Adenovirale Transduktion von Naive CD4 T-Zellen zu Treg Differenzierung Studieren

Zusammenfassung

Adenovirale Gentransfer in naiven CD4-T-Zellen mit transgenen Expression des Coxsackie Adenovirus-Rezeptor ermöglicht die molekulare Analyse von regulatorischen T-Zell-Differenzierung In vitro.

Zusammenfassung

Regulatorische T-Zellen (Tregs) sind unerlässlich, um Immuntoleranz auf Selbstbestimmung sowie auf bestimmte fremde Antigene zu präsentieren. Tregs kann von naiven CD4 + T-Zellen in vitro mit TCR-und Co-Stimulation in Gegenwart von TGF-und IL-2 erzeugt werden. Dies birgt ein enormes Potenzial für zukünftige Therapien, aber die Moleküle und Signalwege, die Kontrolle Differenzierung sind weitgehend unbekannt.

Primären T-Zellen können durch ektopische Expression manipuliert werden, aber üblichen Verfahren nicht die wichtigste naive Zustand der T-Zelle vor dem primären Antigen-Erkennung anzusprechen. Hier bieten wir ein Protokoll zu ektopische Gene in naiven CD4 T-Zellen exprimieren in vitro vor Induktion Treg Differenzierung. Es gilt Transduktion mit der Replikation-Adenovirus und erklärt, seine Erzeugung und Produktion. Das Adenovirus kann bis große Einsätze (bis zu 7 kb) und kann mit Promotoren ausgestattet werden, um hohe und vorübergehende Überbel erreichenression in T-Zellen. Es wandelt effektiv naive T-Zellen der Maus, wenn sie eine transgene Coxsackie Adenovirus-Rezeptor (CAR) auszudrücken. Wichtig ist, dass nach der Infektion die T-Zellen bleiben naive (CD44 ^niedrig, CD62L ^hoch) und Ruhe-(CD25 ^-, CD69 ^-) und kann aktiviert und in Tregs differenziert werden ähnlich nicht-infizierten Zellen. Somit ermöglicht dieses Verfahren Manipulation von CD4 T-Zell-Differenzierung von Anfang an. Es sorgt dafür, dass ektopische Genexpression ist bereits in Kraft, wenn sie früh signalisiert Ereignisse des ersten TCR Stimulation induziert zelluläre Veränderungen, die schließlich in Treg Differenzierung führen.

Einleitung

Tregs sind entscheidend für die Immuntoleranz zu halten und überschießenden Immunreaktionen dämpfen. Tregs unterdrücken Zuschauer T-Zell-Aktivierung. Folglich führt Ablation von Tregs zu tödlichen Autoimmunität und Selbstzerstörung durch aktivierte T-Zellen ¹ angetrieben. Tregs im Thymus entwickeln während negative Selektion von CD4-positiven einzigen Vorstufen, aber sie können auch in der Peripherie zu unterscheiden von naiven CD4 + T-Zellen bei niedriger Dosis Antigen-Stimulation mit suboptimalen Kostimulation ^1,2. Thymic Tregs scheinen Gewebe Autoimmunität gegen Selbst-Antigene zu unterdrücken, während peripheren Tregs bei der Bereitstellung von Toleranz im Darm oder der Lunge in Verbindung gebracht haben. Diese induzierten Tregs potently verhindern T-Zell-Aktivierung nach Anerkennung ausländischer Antigene in der Schleimhaut, einschließlich Umwelt-Antigenen aus Nahrung und Luft, symbiotischer Bakterien, Allergene und ^3,4. Darüber hinaus sind Tregs entscheidend für mütterliche Toleranz gegenüber fetalen Peptide ⁵ zu etablieren und vormontiertEntlüftung graft-versus-host disease ^6. Zur gleichen Zeit, Tregs vermitteln auch unerwünschte Effekte durch Dämpfung Immunüberwachung von Tumorzellen ^7,8. Das Erkennungsmerkmal der Tregs ist der Ausdruck der Teilmenge-Angabe Transkriptionsfaktor Foxp3, eine Gabel-Kopf-domain-containing Transkriptionsfaktor, der notwendig und ausreichend verleihen Treg-Funktion ist ^9,10. Einige Signalwege, die Foxp3-Expression zu induzieren können, sind bekannt. Allerdings sind die molekularen Prozesse, die steuern, regulieren, modulieren oder Treg Differenzierung in Antwort auf T-Zell-Rezeptor auslöst weniger gut verstanden.

Tregs sehr effektiv in vitro durch die Stimulierung der naiven CD4 T-Zellen mit anti-CD3 und anti-CD28-Antikörper in Gegenwart von TGF-2 und IL ¹¹ ausgelöst werden. Da die Schwellenländer Tregs in vivo, die Manipulation von Molekülen, die Treg Differenzierung zu fördern sind funktional trägt enormes Potential für zukünftige therapies z. B. die Behandlung von Asthma, Morbus Crohn, und Transplantation ^11,12. Umgekehrt kann therapeutische Modulation von Molekülen an Treg Differenzierung blockieren bieten Nutzen in Zukunft Ansätze der kombinierten Behandlung von Tumorpatienten.

In vitro Differenzierung Assays sind für die Beschreibung der molekularen Veränderungen, die mit T-Zell-Untergruppe Differenzierung verbunden sind maßgeblich. Im Moment, experimentelle Versuche, Suche oder Bildschirm für die Gen-Produkte, die Kontroll-T-Zell-Differenzierung durch die Tatsache, dass die häufigsten Methoden der ektopische Genexpression in naiven T-Zellen nicht behindert werden. So sind zum Beispiel die Elektroporation und die retrovirale Transduktion nur wirksam in aktivierten T-Zellen. Im Gegensatz zu den ursprünglichen Erwartungen lentiviralen Transduktion, die in der Regel wirksam in ruhenden Zellen ist, erfordert vor Aktivierung naiver T-Zellen durch Zytokine ^13. Ferner kann die Übertragung von cDNA oder mRNA bei der Elektroporationbeinhaltet Depolarisation der Zellmembran, die sich verleiht Eigenschaften der T-Zell-Aktivierung und sogar mobilisieren Ca ^{2 +-Signalisierung} und aktivieren NFAT Proteinen (unveröffentlichte Beobachtung und ref. ^14). Auch für retrovirale Transduktion haben die naiven T-Zellen für 18 aktiviert werden - 40 Stunden. Während dieser Zeit erfolgt die Auswertung der Kernmembran im Verlauf der Zellteilung ermöglicht und für die nachfolgende genomische Integration des retroviralen Vektors ^15. Diese Methoden sind daher nicht in der Lage, um die frühe molekulare Regulation der ersten Begegnung mit T-Zell-Antigen, das die entscheidende Phase der Helfer-T-Zell-Differenzierung ist anzugehen.

Adenovirus-Transduktion ist bekannt, ektopische transienten Genexpression in einer Reihe von humanen Zelltypen, die den menschlichen Coxsackie-Adenovirus-Rezeptor (CAR) zum Ausdruck zu verleihen. Es geht ohne Anforderung für Zell-Aktivierung oder Zellzyklus-Progression. Die Oberflächenexpression von CAR ist von wesentlicher Bedeutung für eine effiziente Bindung und Internalisierung Virus, und transgene Expression der verkürzten Version CARΔ1 unter einem T-Zell-spezifischen Promotors wurde festgestellt, dass Mäusethymozyten und T-Zellen anfällig für Adenovirusinfektion ¹⁶ machen. Wichtig ist, dass das Transgen nicht ändern Thymozyten Entwicklung oder in vitro Differenzierung von naiven CD4-T-Zellen in verschiedene Untergruppen (Daten nicht gezeigt; ref ^17.). Adenovirus-vermittelte Transduktion von T-Zellen wurde zuvor zur Überexpression ^17,18 verwendet und Knock-down-Ansätze ^19,20. Die transgenen T-Zellen können aus kommerziell erhältlichen DO11.10 tg gereinigt werden; CARΔ1 tg (Taconic, Inc. und ¹⁷ ref.). Wichtig ist, ermöglicht adenoviralen Transduktion hohe Expression eines Gens von Interesse in naive T-Zellen zu induzieren, ohne offensichtliche Anzeichen der Aktivierung. Die T-Zellen bleiben naive (CD44 ^niedrig, CD62L ^hoch) und Ruhe-(CD25 ^-, CD69 ^-) nach infectiauf und kann aktiviert und in Treg ähnlich nicht infizierten Zellen unterschieden werden.

Herstellung von rekombinanten Adenoviren nach Transfektion von Zellen mit adenoviralen HEK293A Plasmide (Abbildung 1) erreicht werden. Diese Plasmide enthalten in der Regel den menschlichen Adenovirus Typ 5-Genom mit E1 und E3 Gene gelöscht rekombinanten Adenoviren replikationsinkompetent ²¹ machen. HEK293A Zellen ergänzen Replikationsdefizienz, wie sie durch stabile Integration geschert Adenovirus ²² verewigt haben. Seit Adenovirusvektoren groß (~ 40 kb) und damit nicht gut für traditionelle Restriktionsenzym-vermittelte Klonierung geeignet sind, beschäftigten wir das Gateway-System. Das Gen von Interesse wird zunächst in einem kleineren Eingangsvektor, aus dem sie leicht in das adenovirale Zielvektor über Lambda Rekombination (LR) ²³ übertragen werden können kloniert. Wir konstruierten die pCAGAdDu Vektordurch die Kombination der CAG-Promotor (Huhn Actin-Promotor und CMV-Enhancer) mit einer Expressionskassette, enthaltend LR flankieren die prokaryotische ccdB Selektionsmarker ^24. Diese Expressionskassette ist mit einer internen Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES-Element), die Co-Expression der eukaryontischen Infektionsmarker enhanced green fluorescent protein (eGFP), die zu einer Sequenz, die die Rinder-Wachstumshormon-poly (A)-Signal fusioniert ist ermöglicht fusioniert. Wir haben die CAG cis-regulatorische Sequenzen, da die prototypischen CMV-Promotor wurde als hoch-Aktivierung ab und sind daher ungünstig für die Genexpression in naive T-Zellen.

Hier bieten wir ein Protokoll für die effiziente in vitro Treg Differenzierung und eine Methode, um naive CD4 T-Zellen ohne Aktivierung (Abbildung 2) transduzieren. Das Verfahren ermöglicht ektopische Genexpression oder niederzuschlagen vorhergehenden CD4 T-Zell-Differenzierung bei der naiven Zustand. Es ermöglicht die Prüfung der Wirkung einer overexpressed Gen von Interesse in der frühen Signalwege beim erstmaligen TCR Stimulation bis T-Zell-Untergruppe Engagement. Unsere Validierungsexperimente auch die Grundlage, um ähnliche Adenovirus Anwendung bei der Differenzierung von anderen T-Zell-Untergruppen wie Th1, Th2, Th9, Th17, Th22 oder Tfh Zellen zu etablieren.

Protokoll

1. Klonierung eines Gens von Interesse in einem Eintrag Vector

1. Klonen Sie das Gen von Interesse in einem Eintrag Vektor. PCR-Amplifikation des Gens von Blunt-End-Ligation in einem Topoisomerase-gekoppelten Vektor (zB pENTR / D-TOPO) oder Restriktionsenzym-vermittelte Klonierung kann für dieses Verfahren verwendet werden, gefolgt.

2. Die Übertragung des Gens von Interesse in der pCAGAdDu Destination Vektor

1. Übertragen Sie das Gen von Interesse aus dem Eintrag in das Ziel-Vektor Vektor durch LR Rekombination (zB Gateway-LR Clonase II Enzyme Mix). Dadurch wird der adenoviralen Expressionsvektors (Abbildung 1).
2. Linearisieren 10 ug des adenoviralen Expressionsvektors in einem Pacl Restriktionsverdau, die DNA auszufällen und resuspendieren in Wasser bei einer Konzentration von 3 g pro 100 ul. Linearisierung befreit die viralen invertierten Repeats (ITR), die für die Replikation und Einkapselung des v erforderlich sindIRAL DNA in Viruspartikel.

3. Die Erzeugung des Primary Viruslysat

1. Seed 1 x 10 ⁵ HEK293A Zellen in 2 ml Zellkulturmedium (DMEM, 10% FBS, 5% PenStrep) in ein Well einer 6-Well-Platte und Inkubation der Zellen für 6 - 14 Stunden bei 37 ° C in einer 10% CO _2-Inkubator, damit sie halten. Die Zellen sollten dann bei ca. 50% Konfluenz werden.
2. Lipofection: Transfer 6 ul jetPEI Reagenz in 94 ul 50 uM NaCl, kurz vortexen. In der gemischten Lösung zu 100 ul linearisierten Adenovirus-Vektor unter Vortexen und Inkubation dieses Transfektionsgemisch für 15 - 30 min bei Raumtemperatur.

Führen Sie alle folgenden Schritte unter den entsprechenden Bedingungen für Biosicherheit Adenovirus-Infektion!

3. Abgeben der Lösung auf dem HEK293A Zelle enthaltende Vertiefung zugetropft und Inkubation der Zellen bei 37 ° C und 10% CO _2. Bei Verwendung eines Fluoreszenz-Marker bewerten transfektion Effizienz visuell nach 12 - 36 Stunden mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop. 0,5 ml frisches Medium alle 3 Tage.
4. Überprüfen Sie jede 2 - 3 Tage mit einer leichten oder Fluoreszenzmikroskop für zytopathische Effekte (CPE), die Bereiche mit vergrößerten und abgerundeten Zellen, die zu lösen beginnen. Dies deutet auf eine effiziente Virus Generation. Beim Auftreten von breiteren Zonen der CPE (Abbildung 3), dauert es 24 bis 72 Stunden, bis alle Zellen infiziert sind.
5. Wenn alle Zellen zeigen Anzeichen von CPE, aber bevor eine allgemeine Ablösung von Zellen auftritt, lösen die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren und Transfer Zellen mit Überstand (SN, 3 - 5 ml) in ein 15 ml Röhrchen Polystyrol.
6. Einfrieren der Zellen in der SN auf Trockeneis für 15 - 20 min und auftauen sie schnell bei 37 ° C anschließend zum Bruch der Zellen. Wiederholen Sie diesen Frost-und Tauwetter-Zyklus (F / TC) zwei weitere Male. Halten Sie die primäre Viruslysat auf Eis für die Nutzung innerhalb eines Tages oder frieren Sie sie bei -80 ° C für die langfristige Lagerung. Jede zusätzliche F/ TC wird die Virustiter um 30 reduzieren - 50%.

4. Virus Amplification

1. Seed und wachsen HEK293A Zellen 90% Konfluenz auf 14 cm Gewebekulturschale.
2. Infect die Zellen mit der Hälfte der primären Virus-Lysat (1,5 - 2,5 ml) und Inkubation der Zellen für mindestens 36 Stunden. Nahezu alle Zellen sollten dann infiziert werden können, was durch Fluoreszenzmikroskopie bestimmt werden. Für die Re-Verstärkung eines bereits verstärkt (dh mehr konzentriert) Virus Lager, infizieren HEK293A bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 50 (siehe 6.3).
3. Die Zellen sollten geerntet werden, wenn sie alle CPE zeigen aber vor Ablösung werden. Mit effizienten Virus-Produktion wird dieser Zustand innerhalb von 48 Stunden nach der Infektion erreicht. (Falls es dauert bis zu einer Woche, sollten eine weitere Runde der Verstärkung durch die Erhöhung der Menge von Adenovirus Lager für die Infektion in 4.2 beschrieben wird.)
4. Lösen Sie die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren und Transfer Zellen und SN auf eine 50 ml Tube Polystyrol. Spin Zellen nach unten bei 300 g für 10 min bei 4 ° C.
5. Entfernen Sie die SN und das Pellet in einem geeigneten Volumen an Medium oder SN (ca. 1 ml).
6. Führen Sie 3 F / TC, um die Zellen und Zentrifuge bei 800 g für 15 min bei 4 ° C stören Nehmen Sie den SN, dass die Viruspartikel enthält (dh die konzentrierte Viruslysat) und Aliquot der Viruslysat es bei -80 ° C lagern

5. Virus Titer Bestimmung

1. Seed 10 ⁵ A549 Zellen pro Well in 5 Vertiefungen einer Platte mit 12 Vertiefungen in 1 ml Medium und lassen Zellen 6 h ​​lang anhaften.
2. Verwenden Sie 1 ul konzentrierter Adenovirus (auf Eis aufgetaut), um eine serielle Verdünnung in Medium (1:5.000, 1:10.000, 1:50.000, 1:100.000) durchführen und mit 10 ul pro Well. Eine Vertiefung, um die infizierten Gating in der Durchflusszytometrie einzustellen.
3. Nach 36 Stunden, nehmen Sie den SN, waschen mit PBS lösen und Zellen (zB durch Trypsinisierung). Für Biohazard Vorsichtsmaßnahmen, ist es empfehlenswert, c behebenEllen in 100 ul 4% Paraformaldehyd in PBS für 10 min bei Raumtemperatur und Waschen mit PBS einmal.
4. Führen Sie eine FACS Analyse der Infektion Marker Ausdruck. Plot 'ul Viruslysat angewendet "gegen die absolute Zahl der infizierten Zellen (Abbildung 4). Bestimmen Sie den linearen Bereich der Infektion und die Berechnung der Titer pro ml unverdünnt Virus aus der Standard-Kurve über den linearen Bereich mit x = 1.000 ul.

6. T-Zell-Infektion

1. Isolieren naive / ruhenden CD4 T-Zellen aus DO11.10 tg; CARΔ1 tg Mäusen mit MACS (Naive CD4 + T-Zell-Isolation Kit II) oder FACS-Sortierung (CD4 + CD25-CD62L + CD44-).
2. Für kleine Experimente, Pipette eine angemessene Lautstärke Viruslysat eine MOI von 50 in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte mit rundem Boden erreichen.
3. Fügen Sie bis zu 4 x 10 ⁵ T-Zellen in einem abschließenden Infektion Volumen von 50 ul in T-Zell-Medium (RPMI1640, 10% FBS, 5% PenStrep, 5% NaPyruvate, 1x NEAA, 1x MEM WesentlicheVitamin, 1x L-Glutamin, 1:250.000 Mercaptoethanol, 10 mM HEPES).
   Beispiel:
   Einer MOI von 50 wird verwendet, um 3 x 10 ⁵ T-Zellen zu infizieren; das virale Titer ist 3 x 10 ⁹ ml ^-1
   Virus volume = MOI x T Zellzahl / virale Titer = 50 x (3 x 10 ⁵⁾ / (3 x 10 ⁹ ml ^-1) = 0,005 ml

Hinweis: für die Infektion von größeren Zellzahlen, Scale-up mit einer MOI von 50 in einer Infektion Volumen von 165 ul pro 10 ⁶ naiven T-Zellen in einem Polystyrol-Röhrchen mit losen cup (bis tp 3 ml pro Röhrchen).

4. Inkubieren Zellen für 90 min bei 37 ° C in einer 5% CO _2-Inkubator.
5. Spin down Zellen bei 300 xg für 5 min bei Raumtemperatur ausziehen SN, in 200 ul PBS resuspendieren. Zentrifuge wieder ausziehen SN.

(Optional: die Zellen wieder gewaschen werden, um das Virus effizienter zu entfernen)

6. Die Zellenin 200 ul T-Zell-Medium ohne stimulierenden Antikörpern und ohne IL-2 oder anderen Zytokinen und ruhen sie für 40 Stunden bei 37 ° C in einer 5% CO _2-Inkubator, um die Expression des Gens von Interesse vor der Aktivierung zu ermöglichen.

7. T-Zell-Aktivierung und Polarisation

1. Pipette ein Volumen von anti-CD3-und anti-CD28-gekoppelten Kügelchen, die die Anzahl der Zellen (z. B. 4 x 10 ⁵⁾ gleich in eine kleine Tasse Reagenz, fügen Sie die 10-fache Volumen PBS und legte sie auf einem Magneten für 2 min . Nehmen Sie den Überstand und resuspendieren die Perlen in 200 ul polarisierende Medium (Tregs: T-Zell-Medium + 1 ng / ml TGF, 100 U / ml IL-2).

Hinweis: Die Zellen können auch unter Verwendung aktiviert Zellkulturschalen mit anti-CD28 und anti-CD3-Antikörper beschichtet werden, oder in einem DO11.10 T-Zell-Rezeptor-spezifische Weise unter Verwendung von bestrahlten BALB / c-Splenozyten mit Ovalbumin 323-339 Peptidantigen gepulst.

2. Centrifuge die ausgeruht Zellen wie zuvor, nehmen Sie den SN und Zellen in 200 ul polarisierende Medium mit anti-CD3-und anti-CD28-Antikörper-gekoppelten Kügelchen. Inkubieren für 72 Stunden bei 37 ° C in einer 5% CO _2-Inkubator ohne Medium.

8. T-Zell-Fixierung und Färbung für die Durchflusszytometrie

1. Waschen der Zellen: Spin down Zellen bei 300 xg für 5 min bei Raumtemperatur ausziehen SN, in 200 ul PBS resuspendieren. Zentrifuge wieder ausziehen SN. Führen Sie alle folgenden Waschschritte entsprechend.
2. Die Zellen in 100 ul feststellbar tot Zellfärbung Lösung und Inkubation für 30 min bei 4 ° C.
3. Waschen der Zellen resuspendieren in 100 ul PBS, fügen Sie 100 ul 4% Paraformaldehyd in PBS, Inkubation 15 min bei RT.
4. Waschen der Zellen resuspendieren sie in 200 ul eiskaltem 70% Methanol in PBS und Inkubation für 30 min auf Eis.

Hinweis: Die Zellen können von nun an ohne biohazard vorsorglich behandelt werden!

5. Bereiten Sie 60 ul Master-Mix aus 60 ul PBS + 10 ug / ml Fc-Block (anti-FCR3 unspezifische Bindung zu blockieren). Waschen der Zellen resuspendieren sie in 40 ul PBS + Anti-FCR3 und Inkubation 15 min bei RT.
6. In 20 ul PBS + Anti-FCR3 mit 1 ug PE-gekoppelten anti-Foxp3 Antikörper, gut mischen und bei 4 ° C inkubieren über Nacht.
7. Waschen Sie die Zellen zweimal in PBS und analysieren Zellen auf einem Durchflusszytometer.

Ergebnisse

Virus Produktion

Zur Erzeugung hoher Virustiter, ist der Zeitpunkt der Zellernte HEK293A in primären Virusproduktion oder Virusamplifikation entscheidend. Repräsentative Fluoreszenz-und Phasenkontrast-Aufnahmen mit visuellen Zeichen der Virus-Produktion sind in Abbildung 3 dargestellt. Die CPE wurden 10 Tage nach der Transfektion von Zellen mit einem HEK293A Kontrolle pCAGAdDu Vektor ohne Insert beobachtet. CPE sind durch das Auftreten von Bereichen mit vergrößerten und Rou...

Diskussion

Virus Generierung und Titration

Für eine optimale Transfektion Ergebnisse scheinen die Qualität und Menge der linearisierte Vektor wichtigste. Konnten wir nicht beobachten negative Auswirkungen auf die primären Lysat Produktion von einer anfänglichen Überwucherung der Kultur seit der Infektion schnell gehen wird, sobald effiziente Virus-Produktion auftritt. Virus kann jedoch die Produktion um HEK293A Zellen durch lange Einsätze, die die Effizienz verringern betroffen sein. Einige offene L...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Invitrogen	K240020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	11791020
PacI	New England Biolabs	R057S
jetPEI	Polyplus-transfection	101-10N
HEK293A Cell Line	Invitrogen	R705-07
A549	ATCC	CCL-185
6-well plates	BD Falcon	353046
14 cm tissue culture dish	Nunc	168381
BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr	Taconic Farms	Model Nr. 4285
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II	Miltenyi Biotech	130-094-131
DMEM	Invitrogen	41966-052
FBS	PAN Biotech	1502-P110704
PenStrep	Invitrogen	15140-122
RPMI 1640	Lonza	BE12-167F
NaPyruvate	Lonza	BE13-115E
NEAA 100x	Lonza	BE13-114E
L-Glutamine	Invitrogen	25030
HEPES Buffer Solution (1 M)	Invitrogen	15630-056
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M-7522
MEM Essential vitamin mixture (100x)	Lonza	13-607C
Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation	Invitrogen	114-56D
Recombinant Human TGF-beta 1	R&D Systems	240B
Proleukin S (18 x 106IE)	Novartis
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Invitrogen	L-23105
Mouse BD Fc BlockT	BD Pharmingen	553141
Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE	eBioscience	12-5773-82
Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay	Roche Applied Biosystems	4427975
LightCycler 480 Probes Master	Roche Applied Biosystems	04902343001
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit	Roche Applied Biosystems	4366596