homogenen dunkelgrau.

2.3 Herstellung des Polyacrylamidgel Brücke

1. Bereiten einer Lösung, die 100 mM KPi bei pH = 7, 100 mM KCl und 6% Acrylamid.
2. In 0,3% APS (10% Lager) und 0,6% TEMED und kurz mischen die Lösung mit einer Pipette.
3. Unmittelbar nach dem Mischen der Lösung mit einer Pipette 30 ul der Mischung in den leeren Gelbrücke Behälter zu injizieren. Es ist wichtig, um Luftblasen während der Injektion zu vermeiden.
4. Während einer Inkubationszeit von 20 min das Gel polymerisiert.
5. Nach der Polymerisation wird das Gel Brücke wird in Lösung (100 mM KPi pH 7, 100 mM KCl) gespeichert. Um die Lebensdauer der Brücke zu verlängern Gel wird die Lösung bei 4 ° C gelagert

2.4 Herstellung der Messlösungen

Aufgrund der starken Wechselwirkung der gelösten Stoffe mit dem SSM werden elektrische Artefakte erzeugt werden, wenn Lösungen unterschiedlicher Zusammensetzung ausgetauscht werden. Daher ist die Herstellung der Lösungen ein kritischer Schritt. Nehmen Sie die folgenden Vorsichtsmaßnahmen bei der Zubereitung der Lösung Prozess Lösung Austausch Artefakte zu minimieren.

1. Als Nicht-Aktivierung und Aktivierung Lösungen aus einer Charge, den pH-Wert und Ionenstärke.
2. Hohe Salz Hintergrund hilft Lösung Austausch Artefakte zu reduzieren.
3. Teilen Sie die Batch-Lösung in zwei Bänden.
4. Fügen Sie die aktivierende Verbindung zum aktivierenden Lösung. Verwenden Sie eine kompensatorische Verbindung in der nicht-aktivierenden Lösung, um die Osmolarität und Ionenstärke der beiden Lösungen so ähnlich wie möglich zu halten.
5. Wenn die Lösungen bei 4 ° C gelagert werden, um sicherzustellen, dass alle Lösungen Raumtemperatur erreicht, bevor eine Messung, denn auch kleine Unterschiede in Temperatur Artefakte produzieren kann.

3. Ein SSM-basierte Elektrophysiologie Experiment

Hier präsentieren wir Ihnen ein typisches Protokoll für ein SSM-basierte elektrophysiologische Experiment.

3.1 Vorbereiten des SSM-Setup

Während die SSM-Setup ist nicht in Gebrauch sind die Rohre mit einer 30% Ethanol gefüllt/ Wasser-Lösung, um das Bakterienwachstum zu verhindern.

1. Waschen Sie das System mit reinem Wasser, um das Ethanol aus dem Schlauch zu entfernen, bevor Montage der Küvette. Ersetzen Sie die Behälter mit Wasser Ethanol Behältern. Mit hohem Druck (0,6 bis 1,0 bar) reinigen Sie das System mit 20-30 ml Wasser.
2. Wiederholen Sie den Reinigungsvorgang mit einem 100 mM KPi Puffer bei pH 7,6 oder nicht-aktivierende Lösung.
3. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in der Flüssigkeit System verbleiben.

3.2 Montage der Küvette

1. Bringen Sie einen O-Ring auf die Referenz-Elektrode
2. Nehmen Sie die Gel-Brücke aus dem Storage-Lösung und verbinden Sie das Referenz-Elektrode.
3. Prefill der Auslass-Anschluss mit nicht-aktivierende Puffer, legen Sie einen O-Ring und verbinden Sie das Gel Brücke, um die Referenz-Elektroden-Einheit abzuschließen. Besondere Vorsicht, dass keine Luftblasen an der Kreuzung des Gels Brücke und dem Auslass Lösung Strömungsweg sind.
4. Vormontieren Hauptteil des cuveTTE indem die Feder Kontaktstift (Verbindung zum Verstärker), das Einlaßrohr (Verbindung zu dem Endgerät Ventil) und den O-Ring (Dichtring für den SSM) und die Schrauben.
5. Mit einer Pinzette, nehmen Sie den Sensor-Chip aus dem Speichern-Lösung (10 mM Octadecanthiol in Ethanol).
6. Mit einer Pipette abwaschen die verbleibende Lösung mit ca.. 5 ml reinem Ethanol.
7. Trocknen Sie die Elektrode unter Stickstoffgas.
8. Den Sensor Chip genau an dem Basisteil der Küvette so dass die Zulaufbohrung des Hauptteils der Küvette wird in die kreisförmige aktive Fläche des Sensors gerichtet ist.
9. 1 ul der Lipid-Lösung, um den aktiven Bereich des Sensorchips. Stellen Sie sicher, dass die Goldschicht vollständig von der Lipid bedeckt.
10. Unmittelbar nach der Zugabe des Lipid-Lösung, schließen Sie die Küvette, indem Sie die vormontierte Hauptteil.
11. Vor der Montage die Küvette in die Faraday-Käfig, sicher sein, dass alle Flächen vollständig trocken sind.
12. Connect den Verstärker an die Federkontaktstift und der Einlassröhre zum Terminal Ventil. Dann befestigen Sie die Küvette mit den Schrauben im Inneren des Faraday-Käfig.
13. Schrauben Sie den Stecker Steckdose an die Spitze der Küvette. Zum Schluss das Auslaufrohr mit dem Auslass-Anschluss und der Spannung Generator zur Referenzelektrode.
14. Unmittelbar nach der Montage der Küvettenwaschstation das System mit Puffer bei 0,6 bar. Dies führt zu einer spontanen Bildung SSM.

3.3 Messung Membranparameter

Um die Qualität des SSM zu überprüfen, sind Kapazität und Leitfähigkeit gemessen mit Hilfe der Funktion Generator.

1. Mit der Funktion Generator, gelten 100 mV Gleichspannung um die Leitfähigkeit zu messen.
2. Berechnen der Leitfähigkeit: Die Stromabfall zeigt die Aufladung des Kondensators Membran. Nachdem der Kondensator vollständig aufgeladen ist der gemessene Strom ergibt die Membran Leitfähigkeit mit Ohm-Gesetz. Aus Gründen der Einfachheit verwenden wir die current 1 Sekunde, nachdem die Spannung angelegt wird, um die Leitfähigkeit G = I / U. berechnen
3. Tragen Sie eine dreieckige AC Spannung von 50 mV Spitze-Amplitude und eine Frequenz von 0,5 Hz, um die Kapazität zu messen Höhepunkt.
4. Berechnen der Kapazität: Die Amplitude des resultierenden Rechteckstrom stellt die Ladeströme des Kondensators. Die Kapazität C ist gleich der übertragenen Ladung Q = IΔt von AU = 100 mV unterteilt. (AU ist das Doppelte der angelegten Spannung von 50 mV, weil ich die Differenz aktuellen positive minus negative Steigung des dreieckigen Spannung.)
5. Überwachen Sie die elektrischen Parameter der Membran wiederholt alle 10 min für ca. 30 bis 40 min, bis konstante Werte erreicht. Waschen dazwischen mit KPi-Puffer bei hohem Druck im Bereich von etwa 0,6 bis 1 bar.
6. Schätzen der Qualität des SSM: optimalen Parameter sind in dem Bereich von 0,1 bis 0,2 nS und 2 bis 3,5 nF. Eine hohe Leitfähigkeit über 0,8 nS und eine geringe Kapazität unter 1 nF zeigtdass die SSM nicht korrekt gebildet wird. Eine hohe Kapazität über 4 nF bedeuten kann, dass die aktive Zone nicht vollständig von der SSM bedeckt.
7. Wenn die Parameter nicht im optimalen Bereich, sollte die Membran verworfen und andere SSM hergestellt, wobei ein frisch zubereitetes Elektrodenchip.

3.4 Prüfungen für Lösung Austausch Artefakte

Nachdem die Membran Parameter überprüft wurden, sollte die Messung Puffer für Lösung Austausch Artefakte getestet werden.

1. Legen Sie die jeweiligen Container-Lösung auf das Fluid-System.
2. Entfernen Luftblasen aus dem Fluid-System, mit Hilfe der manuellen Ventilen.
3. Mit der Software zur Datenerfassung wählte den Fluss Protokoll, das Sie wollen in Ihrem Experiment verwenden.
4. Stellen Sie den Druck bis 0,6 bar und die Messung gestartet.
5. Abgesehen von den mechanischen Schalten des Ventils Artefakte im Idealfall kein Artefakt Ströme gemessen werden, oder sie sollte viel SMA dieller als die erwarteten Protein-Transport-Signale. Wenn Lösung Austausch Artefakte beobachtet werden, versuchen, die Puffer Zusammensetzungen und / oder die Vorbereitung Verfahren vor der weiteren Experiment zu optimieren.

3.5 Hinzufügen der Proteinprobe

Gewöhnlich Proteoliposomen oder Membranfragmente werden bei -80 ° C gelagert Vor jeder Messung wurde ein Aliquot von etwa 30 ul benötigt.

1. Spülen Sie das SSM mit nicht-aktivierende Lösung.
2. Tauen Sie das Protein Probe auf Eis.
3. Drei 10-sec Ultraschallbehandlung Zyklen werden mit 10-sec Kühlintervalle auf Eis wechselten. Proteoliposomen werden beschallt mit einem Ultraschallbad. Für Membranfragmente ein Tipp Ultraschallgerät (50W, 30 kHz, 1 mm Durchmesser Sonotrode, Intensität 20%, Zyklus 0.5) verwendet wird. Nach dem letzten Schritt Beschallung nicht setzen die Probe wieder auf Eis, aber spritzen sie sofort in die Küvette.
4. Lösen Sie die Ausgangs-Connector zusammen mit der Referenz-Elektrode Assembly.
5. Mit einer Pipette absaugen 30 ul der Proteinprobe und montieren Sie die Pipettenspitze auf die Auslaßbohrung.
6. Öffnen Sie die manuelle Ventil in der nicht-aktivierenden Weg zum Abfallbehälter und injizieren die Proteoliposomen in die Küvettenvolumens. Achten Sie darauf, um Luft in den Küvettenvolumens spritzen mit dem Sensor.
7. Vor dem Entfernen der Pipettenspitze, schließen Sie das manuelle Ventil zur weiteren Lösung Strömung zu verhindern.
8. Lassen Sie die Proteoliposomen an die SSM zu einer Inkubationszeit von 1 bis 2 Stunden zu adsorbieren. Es ist auch möglich, über Nacht inkubieren.

3.6 Allgemeine Vorgehensweise eines SSM-basierten Experiment

1. Warm up die Messung Puffer in der Zeit, wenn bei 4 ° C gelagert Alle Mess-Puffer müssen bei Raumtemperatur vor der Messung, um Artefakte zu vermeiden.
2. Beim Wechsel Lösungen, reinigen Sie zuerst die Rohre im Inneren der Behälter mit einer Lösung fusselfreien Gewebe, dann legen Sie die neuen Flaschen.
3. Vor Beginn der Messung, verwenden Sie die manuelle Ventile, um Luftblasen, die aus dem sich ändernden Verfahren entwickelt haben könnte entfernen.
4. Stellen Sie den Druck kurz vor Beginn einer Messung. Wir verwenden routinemäßig einen Druck von 0,6 bar, die an unsere spezifischen Ventil und Rohr-Konfiguration ergibt sich eine Flussrate von etwa 1,0 ml / sec.
5. Die ersten Messungen durchgeführt werden können direkt nacheinander durchgeführt und sollte zurückgewiesen, bis die maximale Stromaufnahme konstant bleibt. Falls die in pH unterscheiden eine Inkubationszeit von mindestens 3 min erforderlich, um den pH-Wert der inneren Proteoliposomen vor Beginn der Messung einzustellen.
6. Nun ist die Einrichtung ist für die Messung bereit. Um den Lärm zu reduzieren mindestens 3 Messungen sollten und gemittelt werden.

3.7 Kontrollmessungen

Ein Signal rundown während einer Reihe von Messungen können aufgrund Proteinabbau oder einem Verlust der Adsorption. Jedes Experiment SSM sollte ichnclude ein heruntergekommenes Kontrolle. Dies geschieht durch wiederholte Messungen mit identischen Lösungen durchgeführt. Die minimale Verminderung Steuereinrichtung eine Messung am Anfang und einer am Ende des Experiments unter Verwendung der gleichen Lösung.

Wir empfehlen, den heruntergekommenen Steuerung unter Bedingungen, bei denen Sie erwarten, dass die höchsten Gipfel Amplitude im Experiment zu tun. Dies macht es einfacher, die Verminderung des Signals zu quantifizieren.

Das Signal heruntergekommenen durch einen Vergleich der Peak-Amplituden der beiden heruntergekommenen Kontrollen quantifiziert werden. Die resultierende prozentuale Wert kann verwendet werden, um die gemessenen Signale durch Annahme einer linearen Zeitabhängigkeit der heruntergekommenen korrigieren.

3.8 Artifact Kontrollen

Wenn möglich, versuchen, um Ihre Ergebnisse durch die Hemmung des Proteins von Interesse validieren nach dem Experiment. Verbleibende Signale sind wahrscheinlich Lösung Austausch Artefakte. Die Signale müssen dann für die gemessenen Artefakte korrigiert werden.

3.9 Nach dem Experiment

1. Waschen des Systems mit 20-30 ml reinem Wasser und 20-30 ml 30% Ethanol / Wasser. Die ethanolische Lösung vermeidet Bakterienwachstum, wenn das System nicht in Gebrauch ist.
2. Nach diesem Reinigungsvorgang, den Druck aus dem System und schalten Sie alle Geräte.
3. Entfernen Sie die Küvette aus dem Faraday-Käfig und es absteigen. Alle Teile der Küvette mit Wasser und reinem Ethanol gereinigt werden, falls notwendig, mit einem Ultraschallbad.
4. Platzieren Sie den Sensor-Chip in einem Glas Becherglas mit reinem Ethanol. Beschallen das Becherglas für etwa 1 bis 2 min mit einem Ultraschallbad.
5. Trocknen Sie den Sensor-Chip unter Stickstoffgas.
6. Bewahren Sie den Sensor-Chip weg vom Licht in einem 10 mM Octadecanthiol ethanolischer Lösung. Nach einer Inkubationszeit von etwa 30 min der Sensorchip ist bereit für die Wiederverwendung.

Ergebnisse

Bis jetzt wurde SSM-basierte Elektrophysiologie verwendet, um mehr als 20 Transporter, meist von prokaryotischen Ursprungs, z. B. MelB ^{3, 4} und NhaA PutP ⁵ (zusammengefasst in ⁶⁾ zu charakterisieren. Aber auch eukaryotischen Transporter aus intrazellulären Membranen, z. B. ClC7 ⁷ sowie Ionenkanäle, wie zB die Nikotinsäure ^{Acetylcholin-Rezeptor-8} untersucht wurden.

Hier präsentieren wir als Beispiel Messungen der Zucker / H + cotransporter LacY von Escherichia coli mit Proteoliposomen mit mindestens 85% auf rechts orientierte LacY an einem LPR von 5 ^{9, 10.} Wir konzentrieren uns auf die wichtigsten Schritte, die zu einem minimalen kinetischen Modells dieses Transportprotein.

1. Elektrophysiologische Charakterisierung von Wildtyp LacY

Der erste Schritt ist eine allgemeine Charakterisierung der elektrogenen Reaktion durch Messen der verschiedenen pH-Werten ( > Abbildung 4), Substrat-Konzentrationen (Abbildung 5) und Substraten. Um die Technik zu validieren, wurden K _M und pK-Werte in der Literatur gegeben reproduziert.

Die pH-Abhängigkeit der LacY zeigt zwei verschiedene elektrogenen Reaktionen. Die kapazitiv gekoppelte Strom steigt zwischen pH 5 und pH 8,5, sondern auch ihre Form ändert. Unter alkalischen Bedingungen steady state Transport beobachtet wird, während für sauren pH-Werten nur eine schnelle Reaktion elektrogenen bleibt. Um die Steady-State-Signale von den Reaktionen, die wir schnell elektrogenen verwendet Schaltung Analyse Transporter Ströme (Abbildung 6) rekonstruieren zu unterscheiden.

Bei pH 7 ist der einphasige Signal wird zweiphasigen. Dies zeigt auch, dass es zwei verschiedene elektrogene Reaktionen. Geschätzte aus der übertragenen Ladung (Integral der Signale), die beiden Reaktionen etwa 6% und 94% des gesamten electrogenicity des Transportzyklus.

ove_step "> 2. Zuordnung der elektrogenen Reaktionen

Um die beiden elektrogenen Reaktionen auf bestimmte Schritte in der Reaktion Zyklus LacY zuzuweisen, wurde die Variante E325A LacY gemessen (Abbildung 7). Diese Variante zeigt nur Lactose Austausch, sondern ist mangelhaft für alle aktiven Verkehrsträger aufgrund der Hemmung der Protonen-Release. Das Signal des E325A LacY stellt eine schnelle transiente und ist konstant für alle gemessenen pH-Werten. Die Form und die Amplitude des Signals ist ähnlich dem Signal des Wildtyp LacY unter sauren Bedingungen. Darüber hinaus beobachten wir eine kleine negative Phase nach der rückläufigen Spitzenstrom, die charakteristisch für die schnelle transiente Ströme in kapazitiv gekoppelten Systemen gemessen wird. Da Laktose Bindung und Freisetzung ist nicht elektrogenen, muss die schnelle transiente mit einem elektrogenen Konformationsübergang nach Laktose Bindung korrelieren.

Es ist bekannt, dass das Proton Release Schrittgeschwindigkeit limiti istng für LacY Umsatz in der Lactose Konzentrationsgradienten angetriebene Verkehrsmittel. In diesem Fall erwarten wir eine Erhöhung der Transportgeschwindigkeit mit alkalischer pH-Wert, weil Protonenabgabe begünstigt wird. Dies ist der Fall für den stationären Transport korreliert Signal von Wildtyp LacY. Darüber hinaus könnte es durch pH-Gradienten Messung gezeigt werden, dass nur der innere pH-Wert des stationären Transport LacY (unveröffentlicht) beeinflusst. Daher die große elektrogenen Reaktion könnte zur Protonenabgabe Schritt zugeordnet werden.

3. Messungen für die kinetische Analyse

Nach Identifizierung der elektrogenen Reaktionen und Ausschalten Frachten wurden unter Verwendung eines SSM-Setup mit einer hohen zeitlichen Auflösung von etwa 4,5 ms. Dies ist nur unter Bedingungen möglich, wenn eine Reaktion dominiert das Signal. In diesem Fall sind die Geschwindigkeitskonstanten aus den transienten Strömen unter Berücksichtigung der zeitlichen Auflösung der Signale mit Hilfe eines iterativen Least-Squares-de abgeleitet werden Faltungsalgorithmus (Abbildung 8). Die ermittelten Geschwindigkeitskonstanten sowie die vorgeschlagene minimale kinetische Modell (Abbildung 9) wurden schließlich für die Simulation der Kinetik Transporter verwendet. Die simulierten Kurven geben die Daten, die zusätzlich SSM beweist die kinetischen Modells.

Abbildung 1. Adsorption Geometrie Proteoliposomen auf der SSM. Die SSM auf einem Sensorchip, eine strukturierte Gold beschichteten Objektträger ausgebildet ist. Um elektrogene Reaktionen von Membranproteinen zu messen, werden Proteoliposomen oder Membranfragmente an die SSM adsorbiert. Die beiden Membranen bilden ein kapazitiv gekoppeltes System. Deshalb ist nur transienten Strömen erfasst werden.

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Abbildung 2. Die SSM Küvette trägt den Sensorchip und die Referenzelektrode. Der Sensorchip zwischen dem Gefäßboden und dem Kopf Küvette eingeklemmt. Die Referenzelektrode ist der Strömungsweg von einem Polyacrylamidgel Salzbrücke isoliert.

Abbildung 3. Fluidbahn und Stromkreis des SSM-Setup. In der einzigen Lösung Exchange-Protokoll nur eine nicht-aktivierenden (NA) und eine aktivierende (A)-Lösung erforderlich sind. Der Durchfluss wird durch zwei 2-Wege-Ventile (V1) und ein Anschluss-Ventil (V2) gesteuert wird. Die terminalen Ventil schaltet zwischen nicht-aktivierenden und aktivierenden Lösungen, Leiten einer der Lösungen in die Küvette und die andere Lösung zu einem Abfallbehälter (W). Der Sensor-Chip (SSM) an den Verstärker (I / U) verbunden ist, während die Bezugselektrode (AgCl) mit dem Funktionsgenerator (F) in der externen elektrischen Schaltung verbunden. Ein Computer (PC) und eine Interface-Box für Ventilbetrieb-und-Datenerfassungs verwendet.

Abbildung 4. Ausgleichsströme mit Wildtyp-LacY Proteoliposomen nach 100 mM Lactose Konzentrationssprünge bei unterschiedlichen pH-Werte gemessen. Die nicht-aktivierende Lösung enthielt 100 mM Glucose während der aktivierenden Lösung enthielt 100 mM Lactose. Alle Lösungen wurden in 100 mM Kaliumphosphatpuffer bei dem angegebenen pH-Wert mit 1 mM DTT hergestellt. Einzelheiten Messbedingungen in dieser und den folgenden Zahlen entnehmen Sie bitte ⁹ und ^10.

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Abbildung 5. Gemittelten normierten Peak-Ströme mit Wildtyp-LacY Proteoliposomen nach Lactosekonzentration Sprünge in verschiedenen Konzentrationen und pH-Werte gemessen. Die K _M-Werte aus den hyperbolischen fits erhalten.

Abbildung 6. Rekonstruktion der Transporter Ströme. Die transienten Ströme (A) verwendet, um die Transporter Ströme (B) zu rekonstruieren wurden mit Wildtyp-LacY Proteoliposomen nach 100 mM Lactosekonzentration springt bei pH 8,5 (blaue Kurve) und pH 5.2 (rote Kurve) gemessen. Bei pH 8,5 kontinuierlichen Umsatz wird beobachtet, während bei pH 5,2 eine schnelle elektrogenen Reaktion auftritt. Dies wird in dem rekonstruierten aktuellen (B) beobachtet.

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Abbildung 7. Transient Strom mit E325A LacY Proteoliposomen nach einer 100 mM Lactosekonzentration Sprung bei pH 5,2 gemessen. Dieser LacY Variante ist in der Protonenabgabe Schritt des Transports Zyklus gehemmt und somit Transport-defizienten. Die kleine negative Komponente beobachtet ist charakteristisch für schnelle transiente Ströme in kapazitiv gekoppelten Systemen gemessen und durch die Entlastung der Membran Kapazität nach einer schnellen elektrogene Reaktion verursacht. Die Zeitkonstante π0 wird durch die Kapazitäten und Leitwerte des Systems (1) bestimmt.

Abbildung 8. Ausgleichsströme mit Wildtyp-LacY Proteoliposomen gemessen after verschiedene Lactosekonzentration springt bei pH 5,2. Unter diesen Bedingungen keine stationären Transport beobachtet wird, sondern ein elektrogenen Konformationsübergangs Laktose bindend. Die gestrichelte Linie zeigt die Übertragungsfunktion, die die zeitliche Auflösung des Systems. Der Einschub zeigt die Bestimmung der ein-und ausschalten Geschwindigkeitskonstanten aus den beobachteten Geschwindigkeitskonstante kobs mit einer hyperbolischen Anpassung an die Daten. Die beobachtete Geschwindigkeitskonstante wurde aus den transienten Strömen mit einem iterativen Least-Squares-Dekonvolutionsalgorithmus ¹⁰ bestimmt.

Abbildung 9. Ein kinetisches Modell für die Reaktion Zyklus LacY. Elektrogenen Zwei Schritte könnten identifiziert und gekennzeichnet durch SSM-Messungen. Ein stark elektrogene Reaktion darstellt ~ 94% der Ladungsverschiebung in der ReaktionZyklus nur an neutralen und basischen pH-Werten beobachtet. Es könnte zum Proton Release Schritt (blauer Pfeil) zugeordnet werden. Ein schwach elektrogenen Schritt bei einem sauren pH-Wert beobachtet, wenn eine kontinuierliche Umsatz von Wildtyp-LacY gehemmt wird. Wir zugeordnet diese Reaktion zu einer elektrogenen Konformationsübergangs Lactose Bindung, die 6% der Ladungsverschiebung in der Reaktion Zyklus darstellt.

Diskussion

1. Vorteile der SSM-basierte Elektrophysiologie Vergleich zu konventionellen Methoden

SSM-basierte Elektrophysiologie hat sich als wertvolles Instrument der elektrophysiologischen Toolbox bewährt. Es ist besonders nützlich in Fällen, in denen Konvention Elektrophysiologie, nämlich Patch-Clamp-und Voltage-Clamp-Verfahren nicht angewendet werden kann: Abgesehen von einigen seltenen Ausnahmen bakterielle Transporter kann nicht untersucht mittels Voltage-Clamp-oder Patch-Clamp-Verfahren aufgrund der geringen Größe von Bakterien und da werden sie sind schwierig in Säugerzellen oder Oozyten auszudrücken. Aber auch physiologisch relevanten Säugetier-Transporter untersucht werden. In diesem Fall SSM-basierte Elektrophysiologie ist attraktiv für Transporter aus intrazellulären Membranen und für Screening-Anwendungen in der Wirkstoffforschung wegen seiner Robustheit und seinem Potenzial für die Automatisierung.

SSM-basedUsing konventionellen Elektrophysiologie, zeitaufgelöste Charakterisierung transporters ist eine Herausforderung. Da der Umsatz von Transportern ist gering ein "Riesen-Patch" oder eine "ganze Zelle 'Konfiguration erforderlich, die eine inhärent geringen Zeitauflösung in einer Lösung Austauschexperiment haben. Die Komplikation überwinden kann mit Substrat photolytische Freisetzung werden. Es sind jedoch nur eine begrenzte Anzahl von Substraten für diesen Ansatz geeignet. Hier ist die schnelle Lösung Austausch am SSM bietet die einmalige Gelegenheit, elektrophysiologische Untersuchungen mit hoher zeitlicher Auflösung mit beliebigen Substraten durchzuführen.

2. Einschränkungen und kritischen Schritte

Im Gegensatz zu den Patch-Clamp-und Spannungs-Clamp-Techniken, kann SSM-basierte Elektrophysiologie nicht verwendet, um eine mögliche anzuwenden. Transporter Charakterisierung ist daher beschränkt auf Modi, die nicht auf einer Membran Potenzial sehen verlassen transportieren.

Im Allgemeinen hat SSM-basierte Elektrophysiologie keine Einschränkungen hinsichtlich der Art des (elektrogenen) Transporter. Aber Spannung clVerstärker oder Patch-Clamp-Verfahren können haben Vorteile, wenn intrazelluläre Komponenten wie Proteine ​​für die Protein-Funktionalität erforderlich sind.

Einschränkungen können entstehen, wenn Lösung Austausch schafft große Artefakt Ströme. Dies geschieht, wenn das Substrat starke Wechselwirkung mit dem SSM wie in dem Fall von lipophilen Verbindungen. Artifact Steuerelemente können verwendet werden, um die gemessenen Signale zu korrigieren. Außerdem hohen Salz Hintergrund in allen Messen Puffer können verwendet werden, um die Artefakte zu reduzieren. Aber in den Fällen, in denen die Größe des Artefakts vergleichbar mit dem Signal-Protein ist, ist es fast unmöglich, die Protein-bezogenes Signal aus dem Artefakt zu isolieren. Glücklicherweise sind die hohen Artefakte in einer optimierten Lösung Austausch ungewöhnlich.

Es gibt ein paar Schritte, die entscheidend für die erfolgreiche Umsetzung eines SSM-basierte Elektrophysiologie Experiment sind. Die Herstellung der Proteinprobe ist der wichtigste Teil. Wenn Proteoliposomen verwendet werden, sicher sein, die reconstitution Prozess liefert eine saubere, reproduzierbare Probe einer ausreichenden LPR und der Transporter orientiert in der richtigen Weise. Die LPR kann durch Gefrierbruch Elektronenmikroskopie und Orientierung durch einen ELISA-Experiment überprüft werden, ob Antikörper vorhanden sind.

Verwenden Sie nur eine SSM die optimalen Parameter zeigt für Inkubation des Proteins Probe. Die Injektion des Proteins ist ein weiterer kritischer Schritt. Beschallung ist unerlässlich und Luftblasen sollten während der Injektion vermieden werden. Nach der Inkubation werden die Proben Messungen selbst kritisch, da Luftblasen das adsorbierte Protein Probe aus dem Sensor-Chip zu entfernen. Daher ist immer zu entfernen Luftblasen nach dem Wechsel Lösungen. Dennoch ein Signal heruntergekommenen auftreten können. Um eine mögliche Signal heruntergekommenen korrigieren, ist es wichtig, heruntergekommenen Kontrollen während des Experiments zu erreichen.

3. Specialized Systems

Die SSM-Setup kann nach seiner Anwendung geändert werden. Darüber thier sind völlig verschieden, hoch spezialisierte Setups zur Verfügung.

Es besteht die Möglichkeit, um Protein-Signale unter asymmetrischen Bedingungen, unter einem pH-Gradienten zB messen. Um asymmetrische Pufferzusammensetzungen innerhalb und außerhalb der Proteoliposomen einer dritten Lösung zu schaffen, die ruhenden Lösung, muss eingeführt werden und dies erfordert eine doppelte Austausch Konfiguration. Hier wird ein zusätzliches Drei-Wege-Ventil Umschalten zwischen nicht aktivierenden und ruhenden Lösungen erforderlich.

Um die zeitliche Auflösung des Systems entwickelten wir eine alternative Strömungsweg fehlt das Terminal Ventil, aber mit einer anderen Art der Küvette zu erhöhen. Hier ist der Übergang des Aktivierungs-und nicht-aktivierenden Lösung innerhalb der Küvette, 3 mm vor der SSM. Dieses Setup ist gut für die kinetische Analyse von schnellen Transportprozesse geeignet. Es konnte gezeigt werden, dass eine zeitliche Auflösung von nur 2 ms möglich ist.

Kommerzielle fully automatisierte Systeme sind mit dem Ziel einer deutlich höheren Durchsatz für Wirkstoff-Screening. Eine bewegliche Einheit sammelt Lösungen und spritzt diese auf die Sensorfläche in 96-Well-Platten in einer Standard-Mikrotiterplatten-Format.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Waterbath Sonicator	Bandelin	RK 52 H
Tip Sonicator	Hielscher Ultrasonics GmbH	UP50H
2-way valve	NResearch, West Caldwell, USA	NR225T011
Terminal valve	NResearch, West Caldwell, USA	NR225T031
Manometer	Greisinger electronics	GDH 14 AN
Faraday cage	Max Planck Institute of Biophysics
Cuvette	Max Planck Institute of Biophysics
100 ml solution containers	Kartell	1623
O-rings	Seal Science Inc.
Oscilloscope	Tektronix	TDS 1002
Reference electrode	Max Planck Institute of Biophysics
Function generator	Max Planck Institute of Biophysics
Tubings	SAINT-GOBAIN Performance Plastics	AAC00006
Sensor chip	Fraunhofer Institut für Schicht und Oberflächentechnik
Interface box	Max Planck Institute of Biophysics
Amplifier	Keithley	427
Manual cog	Vygon GmbH	876
USB analog-to-digital converter	National Instruments	6009
Regeants
1,2‑Diphytanoyl-sn-glycero-3-Phosphatidylcholine	Avanti Polar Lipids, Inc.	850356
Acrylamide/Bis-acrylamide	Sigma Aldrich	A3574
Ammonium persulfate	Sigma Aldrich	A3678
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G8270
Dithiothreitol	Sigma Aldrich	43819
Ethanol absolut	VWR AnalaR NORMAPUR	603-002-00-5
Natural E. coli lipids polar extract	Avanti Polar Lipids, Inc.	100600	for LacY reconstitution
n-Decane	Sigma Aldrich	D901
Octadecanethiol	Sigma Aldrich	O1858
Octadecylamine	Sigma Aldrich	74750
Potassium chloride	Merck	1049360500
Potassium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	P3786
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P9791
Tetramethylethylenediamine	BIO RAD	1610801
α-Lactose monohydrate	Sigma Aldrich	L8783