Korrelative Mikroskopie für 3D-Strukturanalyse von dynamischen Wechselwirkungen

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine korrelative Mikroskopie-Methode, die High-Speed-3D-Live-cell Fluoreszenzlichtmikroskopie und hochauflösenden Kryo-Elektronen-Tomographie vereint. Wir demonstrieren die Fähigkeit des korrelativen Verfahren durch Abbilden dynamisch kleine HIV-1-Partikeln Interaktion mit dem Host-HeLa-Zellen.

Zusammenfassung

Cryo-Elektronen-Tomographie (cryoET) ermöglicht 3D-Visualisierung von zellulären Strukturen auf molekularer Auflösung in einem close-to-physiologischen Zustand ^1. Allerdings ist die direkte Visualisierung einzelner viraler Komplexe in ihrem Wirt zellulären Umgebung mit cryoET herausfordernd ^2, aufgrund der seltenen und dynamischen Charakter der das Eindringen des Virus, insbesondere im Fall von HIV-1. Während Zeitraffer-Live-Cell-Imaging eine große Menge an Informationen über viele Aspekte des Lebenszyklus von ^HIV-Januar 03-07 geführt hat, die Auflösung durch Live-Cell-Mikroskopie geleistet wird, ist begrenzt (~ 200 nm). Unsere Arbeit wurde bei der Entwicklung einer Methode, die Korrelation direkte Visualisierung der frühen Ereignisse des HIV-1-Infektion ermöglicht durch die Kombination von lebenden Zellen Fluoreszenzlichtmikroskopie, Kryo-Fluoreszenzmikroskopie und cryoET abzielen. Auf diese Weise kann in lebenden Zellen und Kryo-fluoreszierenden Signale zur genauen Führung der Probenahme in cryoET werden. Darüber hinaus strukturelle Informationen aus cryoET kann b erhaltene mit den dynamischen funktionellen Daten ergänzt gewonnen durch Live-Cell-Imaging von fluoreszierenden markierten Ziel.

In diesem Video-Artikel, bieten wir detaillierte Methoden und Protokolle zur strukturellen Untersuchung von HIV-1-und Host-Zell-Interaktionen mit 3D Korrelat High-Speed ​​Live-Cell-Imaging und hochauflösende cryoET Strukturanalyse. HeLa Zellen, die mit HIV-1-Partikeln infiziert wurden zuerst durch konfokale Mikroskopie lebenden Zellen dadurch, und die Region, die den gleichen viralen Partikel wurde dann durch Kryo-Elektronen-Tomographie zur 3D-Struktur-Details analysiert. Die Korrelation zwischen zwei Sätzen von Bilddaten, optische Bildgebung und Elektronenabbildungseinrichtung, wurde unter Verwendung eines selbst zusammengestellten Kryo-Fluoreszenz-Lichtmikroskopie Stufe. Der Ansatz detailliert hier wertvoll sein wird, nicht nur für die Untersuchung von Virus-Wirt-Zell-Wechselwirkungen, sondern auch für breitere Anwendungen in der Zellbiologie, wie z. B. Zell-Signal-, Membran-Rezeptor-, und viele andere dynamische zelluläre Prozesse. </ P>

Einleitung

Cryo-Elektronen-Tomographie (cryoET) ist ein leistungsfähiges bildgebendes Verfahren, das drei-dimensionale (3D) Visualisierung von Zellen und Geweben ermöglicht und Einblicke in die Organisation von nativen Organellen und zellulären Strukturen auf molekularer Auflösung in einem nahe-zu physiologischen Zustand ^1. Allerdings macht die inhärent niedrigen Kontrast von ungefärbten tiefgefrorenen Probe mit ihrer Strahlung Empfindlichkeit kombiniert, ist es schwierig, Bereiche von Interesse in einer Zelle zu lokalisieren und anschließend die Durchführung der Kippserie erfolgreich ohne Beschädigung des Zielbereichs. Um diese Probleme zu überwinden, ist ein Ansatz, der korrelative Licht-und Elektronenmikroskopie kombiniert notwendig. Spezifische Eigenschaften von Fluoreszenz-Markierung hervorgehoben werden identifiziert und lokalisiert durch Fluoreszenz Lichtmikroskopie und dann ihre Koordinaten auf dem Elektronenmikroskop für den Erwerb von hochauflösenden 3D-Strukturdaten übertragen. Diese Methode hilft Korrelat Ortung des Ziels einreas von Interesse angesprochen werden. Durch die Begrenzung auf Probe Dicke mit Kryo-EM (<300 nm), die derzeit nur die peripheren Regionen der Zelle sind geeignet für 3D-Strukturanalyse durch CryoET. Weitere Verringerung der Dicke der tiefgefrorenen Proben durch Glaskörper Schneiden ⁸ oder durch Kryo-Focused Ion Beam (FIB)-Fräsen ⁹ erweitern würde die Fähigkeit der korrelativen Bildgebung.

Bisher wurden korrelative Methoden in erster Linie verwendet, um cryoET Datenerfassung für große und statischen Strukturen ^10-13 erleichtern. In diesen Studien wurden Kryo-Stufen realisiert, um Kryo-EM-Gittern zu akzeptieren und passen entweder auf einem aufrechten Mikroskop oder einem inversen Mikroskop ^10,11,14. Obwohl Umschalten Gitter scheint recht einfach in ihre Konstruktionen gibt es weitere Schritte zur Übertragung des EM Netz beteiligt sind, die Chance zu erhöhen, dass das Gitter verformt werden, beschädigt und verunreinigt. Wir haben vor kurzem gezeigt, einen technischen Fortschritt inkorrelative Mikroskopie, die uns direkt sichtbar dynamische Ereignisse, die von Natur aus schwer zu erfassen, wie z. B. HIV-1-und Host-Zell-Interaktionen in frühen Stadien der Infektion ¹⁵ erlaubt. Wir erreichten dies durch die Entwicklung und Implementierung eines Kryo-Lichtmikroskopie Probe Bühne, die eine Cartridge-System, um die Probe Schäden durch Gitter Handhabung minimieren passt, und erleichtert so Korrelation. Unser Design verfügt über einen integrierten Probe Kartuschenhalters, so dass sowohl Kryo-Licht und Kryo-Elektronenmikroskopie durchgeführt, werden nacheinander auf der gleichen Probenhalter, ohne Probe zu übertragen, damit die Straffung des korrelativen Verfahren. Darüber hinaus haben wir auch eine genaue und zuverlässige Korrelation Verfahren unter Verwendung von fluoreszierenden Latex-Kügelchen als Bezugsmarker.

Protokoll

1. HeLa Zellkultur auf Kohlenstoff-beschichteten Gold EM Finder Grids

1. Glimmentladung die Kohlenstoff-Seite eines 200-mesh R2 / 2 Quantifoil Gold EM finder Gitter unter 25 mA für 25 sek.
2. Bestreichen Sie die EM-Raster mit Fibronektin, von schwimmenden es, Kohlenstoff-Seite nach unten auf ein 40 ul Tröpfchen von 50 ug / ml Fibronektin-Lösung, dann desinfizieren sie unter UV-Licht für 2 Stunden in einer Gewebekultur Kapuze.
3. Teller HeLa-Zellen auf das Gitter in einer Dichte von 2 x 10 ⁴ Zellen / ml (insgesamt 2 ml Kultur) in einem Glas-bottom Kulturschale wachsen und die Zellen bei 37 ° C mit 5% CO _2, in DMEM mit 4,5 ergänzt g / L L-Glutamin und Glukose, 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum, 100 Einheiten / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin, für ungefähr 18 Stunden. HeLa-Zellen werden nach der O / N-Kultur infiziert.

2. HIV-1-Infektion und Live-Cell-Imaging

1. In einer fluoreszierenden Zelle tracker (Red CMTPX, 1 ul / 2 ml) in den Glasboden-KulturSchale (aus Stufe 1.3) und Inkubation die Schale bei 37 ° C für 10 min, damit der Fluoreszenzfarbstoff up-nehmen.
2. Waschen Sie die Zellen mit PBS und 50 ul vorgewärmte frisches Medium.
3. Die Schale auf den Live-Cell Kammer bei 37 ° C, einer Wischfeld Konfokalscanner Mikroskop. Wählen Sie mehrere Felder (10-15 Positionen), die 1-3 Zellen / square enthalten, die mit den Zellen zwischen zwei Phasen der Mitose, wenn sie am meisten ausgebreiteten und flach (siehe Abbildungen 2c und 2d), da sind Kryo-EM erfordert relativ dünnen Bereiche der Probe. Bewahren Sie diese Positionen für zukünftige Bildgebung (Schritt 2.5).
4. Infizieren die Zellen mit VSV-G pseudo-typisierte HIV-1 Partikel, die GFP-Vpr enthalten (wir verwenden 40 ul einer Probe mit 40 ng / ml p24). Beim Hinzufügen der Viruspartikel in den Boden der Schale, vorsichtig zu stören die EM Netz, da die Positionen für die Bildgebung bereits ausgewählt und gespeichert wurden.
5. Unmittelbar nach Zugabe von Virionen, sammeln time-verfallen Hochgeschwindigkeits-3D-konfokale Bilder, auf den zuvor ausgewählten Positionen (aus Schritt 2.3) für 20-40 min.
6. Konfokale Bilder wurden unter Verwendung MetaMorph und analysiert durch automatisierte 3D particle tracking für einzelne Partikel Dynamik mit Imaris Software (siehe Abbildung 1). Da wir Korrelation des dynamischen Verhaltens von beugungsbegrenzter sind HIV-1 Partikel mit zellulären Ultrastruktur, Zeitraffer-Live-Cell-Imaging und 3D particle tracking sind entscheidend für die Ergebnisse. Jedoch für eine große und statische Struktur, würde eine einfache Fluoreszenzbild (ohne lebende Zellen) ausreichend für die korrelative Analyse.

3. Frozen-hydratisiert EM Probenvorbereitung

Um die Zeitverzögerung zwischen Sammlung der letzten Konfokalbild und Kryo-Fixierung der Probe zu minimieren, sollte die FEI Vitrobot (oder einem anderen Gerät Verglasung) initiiert und vorbereitet für Sprung-Einfrieren während der Sammlung der Fluoreszenz konfokale Live-Cell-Bildern.

1. Schalten Sie das Gerät und Verglasung gesetzt sein Klima Temperatur auf 22 ° C, das Ziel Luftfeuchtigkeit bis 100%, das Löschpapier auf 7 sec, und das Warten und Drain auf 1 sek.
2. Legen Sie die Grid-Storage-Box in der Kolben Dewar und bereiten kalt flüssigem Ethan. Montieren Sie den Dewar auf die Verglasung Gerät.
3. Unmittelbar nach konfokale Live-Cell-Imaging (Abschnitt 2), legen Sie die Kulturschale auf einer eisgekühlten Kupfer Block und überträgt es auf die Kryo-EM Probenvorbereitung Zimmer. Laden Sie die EM Gitter auf den spezialisierten Pinzette und schnell auslöschen entfernt alle Medien in der Startaufstellung. Der Blot wird manuell mit Filterpapier getan, woraufhin 4 ul von 15 nm Gold Bead-Lösung mit 0,2 um fluoreszierende Mikrosphären wird sofort auf dem Gitter platziert gemischt. Die Gold-Kügelchen sind als Bezugsmarker zur tomographischen Datenerhebung und Ausrichtung zu unterstützen. Die fluoreszierende Mikrosphären werden verwendet, um Korrelation zwischen Fluoreszenz-und Kryo-EM-Bilder unterstützen (siehe Abbildungen 2c-2f).
4. Legen Sie die Pinzette auf die Verglasung und Gerät anweisen, das Gerät zu tilgen und stürzen Einfrieren in flüssigem Ethan ^16. Die Blot-Parameter optimiert, um beste Ergebnis zu erzielen sind: Blot Zeit, 7 sec; Blot Offset, 0; Drain Zeit, 1 sec, Temperatur, 22 ° C und Luftfeuchtigkeit 100%.
5. Übertragen der tiefgefrorenen Gitters an eine Kryo-EM-Halter zum sofortigen cryoET Bildgebung oder einer Lagerung in flüssigem Stickstoff Dewar zur späteren Verwendung.

4. Cryo-Fluoreszenz Lichtmikroskopie

Eine selbst gebaute, Kryo-Fluoreszenz Probenraum und Bühne (Abbildung 3), die zur Durchführung Schritte 4,1-4,10. Die detaillierten Spezifikationen und Beschreibung der Stufe kann in Juni et al. ¹⁵ gefunden werden.

1. Füllen Sie ein selbst unter Druck flüssigem Stickstoff Dewar mit flüssigem Stickstoff mindestens 2 Stunden vor dem Start Kryo-Fluoreszenz Lichtmikroskopie (siehe Abbildung 3a).
2. Montieren Sie einen selbstgebauten Kryo-fluorescence Probe Stufe ¹⁵ (Abbildung 3) auf einem invertierten Fluoreszenz-Mikroskop, wie ein Olympus IX 71.
3. Verbinden Sie den flüssigen Stickstoff Einlass der Kryo-Probe auf die Bühne selbst unter Druck Dewar und platzieren Sie den flüssigen Stickstoff Überlaufschutz Steckdose in einen geeigneten Behälter. Schließen Sie ein trockenes Stickstoffgas Linie mit einer Hülse über dem Objektiv, damit die Linse warm und frostfrei platziert.
4. Legen Sie eine Kupfer-Block-Plattform (schwarzer Pfeil in Abb. 3b) in der Kryo-Kammer Bühne für das Laden der tiefgefrorenen Probe Netz. Abkühlen und füllen das Kupfer Kammer des Kryo-Bühne mit flüssigem Stickstoff durch die Zuleitung von der selbst unter Druck Füllung Dewar.
5. Wenn die Kryo-Bühne Temperatur von flüssigem Stickstoff (in ~ 4-6 min) erreicht, übertragen Sie die Grid-Storage-Box (aus Schritt 3.5) mit dem Kryo-Bühne.
6. Legen Sie die tiefgefrorenen Probe Gitter in der EM Probe Patrone auf dem Kupfer-Block und klemmen Sie den glos in Ort mit einem C-Ring (bei ​​Verwendung eines Mikroskops Polara Kartusche), oder legen Sie eine vorgekühlte Kupfer Ring an der Oberseite (schwarz Pfeilspitze in Abbildung 3d), um das Raster in Position zu halten und auch für einfache Wiederherstellung des Netzes nach Kryo-Fluoreszenz-Bildgebung (wenn für eine nicht-Polara Kryo-Elektronenmikroskop).
7. Platzieren der Kassette (aus Schritt 4.6) in den Innenraum des Cryo-Stufe (weiße Pfeilspitze in Fig. 3b).
8. Suchen und finden Sie die gleichen Viruspartikeln aus den Live-Cell-Imaging-Daten. Da die EM Grid hat einen Index, ist es einfach zu lokalisieren dasselbe Teilchen auf dem Gitter in beiden Live-Cell-Bilder und Kryo-Blüte Bilder.
9. Erwerben Kryo-DIC-und GFP-Bilder an den identifizierten Positionen unter Kryo-Zustand mit einem Lichtmikroskop mit einem langen Arbeitstag (2.7-4 mm) Objektiv. Während der Kryo-Fluoreszenz-Bildgebung, regelmäßig den flüssigen Stickstoff Ebene in der Kryo-Bühne und füllen Sie ihn, falls erforderlich, um die Probe zu Stufe unterhalb -170 halten° C.
10. Nach Abschluss der Kryo-Fluoreszenz-Bildgebung, vorsichtig wieder die Probe Patrone zum Kupfer-Block-Plattform und speichern Sie die Patrone in einem Flüssigstickstoff-Dewar für zukünftige cryoET Analyse mit einem Polara System. Bei Verwendung eines nicht-Polara Kryo-Elektronenmikroskop, entfernen Sie den Ring Kupfer, rufen Sie die Probe Gitter, legen Sie sie in einem Grid-Storage-Box, und speichern Sie die Probe in einem Flüssigstickstoff-Dewar bis die Probe durch cryoET untersucht wird.
11. Für die Datenanalyse, überlappen die erworbenen Kryo-DIC-und GFP-Bilder (aus Schritt 4.9, siehe Abbildung 4b) und korrelieren die Positionen der GFP-Signale in der Kryo-Fluoreszenz-Bild mit den in der Live-Cell-Imaging-Serie erhalten.

5. Cryo-Elektronen-Tomographie

1. Wägegut Patrone in den Cryo-Übergabestation mit einem Elektronenmikroskop mit einer Feldemissionsquelle, wie Polara G2 Mikroskop ausgestattet.
2. Unter low-dose-Suchmodus bei einer Vergrößerung von 140X, identify und speichern Sie die zugehörigen Planquadrate (aus Schritt 4.11) in eine Bühne Datei.
3. Unter low-dose-Suchmodus bei einer Vergrößerung von 3500 X, legen Sie eine 100 um Objektivapertur, Such-und speichern Sie alle Positionen mit GFP-Signale in einer zweiten Stufe Datei korreliert.
4. Unter low-dose-Aufnahme-Modus, finden Sie einen leeren Bereich Strahlintensität zu einer Dosis von 1 oder 2 E einstellen ^- / Å ² und verfeinern die Kippachse, über die Bühne y-Funktion, durch die Verbrennung entfernt das Eis in einem unwichtigen Kohlenstoff Region mit mehreren Gold-Kügelchen.
5. Unter low-dose-Fokus-Modus, stellen Sie den Fokus auf ~ 3 um und stellen Sie den Winkel, um die Richtung des Fokus auszurichten, dass sie parallel zur Kippachse.
6. Unter low-dose-Suchmodus erinnern gespeicherten Positionen (aus Schritt 5.3), passen Sie die Probe euzentrische Höhe und überprüfen Sie den Schwenkbereich für den Bereich von Interesse. Erwerben Sie ein Projektionsbild mit sehr niedrigen Elektronen-Dosis (~ 1 e ^- / Å ²⁾ bei 8 bis 10 um Unschärfe, in Ausstellungenure-Modus, um die korrelierten Viruspartikel für Kryo-Elektronen-Tomographie bestätigen.
7. Wechseln Sie auf die low-dose-Fokus-Modus. In TEM auto Funktionen Menü, stellen Sie dem automatisierten euzentrische Höhe und konzentrieren Funktionen der Schwerpunktsetzung.
8. Stellen Sie die Parameter für den Erwerb eines Tilt-Serie. Für Abbildung 4 in diesem Papier, angefangen Neigungswinkel ± 70 °, unterhalb und oberhalb 45 °, bei 3 ° und 2 ° Neigung Schritten jeweils verwendet wurden, mit einem 6 um Unschärfe und etwa 70 e ^- / Å ² Gesamtdosis.
9. Wiederholen Sie die Schritte 5.7 und 5.8 für alle gespeicherten Positionen. Batch-Tomographie-Software kann für die automatisierte Datenerfassung auf mehreren Positionen eingesetzt werden, um den Durchsatz zu erhöhen.

6. Dreidimensionale Rekonstruktion mit IMOD ¹⁷

1. Überprüfen Sie die rohen Kippserie um die minimalen und maximalen Dichte Werte einzustellen und festzustellen, ob es irgendeine Aussicht ausgeschlossen aufgrund der großen Bildvers werden.
2. Starten eTomo und Setup Tomogramm Panel mit Achse Typ, Pixelgröße, fiducial Durchmesser, etc. Dann erstellen com Skripte.
3. Konfigurieren Sie das Hauptfenster, so dass mehrere Stufen des Tomogramms Berechnung angepasst werden kann / gefolgt gleichzeitig. Ändern Sie die erforderlichen Parameter und führen die spezifischen Programme, die von jedem Verarbeitungsschritt (Siehe eTomo Tutorial benötigt werden http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html ).
4. In der letzten Stufe, erstellen Sie eine vollständige ausgerichteten Stapel (mit einer mittleren Restfehler kleiner als 0,6) und zu rekonstruieren Schichtaufnahmen mit einer gewichteten Rückprojektionsalgorithmus in IMOD.
5. DeNoise mögliche Bereiche von Interesse mit einem 3D nichtlinearen anisotropen Diffusion Rand Verbesserung Programm in IMOD mit entsprechenden Parametern implementiert, um den Kontrast und die Klarheit zu verbessern.

Ergebnisse

Um das dynamische Verhalten der Viruspartikel zu charakterisieren, wurden HeLa-Zellen mit HIV-1 infiziert von High-Speed-konfokale Mikroskopie lebender Zellen abgebildet und die Partikel-Bewegungen wurden durch automatisierte 3D particle tracking analysiert (Abbildung 1). Um die Zeitspanne von mehreren Minuten, die zwischen Sammlung der letzten konfokale Live-Cell-Bild und tauchen Gefrierpunkt (die lang genug, um HIV-1 korreliert Teilchen verlieren), eine Kryo-Fluoreszenz Lichtmikroskopie Bühne

Diskussion

Wir haben eine einfache Reihe von Protokollen vorgelegt, um eine erweiterte korrelativen Ansatz zur dynamischen zellulären Ereignissen mit Zeitraffer-konfokale, Live-Zell-Fluoreszenz-Imaging von cryoET gefolgt analysieren zu stellen. Unsere methodische Entwicklung zur 3D-Live-Cell-Imaging mit hochauflösenden cryoET korrelieren ist entscheidend für viele anspruchsvolle biologische Probleme, wie die Visualisierung selten, dynamisch (nicht statisch, wie bereits berichtet) und beugungsbegrenzter viralen Partikel und ihre...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine	Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA	12-604F
Fibronectin	Sigma, St. Louis, MO	F1141-1MG	HeLa cell culture on EM grids
Cell tracker	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	C34552	Red CMTPX
Protein A gold conjugates	Ted Pella, Inc., Redding, CA	15822-1	15 nm diameter
0.2 μm fluorescent microspheres	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	F8811	Yellow-green fluorescent
Heat-inactivated fetal calf bovine serum	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	10082-139
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	15140-122
Glass-bottom culture dish	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Gold quantifoil finder EM grids	Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany	R2/2 Au NH2 200 mesh
PBS	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	70011-044
Equipment
Glow-discharge device 100X	EMS, Hatfield, PA
Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun	FEI, Hillsboro, OR		300 keV
Vitrobot Mark III	FEI, Hillsboro, OR
Olympus IX 71 microscope	Olympus America Inc., Center Valley, PA		LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens
Nikon TiE microscope	Nikon Instruments, Melville, NY		using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens
Sweptfield confocal microscope	Prairie Technologies, Middleton, WI
Tokai Hit live cell chamber	Tokyo, Japan
Cryo-fluorescence sample stage	Home-made		Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design.