Licht Vorlieben Assay zur angeborenen und Circadian geregelten Photobehavior in Studie<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine Hell-Dunkel-Präferenz-Test für Drosophila Larve. Dieser Test liefert Informationen zur angeborenen und zirkadiane Regulierung von Licht Abtasten und Verarbeiten photobehavior.

Zusammenfassung

Licht wirkt als Signal an die Umwelt das Verhalten der Tiere auf verschiedenen Ebenen zu steuern. Die Drosophila Larven Nervensystem wird als einzigartiges Modell verwendet, um grundlegende Fragen auf, wie leicht Informationen verarbeitet und geteilt zwischen schnellen und zirkadiane Verhalten zu beantworten. Drosophila-Larven zeigen eine stereotype Vermeidungsverhalten, wenn sie dem Licht ausgesetzt. Um Licht abhängige Verhaltensweisen vergleichsweise einfachen Licht-Dunkel-Präferenz Tests angewendet werden können, zu untersuchen. Bei Wirbeltieren und Arthropoden die Nervenbahnen in der Sensorik und der Verarbeitung visueller Vorleistungen teilweise überschneiden sich mit denen Verarbeitung photic zirkadianen Informationen. Die faszinierende Frage, wie das Licht Sensing-System und der circadianen Systems interagieren zu halten Verhaltensstörungen Ausgänge koordiniert bleibt weitgehend unerforscht. Drosophila ist ein biologisches Modell auswirken, diese Fragen zu nähern, wegen einer kleinen Anzahl von Neuronen im Gehirn und die Verfügbarkeit von genetischen Werkzeuge für neuronale manipulation. Das vorgestellte Hell-Dunkel-Präferenz Assay ermöglicht die Untersuchung einer Reihe von visuellen Verhaltensweisen einschließlich circadianen Kontrolle phototaxis.

Einleitung

Hier beschreiben wir eine Verhaltens-Assay basiert auf der Larven Vorliebe für dunkle (oder Licht). Larven reagieren mit einem starken und stereotypes photonegative Antwort während Nahrungssuche Stufen (L1 bis L3 früh) ^1. Der Test wird das Ziel, die photophobic Verhalten der Larve bewerten und vergleicht das helle oder dunkle bevorzugt aus einer Gruppe von Larven sich frei in einer Petrischale mit Agar aufgetragen. Dieser Verhaltens-Assay bietet nicht nur Informationen über die Empfindlichkeit, Integration und zeitliche Plastizität des visuellen Systems, es weiterhin Hinweise, wie Lichtempfindlichkeit und seine Prozess wird durch den circadianen System gesteuert.

Die Drosophila Larven Auge (auch als Bowlig Orgel; BO), ist das wichtigste Organ für leichte Wahrnehmung. Jedes Auge von 12 Photorezeptoren (PR) zusammengesetzt ist, zum Ausdruck bringen acht PRs die grün-empfindlichen rhodopsin6 (rh6) und vier Fotorezeptoren Ausdruck der blau-empfindlichen rhodopsin5 (RH5) ^2,3. Neben Fotorezeptoren, also Klasse IV multidendritic Neuronen, die die Larven Körper Wand bedecken, sind identifiziert worden, um schädliche Lichtintensitäten ^4,5 reagieren. Es ist auch bekannt, dass der Schrittmacher Neuronen im zentralen Larven Gehirn liegt das lichtempfindliche Protein Cryptochrome (Cry), die als intrinsische Uhr blaues Licht Sensor wirkt im Gehirn ^6,7 auszudrücken. Interessanterweise photophobicity von Wildtyp-Tieren zeigt eine zirkadiane Komponente zu verschiedenen Zeitpunkten im Laufe des Tages und der Nacht, wenn die Prüfung mit diesem Test. Responses to Licht der Nahrungssuche L3 Larve zeigte stärkere photophobicity im Morgengrauen und in der Abenddämmerung unteren photophobicity wenn für Hell-Dunkel-Präferenz ⁷ getestet. Interessanterweise nur Rh5-PRS für leichte Vermeidung erforderlich, während Rh6-PRS entbehrlich sind. Sowohl Rh5-PRS und Rh6-PRS in Zurücksetzen des molekularen Uhr durch Licht ⁸ beteiligt. Der Schrei Weg muss mit den anderen lichtempfindlichen Wege koordiniert werden, um eine entsprechende Verhaltens-Ausgang in die orchestrierenLaufe des Tages. Acetylcholin in PRs spielt eine wesentliche Rolle in Licht Vermeidungsverhalten sowie Mitnahme der molekularen Uhr. Blocking Acetylcholin Neurotransmission von PRS circadianen Schrittmacher Neuronen reduziert die photophobic Antwort in der Hell-Dunkel-Präferenz-Test ^8. Unter Verwendung des gleichen Assay wurden zwei symmetrische Paare von Neuronen vor kurzem identifiziert, um das Licht Vorlieben des dritten Larvenstadium von Drosophila ⁹ wechseln. Diese beiden Paare von Neuronen während der späten Larvenstadien zu funktionieren, wenn die Tiere die Nahrung verlassen, um vermutlich finden einen geeigneten Ort Puparium-Bildung. Allerdings bleibt die Frage, wie die Sehbahn interagieren und steuern Larven visuelle Verhalten in einem zirkadianen Weise weitgehend unbeantwortet. Das Licht Vorlieben Assay ermöglicht Vergleiche zwischen circadianen Zeitpunkten fliegen Linien und circadianen Zustand unter verschiedenen Lichtverhältnissen Qualitäten. Der Test ist einfach und kostengünstig und vorbereitet hat sich als nützlich erwiesen zuvor in verschiedene Labors zu beschreiben und zu studieren Licht abgeleitet Verhalten in der Larve.

Protokoll

Ein. Larvenaufzucht

1. Halten Sie fliegen Stämmen oder genetische Kreuze in der Massenkultur bei 25 ° C auf Maismehl-Medium unter einer 12-Stunden-Licht-12-Stunden-Dunkel-Zyklus in eine Fliege Inkubator mit Licht und Timer ausgestattet.
2. Verdünnen backer Hefe in Wasser zu einer Flüssigkeit Paste (10 g Hefe Backer mit 3-4 ml destilliertem H ₂ O verdünnt) zu bilden. Fügen Sie einen kleinen Tropfen auf die Maismehl Lebensmittel und decken die Fläschchen. Lassen Sie für mindestens eine Stunde trocken erwachsenen Fliegen kleben an den Hefepaste. Putting einen kleinen Tropfen von Hefe in Wasser verdünnt auf der Oberfläche des Nahrungsmittels verbessern können Eiablage. Alternativ Bäckerhefe Paste, 20% Essigsäure (AcOH) (Sigma Aldrich, Schweiz A6283-100ml) können verwendet werden. Dafür tauchen die Spitze eines Q-Tip auf die Lösung und die Ausbreitung auf der Oberfläche der Lebensmittel Maismehl.
3. Setzen erwachsenen Fliegen (mindestens vier Tage alt, aber nicht älter als 10 Tage) in Maismehl Lebensmittel Fläschchen. Legen Sie genügend Erwachsene in jedem Fläschchen, um genügend Larven erhalten den Vorzug wiederholenmehrmals testen und ermöglichen statistische Vergleich. Für genetische Kreuze, wir verwenden in der Regel ein Minimum von 20 Weibchen und Männchen 5-10 pro Fläschchen, aber einige Linien erfordern mehr Frauen, um eine ausreichende Larven Nachkommen zu erhalten.
4. Erlauben Erwachsenen Eier für 12 Stunden lag und sie auf neue Flaschen. Erwachsene können in der Früh und am Abend übertragen werden. Wir in der Regel übertragen Erwachsene für sieben bis zehn Tage und bei Bedarf nehmen neue Erwachsenen.
5. Halten Sie die Ei Sammlungen genommen alle 12 Stunden in den Inkubator und wachsen lassen die Larven bei 25 ° C, 12-Stunden-Licht-12-Stunden-Dunkel-Zyklus und 60% Luftfeuchtigkeit. Um zirkadianen Komponenten der visuellen Verhalten bewegen Larven ständigen Dunkelheit (DD) 48 Stunden nach der Ei-Sammlung (entsprechend zwei-Hell-Dunkel-Zyklen) zu testen. Verwenden Sie hierzu einen separaten Brutschrank ohne Licht aber halten alle anderen Bedingungen wie Temperatur und Luftfeuchtigkeit identisch. Achten Sie darauf, die Fläschchen der DD Inkubator übertragen kurz vor der Umstellung auf die dunkle Phase. Bevor die Fläschchen zu another Inkubator gestellt Fläschchen in einem Karton oder wickeln Sie die Fläschchen mit Aluminiumfolie Belichtung während der Übertragung (Verpackung im Karton oder in der Verpackung zu tun ist während der "lights-on-Phase" vor der Verschiebung zwischen Inkubatoren) zu verhindern. Verhindere, dass die Tiere vor der Belichtung nach diesem Zeitpunkt und bis Anfang Experimente.
6. Nach 4 Tagen (84-108 h von der Eiablage) sammeln früh L3 (Fütterung Larven) zu den Zeitpunkten getestet werden (siehe 4. Leichte Vorlieben Test, Punkt. 4.4.).

2. Test Setup

1. Führen Sie Experimente in einem dunklen Raum mit konstanter Temperatur und Luftfeuchtigkeit.
2. Um zwei Quadranten der Petrischale im Dunkeln zu halten, decken Sie den Deckel mit schwarzem Klebeband und Alufolie. Um dies zu tun, die Mittelpunkte des Deckels Umfang. Auch markieren vier Punkte an der Grenze des Deckels um 90 ° der Trennung zwischen ihnen. Um es einfacher, ziehen Sie eine 20 cm im Quadrat in vier Quadranten von 10 cm Länge auf ein geteiltesBlatt Papier oder mit Hilfe eines Computers. Cut 10 cm große Quadrate aus Aluminiumfolie und schwarzem Klebeband (Abbildung 1A). Abdeckung zwei gegenüberliegenden Quadranten durch Kleben ein Quadrat aus Aluminiumfolie, als erste Schicht und schwarzem Klebeband abgedeckt wird, vorsichtig sein, um auch auf den Rand des Deckels.
   In den vergangenen zwei leicht unterschiedliche Formen dieser Assays wurden verwendet. Wir hier die "Viertel-Platte"-Assay, in dem der Petrischale in vier gleiche Viertel ¹⁰ geteilt wird. Bei der Alternative "half-Platte"-Assay wird die Petrischale unterteilt Hälfte (Hälfte ans Licht, halb in der Dunkelheit ausgesetzt) ^​​1,7,8. Bis heute keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Tests wurde veröffentlicht.
3. Kleben Sie einen Quadranten Blatt wie die für die Kennzeichnung der Deckel direkt unter der Lichtquelle auf dem Tisch eingesetzt. Markieren Sie den Umfang einer Petrischale auf dem Quadranten Kreuzung zentriert. Verwenden Sie die Markierungen als Referenz, um den Test zu platzieren Platte immer in der gleichen Position unter der Lichtquelle.
4. Installieren Sie einLampe, entweder eine einfache weiße Glühlampe (Phillips, Softtone 5W) oder eine LED-Lampe (LED-Lampe, 80012 Weiß, Osram) oberhalb der Petrischale mit Hilfe eines eisernen Stativ (Fisher Scientific, S47808). Stellen Sie die Höhe in einer Weise, dass die gesamte Prüfung Platte homogen ausgeleuchtet wird. Wir empfehlen dringend die Verwendung von LED-Lampen, da sie mehr spezifischen Wellenlängen als herkömmliche Glühbirnen emittieren. Außerdem LEDs emittieren weniger Wärme.
5. Passen Sie die Lichtintensität mit Hilfe eines Photometers (Umwelt Meter PCE EM882). Um die erforderliche Lichtintensität von 350 bis 760 Lux erreichen, bewegen Sie die Lampe nach oben oder unten erforderlich. Stecken Sie die Lampe auf eine einstellbare Spannungsversorgung bietet mehr Flexibilität, um Intensitäten ohne Verschieben der Lampe (Abbildung 1B) ändern.

3. Platten Vorbereitung

1. Stellen Sie 200 ml von 2,5% Agar (Sigma-Aldrich, Schweiz A5093-500G) mit doppelt destilliertem Wasser (Millipore).
2. Zeigen Petrischalen auf einem Tisch (90 mm Durchmesser;Greiner Bio-One GmbH, bis 4550 Kremsmeinster, Österreich) in Reihen erlauben Gießen heißen Agarose.
3. Kochen Sie die Agarose in der Mikrowelle, bis die Lösung ist vollständig transparent und flüssig. Stellen Sie sicher, dass flüssige Lösung enthält keine Blasen. ACHTUNG: Transport sorgfältig auf den Tisch, da die Lösung kann sehr heiß sein!
4. Gießen Sie heißes Agarose in die Petrischalen, bis die gesamte Oberfläche ist homogen mit einer dünnen Schicht von der Lösung bedeckt sind etwa zwei bis drei Millimeter reichen. Seien Sie schnell an Agarose erstarrt vor der Beschichtung alle Platten zu verhindern. Lassen Sie die Platten abkühlen. Bewahren Platten bei Raumtemperatur und verwenden Sie sie am selben Tag der Vorbereitung.

4. Licht-Test Preference

1. Arbeiten unter Rotlicht Bedingungen im Experiment Raum Lichteinfluss zu verhindern, bevor der Test seit Drosophila ist nicht in der Lage, roten Wellenlängen des Lichts zu erfassen. Verwenden Sie eine rote Glühbirne (Phillips, PFE712E * 8) in einer Lampe angebracht t beleuchtener Ort, um zu arbeiten.
2. Pflegen Temperatur durch alle Experimente bei 25 ° C. Regeln der Raumtemperatur durch eine Heiz-oder Kühleinrichtung, falls erforderlich.
3. Nehmen Sie sich etwas Nahrung von den Fläschchen aufgezogen für Zwei-Tage-Zyklen unter konstanter Dunkelheit (aus dem Abschnitt 1). Da Larven Regel Graben an der Oberfläche des Lebensmittels zu der obersten Schicht (ca. 5 mm tief) mit Hilfe eines Spatels (Fisher Scientific, 14-373-25A). Verbreiten Sie das Essen auf der Außenseite einer Petrischale Deckel, etwas Wasser zugeben und vorsichtig mischen mit dem Spatel.
4. Sammle Fütterung L3 Larven aus der Nahrung. Als Licht bevorzugt getestet werden, die Wahl nur früh / Fütterung L3 Larven ist entscheidend, da die negative Phototaxis gewährleistet ist. Verspätete / wandernde Larven L3 oder große Larve kriecht auf das Essen vermutlich bereits eingeschaltet ihre photobehavior. Füttern L3-Larven (negative phototaktischen) erkannt, weil ihre vorderen Luftlöcher offen sind und ragte nach außen in einem Finger-ähnliche Form werden. Die hintere spiracles haben jeweils drei Öffnungen, und vier Gruppen von großen verzweigten Haaren. Die Speicheldrüsen erweitern, um dem zweiten Abdominalsegment ^11. Staging Larve unter dem Mikroskop ist bequem während kein weißes Licht verwendet werden. Ein rotes Licht Lampe ist notwendig, um die Larven zu beleuchten, wenn die Inszenierung unter Stereomikroskop vor Experimenten erforderlich.
5. Waschen Larven kurz in Leitungswasser und sammeln frühen Fütterung dritten Larvenstadium (noch in rotes Licht). Vor der Übertragung der Larven auf den Prüfstand Platte nehmen die Larven mit einem nassen Pinsel und sorgfältig absorbieren überschüssiges Wasser mit einem Papiertuch oder einem Filterpapier. Nicht trocken Larven zu übermäßig, da sie das Tier schaden könnte und sein Verhalten beeinflussen.
6. Mit dem nassen Pinsel sorgfältig übertragen die Larven zu den Platten. Legen Sie eine Gruppe von etwa 30 Larven in der Mitte der Platte. Die Platte mit der Deckel bereits mit den Quadranten vorbereitet und stellen Sie die Platte unter der Lichtquelle bereit für Experiment (siehe section 2).
7. Schalten Sie die Lampe des weißen Lichtes und den Timer zu starten. Lassen Sie sich die Larve frei bewegen auf der Platte für 5 min, dann schnell den Deckel abnehmen und die Anzahl der Larven in der Dunkelheit und im Licht Quadranten. Markieren Sie die Position der einzelnen Larve mit einem Marker erleichtern das Zählen. Alternativ nehmen Sie ein Bild von der Platte und zählen im Nachhinein. Larven, die eine leichte Präferenz unklar, wie Larven kriechen an den Wänden oder Wühlen in Agar sollte so neutral Vorlieben berücksichtigt werden und nur in der Gesamtzahl der Larven, wenn das Licht bevorzugt Index berechnet wird, einbezogen werden.
8. Nach dem Zählen, entsorgen Sie die Platte mit Larven und ersetzen mit einem neuen Test Platte für den nächsten Versuch. Sammeln Sie benutzten Teller in einem Autoklaven Plastiktüte für spätere Handhabung und Entsorgung.
9. Sobald Sie eine ausreichende Anzahl von Experimenten eine neue Genotyp getestet durchgeführt werden kann. 10-15 Versuchen pro Genotyp sind ausreichend für die Analyse.

5. Daten Analysis

1. Der Einfachheit halber die Daten an einem Datenblatt als Excel (Microsoft) oder Herkunft (Origin Lab) auf einem Computer zur weiteren statistischen Analyse. Vereinbaren Sie in einer Spalte die Anzahl der Tiere in der Dunkelheit, in einer zweiten Spalte die Anzahl der Tiere in Licht Quadranten und in der dritten die Gesamtzahl der Tiere in der Platte (einschließlich "neutral" Larven).
2. Berechnen Sie die Präferenz-Index (Pref) ein für die Dunkelheit für jedes Experiment unter Verwendung der folgenden Formel:
   PREF (Dunkelheit) = (Anzahl der Larven in dark - Anzahl der Larven in Licht) / Gesamtzahl der Larven
3. Vergleichen statistisch eine Reihe von Daten mit einer geeigneten Analyse für Gruppen. Hier verwenden wir ein Wilcoxon-Test statistisch zwei Gruppen zu vergleichen. Ein Test mit einer ANOVA Tukey multiple Vergleiche post hoc Test kann getan werden, wenn die normale Verteilung Annahme in einem Verteiler-Group-Vergleich erfüllt ist.
4. Machen Sie Diagramme, die deutlich zeigen Vergleiche zwischen den Linien und Punkte entlang der Zeit-Tage-Zyklus. We Verwendung Origin Software (Origin Lab) zu testen, statistische Signifikanz und generieren entsprechende Graphen, aber jede andere Statistik-Software kann hilfreich sein.

Ergebnisse

Nach dem oben beschriebenen Protokoll haben wir getestet, Hell-Dunkel-Präferenz in frühen dritten Larvenstadium Stadion von Wildtyp Canton-S fliegt bei zwei unterschiedlichen circadianen Zeiten CT0 und CT12. Erwachsene wurden 12-Stunden-Licht-12-Stunden Dunkelheit gehalten und nach links, um Eier für 12 Stunden lag. Larven wachsen die ersten beiden Tage unter dem gleichen Licht-Dunkel-Regimes. Da wir zirkadiane Modulation unter konstanten Bedingungen (Lauf der circadianen Uhr) testen wollte, wurden Larven dann konsta...

Diskussion

Das Licht bevorzugt beschriebenen Test nutzt die Larven angeborenen photobehavior. Der Test ist einfach zu schaffen, ermöglicht viele Wiederholungen bei niedrigen Kosten und liefert wertvolle Informationen über Licht sensing und Verarbeitung. Das experimentelle Paradigma ermöglicht relativ schnelle Quantifizierung, wie viele Menschen es vorziehen hell oder dunkel. Solche Vorlieben kann als Rohprodukt Prozentsätze oder alternativ als Preference Index (PREF) angezeigt werden. Die PREF wird als die Differenz von Tieren...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma-Aldrich	A5093-500G	2.5%; Sigma-Aldrich, 9471 Buchs, Switzerland
Petri dishes	Greiner Bio-One GmbH	633180	90-mm diameter; Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Austria
LEDs Lamp	OSARAM	80012 White	LED lamp, 80012 White
Environment Meter	PCE	PCE EM882	Lux, Temp, RH%
Thermostatic cabinet	Aqua Lytic (Liebherr)	ET636-6
Light timer	Timer T	6185.104	230V/50HZ (check specifications for your country)
Universal thermostat	Conrad	UT200
Humidifier	Boneco
Balck tape	Tesa		5 cm
Glue	Uhu
lncubator lamp	Phillips	Softtone	5W
Timer clock	Ziliss		Ziliss, Switzerland
Excel Software	Microsoft		Excel
Origin Software 8.5	OriginLab
Backer Yeast	Migros Switzerland
Iron support stand 17X28CM	Fisher Scientific	S47808
Acetic acid	Sigma Aldrich	A6283-100ML	20% acetic acid dilluted in H2O
Red light lamp	Phillips	PFE712E*8C
Spatula	Fisher Scientific	14-373-25A
Power supply	EA	EA PS 2042-06B	Optional
Aluminium foil	Prix Coop
Heater	GOON	NSB200C
Microwave Oven	Intertronic
Standard corn meal fly food
Destilled water