Eine modifizierte Heterotope Schweine Hind Gliedmaßen-Transplantation Modell für Translationale Vaskularisierte Composite-Allotransplantation (VCA) Forschung

Zusammenfassung

Vaskularisierte Verbund Allotransplantations (VCA) haben eine klinische Realität werden. Allerdings ist eine breite klinische Anwendung des VCA durch chronische Multi-Drug-Immunsuppression begrenzt. Die Autoren stellen eine zuverlässige und reproduzierbare Großtiermodell, um neue immunmodulatorische Strategien, die Minimierung oder Beseitigung potenziell die Notwendigkeit der Immunsuppression in VCA übersetzen kann.

Zusammenfassung

Vaskularisierte Composite-Allotransplantation (VCA), wie zB Hand-und Gesichtstransplantationen stellen eine praktikable Behandlungsoption für komplexe Muskel-Skelett-Trauma und Gewebeverlust verheerend. Trotz günstiger und sehr ermutigend frühen und mittleren funktionellen Ergebnisse, die Ablehnung des hoch immunogen Hautkomponente eines VCA und mögliche nachteilige Auswirkungen der chronischen Multi-Drug-Immunsuppression weiterhin eine breite klinische Anwendung der VCA zu behindern. Daher Forschung in diesem Roman Feld muss auf translationale Studien, einzigartige immunologische Merkmale der VCA zu konzentrieren und neue immunmodulatorische Strategien zur Immunmodulation und Toleranzinduktion folgenden VCA, ohne die Notwendigkeit für langfristige Immunsuppression zu entwickeln.

Dieser Artikel beschreibt eine zuverlässige und reproduzierbare translationale Großtiermodell der VCA, die aus einem osteomyocutanene Klappe in einer MHC-definiert Schweine heterotope Hinterbein Allotransplantationen besteht. BrieFly, ist ein gut vaskularisiert Haut Paddel in anteromedialen Oberschenkelbereich mit Nah-Infrarot-Laser-Angiographie identifiziert. Die zugrunde liegenden Muskeln, Kniegelenk, distale Femur und Tibia sind auf einer Oberschenkelgefäßstiel geerntet. Dies kann als Allograft sowohl ein VCA und eine gefäßKnochenMarkTransplantation mit seiner einzigartigen Immun privilegierte Funktionen werden. Das Transplantat wird mit einer subkutanen Bauchtasche im Empfängertier mit einer Hautkomponente zu der dorsolateralen Region für die Immunüberwachung exteriorisiert transplantiert.

Drei Operationsteams arbeiten gleichzeitig an einem gut koordinierten Art und Weise auf die Anästhesie und Ischämie Zeiten zu reduzieren und dadurch die Verbesserung der Effizienz dieses Modells und die Verringerung der potenzielle Störfaktoren in Versuchsprotokollen. Dieses Modell dient als Grundlage für zukünftige therapeutische Strategien zur Reduzierung und möglicherweise die Notwendigkeit für chronische Multi-Drug-Immunsuppression bei VCA soll.

Einleitung

Vaskularisierte Composite-Allotransplantation (VCA), wie zB Hand-und Gesichtstransplantationen sind jetzt eine klinische Realität mit zahlreichen Hand-und Gesichtstransplantationen weltweit ¹² durchgeführt. Trotz der Tatsache, dass die frühen und Zwischenergebnisse günstige und sehr ermutigend ² sind, die Anforderung von chronischen Immunsuppression multi weiterhin seine weitverbreitete klinische Anwendung zu begrenzen. Die Fortschritte in Mausmodellen der VCA einschließlich Super-und mikrochirurgischen Anastomosen nonsuture Manschette Techniken ^{13, 3} haben den Weg zu einem besseren Verständnis der Alloimmune Antworten in VCA gepflastert. Myriaden von immunmodulatorischen Protokollen für klinische Anwendungen auf der Grundlage unserer besseren Verständnis der Immunmechanismen in VCA vorgeschlagen worden, aber sie müssen in einem Großtiermodell, die vernünftigerweise voraus ihrer Leistung in den Menschen ⁷ wäre validiert. Basierend auf physiologische und immunologische Ähnlichkeiten zwischen Mensch und Schwein Organsysteme ^{6, kann die Schweine VCA-Modelle betrachtet werden zuverlässige und kostengünstige Alternativen zu Eckzahn 9 und nichtmenschlichen Primatenmodelle ein.}

Dieser Artikel bietet einen detaillierten Überblick über die Methodik in unserem MHC definierten Schweine heterotope Hinterbein Transplantationsmodell, das als Grundlage für unsere aktuellen und zukünftigen immunmodulatorische Strategien zur Induktion von Immuntoleranz VCA und damit Verbreiterung der klinische Anwendung dient. Wir nutzen die gut charakterisierten Inzucht Schweine, die speziell für den Einsatz in der Transplantations-Forschung ¹¹ gezüchtet, um Homozygotie an der Schweine Leukozyten-Antigen Locus. Wir erheben eine gefäß osteomyocutanene Klappe basierend auf Oberschenkelgefäße. Die Klappe enthält intakt vaskularisierten Knochenmark im distalen Femur und der proximalen Tibia. Anteromedialen Oberschenkelhaut wird auch in dem Transplantat enthalten und ist mit dem dorsolateralen Aspekt der Empfängertier für die Immunüberwachung des am meisten immunogene Komponente o exteriorisiertf der VCA. Dorsolateralen Positionierung erleichtert die klinische Untersuchung im Stehen und Sitzen Positionen und hält die Haut Allograft auch relativ sauber.

Ustener et al. Eingeführt einer der ersten Großtiermodelle in Translations VCA durch die Transplantation von Radial forelimb osteomyocutanene Klappen in outbred Bauernhof Schweine ^15. Die Gruppe verwendet dieses Modell, um das erste Mal, dass die akute Abstoßung der VCA, die die hoch immunogen Hautkomponente enthalten könnte verzögert und mit einem klinisch relevanten Strategie behandelt werden, ohne nennensdrogenspezifische Komplikationen und Nebenwirkungen zu zeigen. Die in dieser Studie positive Ergebnisse später baute einen grundlegenden Schritt in der Entwicklung medikamentöser Menschen rekonstruktive Transplantation. Obwohl diese frühen Schwein VCA Modelle waren für die Entwicklung von Protokollen zur Ablehnung von Haut, Muskeln, Knochen, Nerven und Gefäße sie spezialisierte Strukturen wie Gelenk cartilag fehlte verhindern gut geeignete und synovialen Membranen der Gelenke. Spätere Bemühungen wurden mit der medialen Ziffer des Tieres, das in voller Länge Guss Platzierung notwendig, um zu verhindern Transplantat dislodgement ¹⁴ fokussiert. Obwohl geeignet, Ablehnung aller Hauptkomponenten von Gliedmaßen-Transplantation zu untersuchen, eine der wichtigsten Einschränkungen dieses Modell war nach der Transplantation ambulanten Schwierigkeiten aufgrund Platzierung gegossen. So heterotope Schweineschenkel Allotransplantationen Modelle, bestehend aus dem Schienbein, Wadenbein, Kniegelenk, distale Femur umgebenden Muskeln und Haut ein Paddel, wurden geschaffen, um vor allem immunologische Aspekte der VCA studieren, während es dem Tier, sich frei mit minimalen postoperativ ambulate morbidit ⁸ .

Die Entwicklung von gut charakterisierten SLA definierten Inzucht-Schweine durch die Pionierarbeit von Dr. David H. Sachs führte zu einer neuen Ära der translationalen Forschung VCA. Mit Hilfe eines heterotopen Hinterbein Transplantationsmodell in einer Moll-Antigen-Mismatch-Einstellung, Mathes et al. zeigten ¹⁰ unbestimmte Überleben des Muskel-Skelett-Komponenten mit einer kurzen Verlauf der Cyclosporin-Behandlung. Die Hautkomponente Überleben war jedoch nur im Vergleich zu Kontrollen ohne Behandlung verlängert. Der Verlust der Hautkomponente des Transplantats auf einem isolierten und hoch kräftigem Immunantwort, insbesondere der Epidermis zurückzuführen. Ebenso voll mit nicht übereinstimm Schweine mit T-Zell-Depletion, einem kurzen Kurs von Cyclosporin und Zytokin mobilisiert Spender periphere mononukleare Blutzellen induzierte Toleranz nur auf Muskel-Skelett-Komponenten und die Hautkomponente noch abgelehnt ^5. Dieses Phänomen, genannt "Split-Toleranz", brachte einen Paradigmenwechsel in der Forschung VCA mit einem größeren Fokus auf die hoch immunogen Haut-Komponente, die ein integraler Bestandteil der Mehrheit der rekonstruktiven Transplantationen bis heute durchgeführt wird.

In diesem modifizierten Modell verwenden wir Ende-zu-Ende-Anastomose von ligating der Empfänger Femoralarterie und Drehen kranial (Abbildung 1). Dies reduziert nicht nur Ischämie Zeit, indem sie die Verwendung eines herkömmlichen Kupplungsvorrichtung, sondern vermindert auch die Wahrscheinlichkeit von Anastomosen Versagen. Es wurden keine ischämische Ereignisse nach Ligation der A. femoralis in unserem Empfänger darauf hinweist, dass Sicherheiten Verkehr war ausreichend, um Durchblutung auf die native Bein stellen beobachtet. Zusätzlich wird in diesem modifizierten Verfahren wird der ausgelagerten Hautkomponente auf der Basis der zugrundeliegenden Perforator Gefäße mobilisiert und seitlich (Fig. 1) im Gegensatz zu einer ventralen Leistenposition in dem traditionellen Modell ¹⁰ positioniert. Dies ermöglicht eine einfache Visualisierung des Transplantats für die Immunüberwachung im Stehen oder Sitzen des Tieres.

Daher ist eine zuverlässige und reproduzierbare Großtiermodell wichtig, Toleranzinduktion Strategien gegen die Hautkomponente von VCA zu untersuchen und zu entwickeln, um neue noninvasive Immunüberwachungsstrategien für eine bessere Vorhersage des Transplantatüberleben.

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Protokoll

In diesem Video-Veröffentlichung wurden alle Tierverfahren in Übereinstimmung mit einer von der Johns Hopkins University Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) zugelassen Tier-Protokoll durchgeführt.

1. Die präoperative Planung

1. Wir nutzen MHC definierten Inzucht MGH Miniaturschweinen (15-20 kg) in unserem translationale Studien für Gliedmaßen Allotransplantationen wobei eines männlichen Spenders bietet Gliedmaßen für zwei weibliche Empfänger (Abbildung 1). Vor der Operation, Spender-und Empfängertieren werden gründlichen klinischen Beurteilung durch einen Tierarzt.
2. Um Anästhesie und Ischämie zu minimieren, Spender und Empfänger Verfahren werden gleichzeitig auf drei OP-Tische in einem großen Tier gewidmet Operationssaal durchgeführt. Teamwork und Koordination zwischen OP-Teams sowie dem Veterinärpersonal sind entscheidend für den Gesamterfolg dieses Verfahrens. Der Operationsplan wird mit dem Tier Team in einer formellen Sitzung 1 diskutiert-2 Wochen vor dem Tag der Operation.
3. Eine getunnelte zentrale Venenkatheter (7 Fr Doppellumen-Katheter Hickman) in einer externen oder internen Halsschlagader jedes Empfängertieres vor der Transplantation für Immunsuppressivum Füllstandsüberwachung und die intravenöse Verabreichung von Immunsuppressiva und / oder immunmodulatorische Medikamente platziert. Diese Katheter werden unter direkter Sicht durch eine venöse Cut-down-Technik gesetzt und getunnelt posterior auf der dorsalen Hals und hoch zu verlassen mit Monofilament nicht resorbierbaren Nahtmaterial und Klebstoff Bandage Wrap um den Hals befestigt.
4. Halten Sie Tiere NPO (keine feste Nahrung, sondern dürfen Wasser ad lib) mindestens 12 Stunden vor der Operation.
5. Am Tag der Operation, ruhigere Tiere mit Ketamin 20 mg / kg Xylazin und 2 mg / kg IM.
6. Legen Sie ein entsprechend dimensioniertes Endotrachealtubus und verbinden Sie es mit dem Anästhesiegerät und Ventilator (gehalten auf Isofluran 0,5-3%)
7. Legen Sie eine intravenöse Katheter in einer Ohrrandvene und verwaltenbezogen 0,9% Kochsalzlösung während des gesamten Verfahrens.
8. Verwalten vorbeugende Analgesie (Buprenorphin 0,02 mg / kg IV).
9. Verwalten prophylaktische Antibiotika (Cefazolin 20-25 mg / kg IV) vor dem ersten Schnitt auf Spender und Empfänger Tieren.
10. Verwenden steriler Technik in allen Verfahren, die beiden Empfängern und Gebern. Dies schließt die Verwendung von Autoklaven behandelt oder sterilisiert Instrumente, Masken, Kopfhauben, sterile OP-Kittel und sterile Handschuhe. Rasieren Sie den Bereich des Einschnitts mit einer Schneidemaschine und desinfizieren mit Betadine Wechsel Lösung und Alkohol.

Die intraoperative Monitoring:

1. Nach der Einleitung und Intubation Aufrechterhaltung einer Narkose mit einem Inhalationsgemisch 0,5-3% Isofluran in Sauerstoff.
2. Überwachung der Herzfrequenz, Pulsoximetrie, EKG, endexspiratorischen CO ₂ und rektale Temperatur kontinuierlich und notieren alle 15 min.
3. Verhindern Sie mit einer Hypothermie Bair Hugger warmen Umluftdecke.

osteomyocutanene Gliedmaßen Allograft Ernte von Donor Pig:

1. Legen Sie das Spendertier in Rückenlage auf dem Operationstisch drapieren und steril.
2. Verwenden Sie in der Nähe von Infrarot-Laser-Angiographie Locher Gefäße anteromedialen Haut identifizieren. Inject Indocyaningrün bei ca. 0,06 mg / kg in 2-5 ml normaler Kochsalzlösung durch periphere Gefäßzugang verdünnt. Etwa 10 Sekunden später, führen 30 sec-2 min von Nah-Infrarot-Aufnahmen. Verwenden Sie das Video von den Aufnahmen zu Locher identifizieren. Basierend auf Perforatoren Markieren eines Bereichs der Haut (ca. 100 cm ²⁾ für die Überwachung.
3. Verwenden Sie ein Skalpell, um eine Leistenhautschnitt in der Kontinuität mit Markierungen für die Haut Paddel (Abbildung 2) zu machen.
4. Identifizieren Oberschenkelgefäße und isolieren sie distal der Ebene der suprageniculate Filialen und proximal zu der Ebene des Leistenbandes.
5. Präparieren Sie die Haut-und Unterhautgewebe, während preserving die Fläche der Schaufelhaut. Nähen Sie die Ränder der Haut darunter liegenden Muskeln zu Kontraktion während Klappe Ernte zu vermeiden.
6. Führen Sie eine Osteotomie knapp über dem Tarsus mit einer Säbelsäge (Electric Pen Drive, Synthes, West Chester PA).
7. Teilen Sie die Muskeln in der proximalen Oberschenkel mit Elektrokauter.
8. Teilen Sie die Oberschenkelknochen in der Mitte der Welle Verlassen einer osteomyocutanene Klappe auf einem Gefäßstiel. Die Klappe enthält die Haut Paddel, zugrunde liegende Oberschenkel-Muskulatur, Kniegelenk, distale Femur und Tibia, die intakt vaskularisierten Knochenmark mit seiner einzigartigen immunologischen Funktionen beinhaltet.
9. Verwenden Knochenwachs zur Blutstillung in den Markräumen zu erreichen. Glatte Knochenkanten mit ronjeurs in Vorbereitung für den Empfänger.
10. Halten Sie das Transplantat durchströmt auf seinem Gefäßstiel bis Oberschenkelgefäße des Empfängers werden hergestellt (Abbildung 3).
11. Sobald der Empfänger Präparation abgeschlossen ist, abzubinden der Spenderoberschenkelgefäße proximalen wie möglich einnd ziehen das Transplantat mit Histidin-Tryptophan-Ketoglutarat (HTK, Custodiol, Newtown PA) vor der Transplantation.
    HINWEIS: Der Spender Schenkel auf der kontralateralen Seite des Empfängers, dh dem linken Schenkel Spender für die rechte Seite des Empfängers und dem rechten Schenkel Spender für die linke Seite des Empfängers) transplantiert.
12. Euthanize das Spenderschwein unmittelbar nach der Ernte der zweite Hinterbein unter Verwendung von 100 mg / kg IV Natriumpentobarbital. Der Tod wird durch die Veterinärpersonal pro etablierten Protokoll bestätigt.

4. Empfänger Verfahren (Hind Gliedmaßen Allotransplantation)

1. Starten Sie den Empfänger Einleitung und Intubation sofort nach der ersten Geberschnitt die Vorbereitung des Empfängers Schiffe zu ermöglichen, während der Spender Gliedmaßen geerntet wird. Dadurch werden unnötige Wartezeiten und reduziert die Gesamtzeit für die Anästhesie Spender und Empfänger.
2. Positionieren Sie das Tier in Rückenlage mit einer Drehung von 30 ° auf der Bedienseite zu allow Exposition der dorsolateralen Seite.
3. Machen Sie einen Leistenschnitt und setzen die Oberschenkelgefäße, isolieren sie distal der Ebene der suprageniculate Filialen und proximal zu der Ebene des Leistenbandes.
4. Erstellen Sie eine subkutane Tasche von der Leiste bis dorsolateralen Bauchwand für das Transplantat Einsatz (Abbildung 4).
5. Ligation der Spenderbehälter und spülen Sie das Transplantat mit HTK.
6. Führen Sie das Transplantat Einsatz invertiert: Haben die Haut Paddel gegen dorsolateralen zu einfach Immunmonitoring in einer stehenden Position und die abgeschnittenen Enden der Oberschenkelgefäße gegen kaudal, um End-to-End-Gefäßanastomosen ohne Spannung auf den Schiffen erlauben (ermöglichen Abbildung 5).
7. Wenn vorhanden, verwenden Sie einen Gefäßkopplungsvorrichtung (Synovis, St. Paul MN) für venöse Anastomosen (Größe 2,5 bis 3,5 ist geeignet für 10-20 kg Tiere). Diese Ischämie Zeit signifikant reduziert im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren.
8. Führen arteriellen anastomoses mit einem herkömmlichen Nahttechnik mit 9-0 Faden (Synovis, St. Paul MN)
9. Nach Gefäßdurchgängigkeit bestätigt ist, sichern das Transplantat an Ort und Stelle mit 3-0 PDS-Nähte (Abbildung 5). Die Muskeln des Transplantats an der Bauchmuskulatur vernäht. Die Pfropf Muskeln nicht auf die Empfänger Oberschenkelmuskulatur vernäht, da es schädlich sein, wenn das Tier bewegt sich um den Käfig. Werden
10. Exteriorisieren die Haut Paddel auf der dorsolateralen Seite für die Immunüberwachung (Abbildung 6) und nähen es mit der benachbarten Haut mit 3-0 Vicryl subkutanen Nähten und 4-0 Monofilament resorbierbaren Hautnähte unterbrochen.
11. Schließen Sie die Haut in der Leistengegend Schichten mit 3-0 Vicryl subkutanen Nähten und 4-0 Monofilament resorbierbaren Hautnähte unterbrochen.
12. Legen Sie ein 50-100 mcg / h Fentanyl-Pflaster für die postoperative Analgesie.
13. Nach der Hintergliedmaße Allograft Transplantation, bringen Sie das Tier in das Stift einmal wach und Atem bequem auf seine eigenen.

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Ergebnisse

Vierundzwanzig SLA definierten Schweinehinterbein heterotope Transplantationen wurden unter Verwendung unserer modifizierte Technik mit einer mittleren Ischämiezeit von 78 min (Bereich: 62-94 min). Graft Einsatz und dorsolateralen Haut Paddel Positionierung wurden ohne Schwierigkeiten in allen Tieren erreicht. Nah-Infrarot-Laser-Angiographie zeigte eine hervorragende Transplantatdurchblutung in allen Empfängern. Die ersten zwölf Anastomosen wurden mit herkömmlichen Nahttechniken, während die letzten zwölf Anastomo...

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Diskussion

Historisch gesehen, enthalten die heterotope Transplantation Hinterbein Protokoll Exteriorisation einer Haut Paddel auf der ventralen Bauchwand und die Behälter wurden in einem Ende-an-Seite-Weise anastomosiert (Hettiarachty 2004). Jedoch im modifizierten Verfahren eine invertierte Klappe Insetting-und End-zu-End-Anastomosen bringen die Haut Paddel seitlich weiter und erleichtert die Immunüberwachung in einer stehenden Position des Tieres damit. Die Identifizierung des Nervus Arterie und die Zonen maximaler Perfusion ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
HTK	Custodial	N/A
EQUIPMENT
Electric Pen Drive	Synthes, Westchester PA	05.001.011	Reciprocating saw
Vascular Coupling device	Synovis, Newtown PA	21003B