Gefügig Mammalian Cell Infektionen mit Protozoen-grundiert Bakterien

Zusammenfassung

Diese Technik stellt ein Verfahren zu ernten, normalisieren und zu quantifizieren intrazellulären Wachstum bakterieller Pathogene, die in natürlichen Protozoon-Wirtszellen vorkultiviert vor Infektionen von Säugerzellen. Dieses Verfahren kann modifiziert werden, um eine große Vielzahl von Wirtszellen für das Priming Bühne sowie Zielzelltypen unterzubringen.

Zusammenfassung

Viele intrazelluläre bakterielle Krankheitserreger verwenden Süßwasser Protozoen als natürliches Reservoir für die Proliferation in der Umwelt. Legionella pneumophila, der Erreger der Legionärskrankheit Lungenentzündung, gewinnt eine pathogene Vorteil gegenüber in vitro kultivierten Bakterien beim ersten von Protozoen Zellen geerntet vor der Infektion von Säugetieren Makrophagen. Dies deutet darauf hin, dass wichtige Virulenzfaktoren möglicherweise nicht richtig in vitro exprimiert werden. Wir haben eine tractable System zur Grundierung L. entwickelt pneumophila durch seine natürliche Protozoen Host Acanthamoeba castellanii vor Säugetierzellen Infektion. Der Beitrag eines Virulenzfaktor durch Vergleichen intrazellulären Wachstum eines Mutantenstammes zu Wildtyp-Bakterien nach Protozoen Priming untersucht werden. GFP-exprimierenden Wildtyp und Mutante L. pneumophila-Stämme verwendet werden, um Protozoen Monoschichten in einem Priming-Schritt infizieren und dürfen späten Stadien der intrazellulären Wachstum zu erreichen. Fluoreszierende Bakterien werden dann aus diesen infizierten Zellen geerntet und normiert durch Spektrophotometrie um vergleichbare Anzahl von Bakterien für eine nachfolgende Infektion in Säugern Makrophagen erzeugen. Zur Quantifizierung werden lebenden Bakterien nach der Infektion überwacht mittels Fluoreszenzmikroskopie, Durchflusszytometrie, durch Kolonie und Plattieren. Diese Technik hebt und stützt sich auf den Beitrag der Wirtszelle-abhängige Genexpression durch Nachahmung der Umgebung, die in einem natürlichen Erwerb Weg begegnet wäre. Dieser Ansatz kann modifiziert werden, um jegliche Bakterium, das einen Vermittler Host verwendet als Mittel zur Gewinnung eines pathogenen Vorteil unterzubringen.

Einleitung

Zahlreiche bakterielle Krankheitserreger allgemeine Strategien zur Wirtszellen für das Überleben und Replikation in einem intrazellulären Kompartiment nutzen angepasst. In vielen Fällen sind pathogenen Mechanismen ähnlich zwischen Protozoen und Metazoen Zellen. Jedoch sind diese beiden Mikroumgebungen sehr verschieden sein und in unterschiedliche Expression von Virulenzfaktoren ^1-4 führen. Die Legionärskrankheit Bakterium Legionella pneumophila ist ubiquitär mit Süßwasser-Umgebungen weltweit ⁵ verbunden. Wichtig ist, dass L. pneumophila in Protozoen Zellen vor der Infektion von menschlichen Monozyten gewinnen eine pathogene Vorteil kultiviert, was darauf hindeutet, dass globale Genexpressionsprofile des Bakteriums Verlassen eines Protozoen-Zelle unterschiedlich sind als die der in vitro kultivierten Organismus ^6-8. In der Natur, bieten Süßwasser Amöben nährstoffreichen Grenzen für eine schnelle Verstärkung eines eindringenden Bakteriums. Menschliche Akquisition von L. pneumophila wird häufig die Inhalation von kontaminiertem Wasser Tröpfchen, die das Bakterium enthalten, zurückzuführen. Es ist wahrscheinlich, dass diese Tröpfchen Hafen Protozoen Zell-assoziierten Bakterien, wo Protozoen Zellen sind resistent gegen herkömmliche Wasseraufbereitung Praktiken ^9,10. Infektion der Lunge Alveolarmakrophagen verläuft in einer Weise nahezu identisch mit dem intrazellulären Lebenszyklus des Bakteriums in Protozoon-Wirtszellen ^11-13.

Um zu überleben und zu replizieren in eukaryotischen Zellen, L. pneumophila verwendet eine spezielle Art IVb Sekretionssystem bezeichnet Dot / Icm auf fast 300 "Effektor"-Proteine ​​in das Zytosol der Wirtszelle ^14-16 liefern. Diese Effektorproteine ​​kollektiv funktionieren, um zelluläre Prozesse zu unterlaufen, um eine Replikation permissiv Abteil für das Bakterium ^17,18 erzeugen. Deletionen in einem der 26 Gene, die die Dot / Icm Transporters defekt Ergebnis in Stämmen für intrazelluläre mult umfasseniplication ^19-23. Historisch Löschen einzelner Effektor-Gene kodieren selten führte Stämme gedämpft für die intrazelluläre Wachstum. Dieses Phänomen hat mehrere Hypothesen, einschließlich redundanter Funktion und paraloge Kopien von Effektoren zugeschrieben.

Einige Virulenzfaktoren sind nur im Rahmen der Wirtszell-assoziierter intrazelluläre Wachstum ²⁴ exprimiert. Wir nahmen an, dass, wenn eine bestimmte Effektorzellen wurde nur im Kontext von Protozoen-Infektion exprimiert wird, dann der Beitrag des Effektors nicht durch einen Wildtypstamm, wenn sowohl in vitro kultiviert wurden verglichen werden. L. pneumophila Übergänge von einem replikativen zu einer transmissiven Phase, wie sie der stationären Phase in der Kultur ²⁵ eintritt. Die Phase Switching Phänotyp stellt die Nährstoffverarmung während der intrazellulären Wachstums gestoßen und wird durch die Montage von Flagellen für Motilität ²⁶ veranschaulicht. Da L. pneumophila ist invasive und virulent, wenn sie von Protozoen Zellen geerntet, haben wir versucht, einen Test, dass mehr treu die pathogenen Zustand des Bakteriums vertreten, wenn es Host-Makrophagen begegnet entwickeln.

Zu diesem Zweck haben wir ein vielseitiges Protozoen Priming-Assay, die jeden geeigneten Wirt für sowohl den ersten (Priming Zelle) und zweiten (Zielzelle) Stufe Infektionen unterbringen kann. Die Infektion Prozess ist lenkbar durch Verwendung von Bakterien stabil exprimieren grün fluoreszierendes Protein (GFP). Die Infektion Modell für die Protozoen Acanthamoeba castellanii folgt eine Methode weit verbreitet im Bereich ²⁷ verwendet. Für die Grundierung Schritt, L. pneumophila-Stämme werden in vitro bis zur stationären Phase in flüssigen Medien kultiviert, um als 'durchlässigen' Bakterien (1A) zu erzeugen. Bakterien nächsten zur Monolagen A. infizieren castellanii 18 Stunden zur Erzielung einer späten Stufe des intrazellulären Lebenszyklus. Große Vakuolenten Bakterien können zu diesem Zeitpunkt mittels Fluoreszenz-Mikroskopie (Abbildung 1A) visualisiert werden. Protozoischen Zellen werden dann lysiert und Bakterien aus dem Lysat gewonnen werden für die Emission bei 512 nm unter Verwendung eines Fluoreszenz-Plattenlesegerät gemessen. Fluoreszenz wird mit optischen Dichte korreliert Multiplizität-of-Infektion (MOI) für die Infektion von Zielzellen (Abb. 1, * Korrelation Kurve) zu berechnen. Nach Invasion (T ₀₎ und 18 Stunden nach der Invasion (T _18), werden die Zielzellen für Fluoreszenz quantifiziert darstellt intrazellulären Bakterien. Fluoreszenz kann durch Mikroskopie und Durchflusszytometrie überwacht werden, und kann durch Keimzahlen Kolonie Plattieren gemessen werden. Die Grundierzusammensetzung Assay wird immer durch Infektionen mit Wildtyp L. begleitet pneumophila und ein Stamm einen Defekt im Dot / Icm Typ IV-Sekretionssystem (Δ dota) (Abbildung 1A). Dies wichtiger bietet interne Kontrollen für direkte Vergleiche zwischen Wildtyp-and keine isogenen Mutanten bei der Infektion verwendet. Die Einbeziehung des avirulenten Stamm Δ DOTA während des Priming Stufe einen Schwellenwert für die Beobachtung eines abgeschwächten Wachstums Phänotypen mit isogenen Mutantenstämmen, die in vitro kultiviert werden, zugeordnet ist.

Protokoll

Ein. Vorbereitung der Legionella pneumophila Kulturen für Priming Stufe Infektionen

1. Verwandeln Sie alle L. pneumophila-Stämme in dem Assay mit dem Plasmid pAM239 verwendet, die für ein Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) induzierbaren grün fluoreszierendes Protein (GFP) ^28. Streak die Bakterienstämme auf Eisen und Cystein N-(2-Acetamido)-2-Aminoethansulfonsäure (ACES) ergänzt gepufferten Aktivkohle Hefeextrakt-Agar (CYEA) mit 6,25 g / ml Chloramphenicol (CM) (für Plasmid-Wartung) und inkubieren für 72 Stunden bei 37 ° C.
2. Übertragen ein Inokulum des Bakterienstammes in ergänzt ACES gepufferten Hefeextrakt-Brühe (AYE) mit 6,25 pg / ml CM und 1 mM IPTG und kultivieren bis zur stationären Phase (O / N) auf einem Schüttler bei 37 ° C
3. Bestätigen GFP-Expression in den in vitro-Kulturen unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie. Übertragen 10 ul der Kultur auf einen Objektträger unter einer AbdeckungRutsch-und Bild mit einem 60X-Objektiv mit GFP Anregung / Emission cube (AMG EVOS fl).
4. Verdünnen Sie eine 100 ul-Aliquot jeder in-vitro-Kultur bis 1:10 mit sterilem H ₂ O. Stellen Sie eine leere mit 100 ul AYE Medien mit 1 mM IPTG und 6,25 pg / ml cm und Wasser. Nehmen OD600 Messungen der Verdünnungen mit einem Spektralphotometer (Bio-Rad Smart-Spec Plus). Berechnen des Volumens erforderlich, eine gut bei einer MOI = 20 infizieren für jede in vitro-Kultur: V = [(Amöben seeded) x MOI] / [OD ₆₀₀ x (Verdünnungsfaktor) x (konstant)] = [(1 x 10 ⁶ ) x (20)] / [OD ₆₀₀ x (10) x (1 x 10 ^6)] = 2/OD _600. Bakterienkonzentration als OD ₆₀₀ = 1,0 ermittelt = 1 x 10 ⁹ CFU / ml.

2. Priming Stufe Infektion mit Acanthamoeba castellanii

1. Pflegen und pflegen die Amöben in ATCC 712 PYG Medium in 175 cm ^2-Kolben bei RT.
2. Ersetzen Medien in Amöben culturen 24 Stunden vor Beginn der bakteriellen flüssigen Kulturen. Am gleichen Tag flüssigen Bakterienkulturen gestartet werden, zu sammeln und zu zählen Zellen auf einem Lichtmikroskop unter Verwendung eines Hämozytometers.
3. Verdünnt das Amöben mit frischem Medium auf eine Endkonzentration von 1 × 10 ⁶ Zellen / ml. Seed 12-Well-Zellkultur-Platten mit 1 ml Aliquots der Amöben mit einem Repetierpipette und inkubieren bei RT O / N.
4. Nach der Inkubation die Wells der 12-Well-Zellkultur-Platten 3x mit 1 ml steriler PBS mit einem 10 ml serologische Pipette und eine manuelle Pipette Hilfe.
5. Nach dem Absaugen des PBS, 1ml der Infektion Medien (ATCC 712 PYG media minus Glukose, Pepton und Hefeextrakt) mit 1 mM IPTG und 6,25 pg / ml cm in jede Vertiefung. Die Inkubation bei RT für 1 Stunde.
6. Infect Vertiefungen bei einer MOI = 20. Zentrifuge die Platte bei 400 xg für 5 min (Eppendorf 5810R) und schwimmen in einem 37 ° C Wasserbad für 5 min. Übertragen der Platte an einem 37 ° C, 5% CO ₂ Inkubator für 18 Stunden.
7. Bestätigen Sie die Infektionen mit Live Cell Imaging auf einem Fluoreszenzmikroskop vor Zelllyse und Ernte von Bakterien beherbergen.

3. Seeding THP-1-Zellen für Target-Zell-Stadium Infektion

1. (Beginn dieses Prozesses 24 Stunden vor dem Einrichten flüssigen Bakterienkulturen). Kultivieren THP-1-Zellen in einem 75 cm ^{2-Kulturflaschen} nahe-Konfluenz in RPMI 1640-Medium mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS).
2. Zählen der Zellen unter Verwendung einer Suspension Hämozytometer, verdünnt den THP-1-Zellen in RPMI 1640-Medium mit 10% FBS und 100 ng / ml Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) zu einer Konzentration von 1 x 10 ⁶ Zellen / ml und die Platte in 1 ml Aliquots auf 12-Well-Zellkultur-Platten. Die Inkubation erfolgt 48 Stunden bei 37 ° C, 5% CO _2.

4. Verarbeitung von Bakterien für Target-Zell-Stadium Infektion nach der Grundierung Bühne Infektion

1. Saugen Sie das Medium aus dem grundiert Amöben.
2. Lysieren die amoebae mit 500 ul eiskaltem, sterilen ultrafiltriertes (UF) H ₂ O und Inkubation bei RT für 10 min.
3. Pool Die Lysate nach Art belasten und nehmen eine E _{512 nm} Messung für jede der gepoolten Lysaten mit einem Fluoreszenz-Reader (Molecular Devices Spectramax Zwilling EM).
4. Berechnen Sie einen OD _600-Messung für den gepoolten Lysaten: calcOD ₆₀₀ = 0,0008 (E ₅₁₂ - Lysat Hintergrund) + 0,0019. Die Formel wurde zuvor durch die grafische Darstellung einen direkten Vergleich sowohl der OD ₆₀₀ und der E _{512 nm} Messungen von Verdünnungen von L. ermittelt pneumophila Wildtyp-GFP exprimieren von stationärer Phase in vitro-Kultur (1 *). Die Lysate der nichtinfizierten Amöben, unterliegen den gleichen experimentellen Bedingungen wie die infizierten Amöben, werden als Rohling verwendet und einen Korrekturwert (zB Lysat Hintergrund), die in die Gleichung eingearbeitet wurde. Das notwendige Volumen to infizieren auch bei einer MOI = 20 wird für jedes Lysat Pool berechnet: V = [(THP-1 seeded) x MOI] / [calcOD ₆₀₀ x (konstant)] = [(1 X 10 ⁶⁾ x (20)] / [calcOD ₆₀₀ x (1 x 10 ^6)] = _20/600 calcOD.
5. Waschen Sie die THP-1-Zellen 3x mit PBS und 1 ml frisches RPMI 1640 (10% FBS) in jede Vertiefung. Inkubieren THP-1-Zellen für 1 Stunde bei 37 ° C, 5% CO _2.
6. Infizieren die THP-1 Zellen bei der Verwendung der berechneten MOI gepoolt Lysaten. Zulassen, dass ein Satz von Vertiefungen bleiben uninfizierten, dient als negative Kontrolle für die durchflusszytometrische Analyse. Verarbeitung der Grundierung Stufe sollte in weniger als 30 Minuten abgeschlossen werden. Die Lysate werden auf Eis gehalten, um Veränderungen in bakterielle Genexpression vor der Infektion zu begrenzen.
7. Zentrifuge die Platte schweben um die Temperatur zu erhöhen, und inkubieren, wie in der Grundierung Bühne.
8. Eine Stunde nach der Infektion, entfernen Sie die Medien durch Aspiration und waschen Brunnen 3x mit PBS auf extrazelluläre Bakterien zu entfernen.
9. 1 ml fresh RPMI 1640 (10% FBS), in Vertiefungen und kehren die Platte in den Inkubator. Der Zeitpunkt unmittelbar nach Medienersatz dient als Zeitpunkt Null (T _0). Inkubieren der THP-1-Zellen für 14-16 Stunden bei 37 ° C, 5% CO _2.

5. Experimental Analysis

5.1 Live Cell Imaging

Bild die infizierten Brunnen mit einem Fluoreszenzmikroskop (AMG EVOS fl) bei 10X oder 20X Vergrößerung (1A-D). Die Bilder können entweder qualitativ oder quantitativ verglichen werden, um Niveaus einer Infektion sowohl in der Initialisierungszusammensetzung Stufe und Stufe Infektionen Zielzelle zu bestimmen.

5,2 Durchflusszytometrie

1. Die Emissions-Peaks verschiedener Infektionen können durch Durchflusszytometrie (BD FACS Calibur) verglichen werden. Trypsinieren die infizierten THP-1-Zellen und vorsichtig waschen sie aus den Vertiefungen durch Mischen in PBS mit einer Pipette.
2. Pool die Zellen von Stamm-Typ in 15 ml Falcon-Röhrchen und Pellet bei 1.800 xg für 2min in der Tischzentrifuge.
3. Suspend die Pellets in 1 ml PBS und Transfer zum 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
4. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 1.800 x g (Eppendorf 5424) und wieder aussetzen Pellets in 1 ml PBS. Wenn die resultierenden Suspensionen stark trüb werden (OD ₆₀₀ ≥ 1,0) sie müssen in zusätzlichen PBS (1:3) verdünnt werden, um ein Verstopfen der Leitungen in dem Durchflusszytometer verhindern.
5. Verwenden sterilfiltriert PBS für die Äquilibrierung des Durchflusszytometers und Waschschritte zwischen Probeninjektionen. Zur Erstellung der Vorwärts / Seitenstreuung von nicht infizierten Targetzellen vor der Injektion von Zielzelle Infektion Proben.
6. Sammle 20.000 insgesamt Veranstaltungen für jeden Zustand mit 488 nm Laser-Anregung und die FL1-Kanal.
7. Tor nach der Aufnahme Zellpopulationen auszuschließen infizierten Zellen und Grundstück Fluoreszenzintensität in einem Histogramm (FlowJo) (Abbildung 1E).

5,3 CFU plating

1. Untersuchen Sie die Effizienz of Infektion durch Plattieren CFU der Zellen für Durchflusszytometrie geerntet. Planen serielle Verdünnungen der Proben in ultrafiltriertes H ₂ O bei 10 ^-1, 10 ^-2 und 10 ^-3.
2. Platte 20 ul jeder Verdünnung auf 1/3 einer CYEA Platte mit 6,25 pg / ml CM.
3. Die Inkubation erfolgt bei 37 ° C für 72 Stunden.
4. Zählen Sie die Kolonien mit einem Zahnstocher und Zell-Zähler.

Ergebnisse

Ein typisches Ergebnis für die gesamte Infektion ist in Abbildung 1 dargestellt. Live-cell Fluoreszenzaufnahmen Darstellung Monolagen A.castellanii mit Wildtyp L. infiziert pneumophila während des Priming Stufe wird in 1A gezeigt. Eine erfolgreiche Maßnahme des Priming-Schritt würde zu einer Bevölkerung von etwa 90% der Wirtszellen mit großen Vakuolen mit GFP markierten Bakterien an dieser MOI besiedelten führen. Bei 18 Stunden nach der Infektion, die m...

Diskussion

Bakterielle Genexpression dicht durch eine Kombination von Lebenszyklus Progression und ansprechend auf Signale in der umgebenden Mikroumgebung gesteuert. Vacuolar Krankheitserreger wie L. pneumophila zu einer Vielzahl von Host-Zellen abgeleiteten Signale reagiert, wenn in einem Phagosom kompartimentiert. Als Ergebnis der kollektiven Erschöpfung Nährstoff in der Wirtszelle, kompensiert das Bakterium durch Expression für erfolgreiche Verbreitung erforderlich zu einer nachfolgenden ²⁵ Wirtszelle.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
chloramphenicol	Fisher Scientific	BP904-100	antibiotic
IPTG	Fisher Scientific	BP1755-10
ACES	Sigma	A9758-1KG	media component
ATCC medium: 712 PYG	ATCC		growth media for protozoans
1X PBS	Fisher Scientific	SH30256FS	phosphate buffered saline
activated charcoal	Fisher Scientific	C272-212	media component
yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500	media component
peptone	BD Diagnostics	211677	media component
agar	Fisher Scientific	BP1423-2	media component
L-cysteine, 99%+	Acros organics	173601000	media supplement
Ferric nitrate nonahydrate	Fisher Scientific	I110-100	media supplement
Equipment
EVOS fl	AMG	EVOS fl	fluorescence microscope
Smart Spec Plus	Bio-Rad	170-2525	spectrophotometer
5810 R centrifuge	Eppendorf	22627023	bench top centrifuge
Repeater plus	Eppendorf	22230201	repeating pipette
SpectraMax Gemini EM	Molecular Devices		microplate reader
Softmax Pro 5.3	Molecular Devices	0200-310	microplate reader software
5424 microfuge	Eppendorf	22620401	table top microcentrifuge
Fast-release pipette pump II	Scienceware	379111010	pipette aid
FACS Calibur	BD Bioscience		flow cytometer
FlowJo 7.6.1	FlowJo	license	flow cytometery software
15 ml tube	BD Falcon	352096	polypropylene conical tube
1.6 ml microfuge tube	Neptune	3745.X	microcentrifuge tubes