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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir haben eine automatisierte Zellkultur und Verhör Plattform für Mikro-Skala-Zell-Stimulation Experimente entwickelt. Die Plattform bietet eine einfache, vielseitige und präzise Kontrolle in den Anbau und die Förderung kleiner Populationen von Zellen und Gewinnen Lysate für molekulare Analysen. Die Plattform wird auch auf Studien, die kostbaren Zellen und / oder Reagenzien geeignet.

Zusammenfassung

Studium der Zellen in Kultur (in vitro-Analyse) hat wichtige Einblicke in komplexe biologische Systeme zur Verfügung gestellt. Herkömmliche Verfahren und Anlagen für die in vitro-Analyse sind gut geeignet, um einer großen Anzahl von Zellen (≥ 10 5) in Milliliter-Skala Volumina (≥ 0,1 ml) zu untersuchen. Es gibt jedoch viele Fälle, in denen es notwendig oder wünschenswert sein, Kultur Größe verkleinern, um den Verbrauch der Zellen von Interesse und / oder Reagenzien für die Kultur, Stimulation oder der Verarbeitung zu reduzieren. Leider haben konventionelle Ansätze nicht unterstützt präzise und reproduzierbare Manipulation von Mikro-Maßstab Kulturen, und die Mikrofluidik-basierte automatisierte Systeme, die derzeit verfügbar sind zu komplex und spezialisiert für den routinemäßigen Einsatz von den meisten Labors. In Mikro-Maßstab Volumen - Um dieses Problem anzugehen, haben wir eine einfache und vielseitige Technologie-Plattform für die automatisierte Kultur, Anregung und Wiederherstellung von kleinen Populationen von Zellen (2000 Zellen 100) entwickelts (1 - 20 ul). Die Plattform besteht aus einer Reihe von fibronektinbeschichtete Mikrokapillaren ("cell Perfusionskammern"), in dem Mikro-Maßstab Kulturen etabliert, werden beibehalten und angeregt, eine digitale Mikrofluidik (DMF)-Gerät mit "Transfer" Mikrokapillaren ("zentrale Drehscheibe ausgestattet "), die Strecken Zellen und Reagenzien zu und von den Perfusionskammern; eine hochpräzise Spritzenpumpe, die Befugnisse Transport von Materialien zwischen den Perfusionskammern und der zentralen Nabe und eine elektronische Schnittstelle, die Kontrolle über den Transport von Materialien bietet, das ist koordiniert und automatisiert via vorgegebenen Skripten. Als Beispiel haben wir die Plattform zur Untersuchung der transkriptionellen Reaktionen hervorgerufen in Immunzellen auf Herausforderung mit Bakterien zu erleichtern. Die Nutzung der Plattform konnten wir den Verbrauch von Zellen und Reagenzien zu reduzieren, minimieren Experiment zu Experiment Variabilität und re-direct hands-on Arbeit. Angesichts der Vorteile, die es verleiht, sowie die Erreichbarkeit und die Vielseitigkeit, our Plattform sollte den Einsatz in einer Vielzahl von Laboren und Anwendungen zu finden, und als besonders nützlich erweisen bei der Erleichterung der Analyse von Zellen und Stimuli, die in nur begrenzten Mengen sind.

Einleitung

Das Studium der Zellen in Kultur gehalten (in vitro-Analyse) hat einen wertvollen Einblick in die grundlegenden Prinzipien und molekularen Mechanismen, die komplexen biologischen Systemen und der menschlichen Gesundheit zur Verfügung gestellt. Die herkömmlichen Methoden für die Kultur, Anregung und Sammlung von Zellen für die Analyse, die Petrischalen und Mikrotiterplatten nutzen, wurden für die Studie von großen Populationen von Zellen (≥ 10 5) in Milliliter-Maßstab Kulturvolumina (≥ 0,1 ml) ausgelegt. Es gibt jedoch viele Fälle, in denen nur geringe Mengen von Zellen zur Verfügung stehen (z. B. primäre Zellen) oder kleine Zellpopulationen sind wünschenswert (zB Zell-zu-Zell-Variabilität in der Bevölkerung zu verringern), oder erforderlichen Reagenzien sind schwierig zu erhalten oder unerschwinglich teuer (zB gereinigte Zellen sezernierten Faktoren). Solche Probleme erfolgreich durch Verkleinerung Kultur Größe angesprochen werden, hat das den zusätzlichen Vorteil der Reduzierung des Verbrauchs allerReagenzien für die in-vitro-Analyse 1,2 erforderlich. Leider herkömmliche Geräte und Methoden unterstützen nicht präzise und reproduzierbare Manipulation von Mikro-Maßstab Kulturen und Mikrofluidik-basierte automatisierte Systeme, die derzeit zur Verfügung 3-11 sind zu komplex und spezialisiert für den routinemäßigen Einsatz von den meisten Labors.

In diesem Bericht beschreiben wir die Montage und Verwendung eines einfachen und vielseitigen Technologie-Plattform für die automatisierte Kultur, Anregung und Wiederherstellung von kleinen Populationen von Zellen (100 - 2.000 Zellen) in Mikro-Maßstab Bände (1 - 20 ul). Die Plattform-Architektur (Abbildung 1) ist modular aufgebaut: eine Reihe von fibronektinbeschichtete Mikrokapillaren ("cell Perfusionskammern" Modul) dient als Standort für die Errichtung, Wartung und Stimulation von Mikro-Maßstab Kulturen, und ein digitaler Mikrofluidik (DMF ) 12,13 Gerät mit "Transfer" Mikrokapillaren ("zentrale Drehscheibe" Modul) 14,15 Routen Zellen ausgestattetund Reagenzien zu und von den Perfusionskammern. DMF ermöglicht dem Anwender individuell ansprechen mehrere Tröpfchen gleichzeitig und zu ändern oder neu zu ordnen die Manipulationen (dh neu Probenaufbereitung Züge), ohne dass die Geräte-Hardware. Seine enorme Flexibilität in seiner jüngsten Entstehung als Schlüsseltechnologie in einer breiten Palette von Anwendungen, einschließlich der Zellkultur 16,17, Enzymassays 18,19, 20,21 Immunoassays, DNA-Analyse 22,23, Eiweiß Verarbeitung, 24,25 evident und klinischen Probe Verarbeitung. 26,27 Unsere zentrale Drehscheibe nutzt die inhärente Flexibilität DMF Geräte und weiter verbessert sie durch die Zugabe von mikrokapillaren Schnittstellen, die Möglichkeit zur Durchführung einer Teilmenge von Manipulationen (zB Zellkultur) in spezialisierten peripheren bietet Module, und nicht auf der DMF Gerät. Kompartimentierung der Verarbeitung Züge auf diese Weise vereinfacht auch Design der plaTForm Architektur (keine Notwendigkeit, ein Gerät, das DMF durchführen können alle Bearbeitungsschritte zu bauen) und erleichtert seine Entwicklung als neue Funktionen erforderlich sind (einfach Integration neuer Peripherie-Module je nach Bedarf). Transport von Zellen und Reagenzien innerhalb der zentralen Nabe wird durch Elektrobenetzung Kräfte durch sequentielle Aktivierung der Elektroden innerhalb des DMF Gerät erzeugt 13,28 angetrieben, Verkehr nach, von und innerhalb der Perfusionskammern wird von Druckänderungen, die durch eine hochpräzise Spritze erzeugten Strom versorgt Pumpe. Alle diese Bewegungen Fluid über eine einfache elektronische Schnittstelle gesteuert und automatisiert durch Verwendung von vorbestimmten Script.

Als repräsentatives Beispiel zeigen wir die Verwendung der Plattform für die Untersuchung der Transkriptionsaktivität hervorgerufenen Reaktionen in Immunzellen auf Provokation mit Bakterien (Abbildung 2). Die Durchführung dieser Experimente auf der Plattform konnten wir mit einer kleinen Anzahl von Zellen (~ 1.000 pro experimentell arbeitental Bedingung), zu minimieren Experiment zu Experiment Variabilität, konservieren Reagenzien und re-direct hands-on Arbeit. Angesichts der Vorteile, die es überträgt, sowie die Erreichbarkeit und die Vielseitigkeit, sollte diese Plattform in einer Vielzahl von Laboratorien und Anwendungen finden und doch besonders nützlich erleichtert Analyse von Zellen und Impulse, die in nur geringe Mengen sind.

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Protokoll

Diese allgemeine Protokoll wurde entwickelt, um Anwendung der Plattform für eine Vielzahl von Studien zu unterstützen; Aspekte spezifisch für die repräsentative Studie in diesem Bericht beschrieben sind in Klammern getrennt Abbildung 2 zeigt eine repräsentative Studie durchgeführt unter Verwendung des Protokolls.. Beachten Sie, dass in dem Protokoll, alle "anweisen"-Befehle durch die Verwendung von vorgegebenen Script automatisiert. Beachten Sie auch, dass Schritt 2 kann in parallel mit Schritt 1 (z. B. während der Schritte 1.7 und 1.8) durchgeführt werden, und dass Schritt 2.1 ist oft umgangen (weil gemustert / beschichtete DMF Gerät Platten können gewaschen und wieder verwendet werden, siehe Schritt 5.2) .

1. Montieren und Bestücken Sie die Zelle Perfusionskammern

  1. Bestreichen Sie die Innenflächen sterilisiert (autoklaviert) Mikrokapillaren (Fused-Silica; 679 od um, 534 um id; 15 cm lang) mit Fibronektin, durch Anweisen der Spritzenpumpe, um eine sterile Fibronektin-Lösung (30 ul von 50 ug / ml) zu ziehen in jedemmikrokapillaren, Inkubation (37 ° C für 2 Stunden), instruiert die Spritzenpumpe um die Lösung zu entziehen, und lassen die Mikrokapillaren trocken (Raumtemperatur (RT) für 6 Stunden).
  2. Verbinden Sie jeden fibronektinbeschichtete mikrokapillaren (Perfusionskammer) zu Polycarbonat-Schlauch (500 um od 100 um ID) und der Schlauch mit dem Multi-Port-Spritzenpumpe mit CapTite Armaturen (6 Perfusionskammern, 8-Port-Spritzenpumpe).
  3. Mit Klebeband, sichern den Körper jedes Perfusionskammer zu einem Heizblock auf gewünschte Temperatur (37 ° C).
  4. Tauchen die offenen Enden der Perfusionskammern in einem Behälter (microcentifuge Rohr oder Mikrotiterplatte) enthaltenden Zellen (P388D.1 murine Makrophagen) in frischem Wachstumsmedium suspendiert (RPMI-1640, 10% FBS, 500 Einheiten / ml Penicillin, 500 ug / ml Streptomycin) bei gewünschten Konzentration (10 6 Zellen / ml).
  5. Weisen Sie die Spritzenpumpe an Zellen (10 ul, 10 4 Zellen) in jede Perfusionskammer von genügend ai gefolgt ziehenr, um die Flüssigkeit Stecker (~ 4,5 cm) auf den Abschnitt, der an der Wärme Block bewegen.
  6. Lassen Sie die Zellen an der mit Fibronectin beschichteten Innenflächen der Perfusionskammern (37 ° C für 1 - 2 Stunden) zur Verfügung. In der Zwischenzeit, übertragen die offenen Enden der Perfusionskammern aus den Zellen Reservoir zu einem neuen Behälter mit frischem Wachstumsmedium.
  7. Nach dem Festhalten Zeitraum, weisen die Spritzenpumpe, um die Flüssigkeit Stecker (konditionierten Medien und ungebunden Zellen) zu senden, um zu verschwenden, zurückzutreten frischem Medium (10 ul), und folgen Sie mit genügend Luft, um die neuen flüssigen Steckern (frisches Medium) über die Haftposition Zellen.
  8. Weiter zur Durchführung von mittel-Börsen (dh wiederholen Sie Schritt 1.7) in regelmäßigen Abständen (alle 2 Stunden), bis die Zellpopulationen ausreichend äquilibriert und erweiterte (16 - 24 h von Mikro-Maßstab Kultur erzeugten Populationen von ~ 1.000 Zellen / Kammer) sind.

2. Fabricate die DMF Geräte-und zusammenbauen Hub Architektur

  1. Wie zuvor 14,29, beschrieben Muster der Bodenplatte des DMF Gerät mit sechsundvierzig Indium-Zinn-Oxid (ITO)-Elektroden (Treiber von Tröpfchen Betätigung) durch Photolithographie und Ätzen und Mantel mit 5 um von Parylene-C und 50 nm von Teflon-AF. Bilden die obere Platte des DMF Vorrichtung durch Beschichten einer unstrukturierten ITO Glassubstrat mit Teflon-AF, wie oben beschrieben.
  2. Mit Metalldruckfeder Rahmen fixieren DMF Platten in eine Polymergussfolie 14,30 mit Ausnehmungen, die eine 400 um Abstand zwischen den Platten zu halten; dieser Abstand mit dem Aktivierungselektrode Größe (2,5 mm 2) kombiniert, definiert das Tropfenvolumen (2,5 ul pro Elektrode). Beachten Sie, dass DMF Montage mit einfacheren Mitteln 24 erreicht werden kann.
  3. Einfügen teflonbeschichteten Übertragung Mikrokapillaren (360 um od, 100 um id; 3.5 - 4.0 cm) in den Raum zwischen den Platten DMF, Positionieren jeder an den Rand der zugehörigen Betätigung Elektrode erstrecken.
  4. Um die entgegengesetzte end von jedem Transfer mikrokapillaren Anbringung eines CapTite Montage.
  5. Rasten Sie die elektrischen Anschlüsse nach Spannung an die ITO-Elektroden liefern. Elektrode Aktivierung Sequenzen durch Verwendung eines computergesteuerten elektronischen Schnittstelle ausgeführt vorbestimmten Script automatisiert.
  6. Optional: Den zusammengesetzten DMF Nabe auf die Translationsbewegung eines Mikroskops (SZ-6145TR (Olympus, Japan)) mit einer Charge-Coupled Device (CCD)-Kamera (DCR-HC96 (Sony, Japan)) ausgestattet, um zu ermöglichen Tracking von Tröpfchen . 31.

3. Verbinden Sie die Perfusionskammern der DMF Hub und Stimulieren der Zellpopulationen

  1. Entfernen Sie die offenen Enden der Perfusionskammern aus dem Medium Reservoir (siehe Schritt 1.6) und fügen Sie sie in die CapTite Armaturen angebracht, um die Enden der Übertragung Mikrokapillaren der DMF-Hub (siehe Schritt 2.4).
  2. Weisen Sie die Spritzenpumpe, die Flüssigkeit Stecker (konditionierten Medien) in den Perfusionskammern zu verschwenden senden.
  3. Inst.ruct die DMF-Hub an Reiz ziehen (E. coli Biopartikel bei 100 ug / ml in frischem Medium mit 0,1% Pluronic F127 w / v) aus einer On-Board-Speicher und liefern ein Tröpfchen von geeigneter Größe (10 ul) zu jedem Transfer Mikrokapillare . Die On-Board-Reservoire von zylinderförmigen Kammern (1,5 x 1,5 cm je) besteht und mit dem DMF Hub über einen Schlauch.
  4. Weisen Sie die Spritzenpumpe zu zeichnen der Stimulus-Stecker in den Transfer Mikrokapillaren und folgen mit genügend Luft, um die Stecker in den Zellpopulationen in den Perfusionskammern positionieren.
  5. Inkubieren der Zellen mit Stimulus (37 ° C für 1 - 4 Stunden). Optional: Exchange für neue Impulse (dh wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.4) in regelmäßigen Abständen.

4. Beenden Stimulation und Recover Zelllysate für Analysis

  1. Optional: Wenn ein Post-Stimulation Zeitraum erforderlich ist, tauschen die Stimulus-haltigen Flüssigkeit Stecker für frisches Medium (dh wiederholen Sie die Schritte 3,2-3.4, Substitution frischem Medium für Stimulus) und weiter inkubieren und nach Bedarf austauschen.
  2. Austausch der Flüssigkeit in den Stecker Perfusionskammern für Waschpuffer (Prelude Direkte Lysis Buffer Modul B) (dh wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,4, Substitution Waschpuffer für Stimulus) und inkubieren nach Bedarf (5 min).
  3. Tauschen Sie die Flüssigkeit Stecker (Waschpuffer) für die Lyse-Lösung (Prelude Direkte Lysemodul Puffer A mit 0,1% Pluronic F127 w / v) (dh wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,4, Substitution Lyselösung für Stimulus) und inkubieren nach Bedarf (5 min) .
  4. Weisen Sie die Spritzenpumpe, die Flüssigkeit Stecker (Zelllysate) mit dem DMF-Hub senden.
  5. Demontieren Sie die DMF-Hub, entfernen Sie die obere Platte des DMF-Gerät (mit Pflege nicht auf die Platte seitlich kippen, da dies in Tropfenform Durchmischung führen kann), und sammeln Sie die Lysate mit einem Pipetman oder Spritze für off-Plattform Analyse (Genexpressionsanalysen über qPCR).

5. Saubere Plattform für HardwareRe-use

  1. Tauchen Sie den Transfer Mikrokapillaren und CapTite Armaturen in 10% Bleichmittel (v / v in Wasser) für 10 min bei RT, gut mit deionisiertem Wasser abspülen und trocken unter Verwendung von Stickstoffgas.
  2. Tauchen Sie die DMF Gerät Platten in 10% Bleichmittel für 10 min bei RT, gründlich mit Isopropanol gefolgt von deionisiertem Wasser und trocken unter Verwendung von Stickstoffgas durch Backen bei 160 ° C für 10 min folgte.
  3. Die Spritze Pumpe Polycarbonat Schläuche, und der DMF Geräts Polymer Besetzung und Kompression Rahmen kann ohne Reinigung wieder verwendet werden. Die Perfusionskammer Mikrokapillaren werden nach jedem Experiment verworfen.

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Ergebnisse

Als Demonstration der automatisierten Plattform, haben wir es für die Durchführung einer Studie, in der kleinen Populationen von Immunzellen im Mikro-Maßstab gezüchtet wurden, mit Bakterien herausgefordert, und lysiert für off-Plattform Analyse von pro-inflammatorischen Reaktionen (Abbildung 2 ).

Jeder der sechs Zellen Perfusionskammern wurde mit 10 4 Immunzellen (P388D.1 murine Makrophagen) in 10 ul Wachstumsmedium resuspendiert ausgesät. Nach einer Einhalt...

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Diskussion

Wir haben eine einfache und vielseitige automatisierte Plattform für die Mikro-Maßstab Zellkultur und Stimulation Experimente entwickelt. Die Plattform ermöglicht es uns, mit kleinen Mengen und Kultur Zellpopulationen (1 - 20 ul und 100 - 2.000 Zellen pro Kammer) arbeiten; Kultur Größen weiter durch Verwendung von Mikrokapillaren von kleineren Durchmesser reduziert werden konnte. Arbeiten bei diesen Skalen reduziert die Kosten für Routine-Untersuchungen und Studien, die machbar macht Gebrauch von wertvoll...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Die Autoren danken Ronald F. Renzi und Michael S. Bartsch für ihre Beiträge zur Gestaltung und Entwicklung von DMF-Geräten und dem DMF-Hub. Diese Forschung wurde vollständig durch das Laboratory Directed Forschungs-und Entwicklungsprogramm bei Sandia National Laboratories unterstützt. Sandia ist ein Multi-Programm-Labor verwaltet und von Sandia Corporation, eine hundertprozentige Tochtergesellschaft von Lockheed Martin Corporation, betrieben für das US Department of National Nuclear Energy Security Administration unter Vertrag DE-AC04-94AL85000.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Prelude Direct Lysis ModuleNuGEN1400-24
Trypan Blue (0.4% w/v)GIBCO15250-061
Cell StripperCellgro25-056-C1
Ovation PicoSL WTANuGEN3310-048
Agencourt RNAClean XPBeckman Coulter GenomicsA63987
pHrodo BioParticlesInvitrogenP35361
CCL4 TaqMan qRT-PCR assayApplied BiosystemsMm00443111_m1
CCL5 TaqMan qRT-PCR assayApplied BiosystemsMm01302428_m1
PTGS2 TaqMan qRT-PCR assayApplied BiosystemsMm00478374_m1
TNF TaqMan qRT-PCR assayApplied BiosystemsMm00443258_m1
GAPDH TaqMan qRT-PCR assayApplied BiosystemsMm99999915_g1
Pluronic F127Sigma Chemical2594628
Fluorinert FC-40Sigma Chemical51142-49-5
Parylene C dimerSpecialty Coating Systems28804-46-8
Teflon-AFDuPontAF1600
Polyimide tapeULINES-11928
Indium tin oxide (ITO) coated glass substrates Delta TechnologiesCB-40IN-1107
DMF hub Teflon-coated fused-silica microcapillariesPolymicro TechnologiesTSU100375
Perfusion chamber microcapillariesPolymicro TechnologiesTSP530700
Tubing and microcapillary fittingsSandia National Laboratories
Polycarbonate tubingParadigm OpticsCTPC100-500-5
8-port precision syringe pump equipped with 30 mm (500 μl capacity) syringesHamilton Company54848-01
Parylene-C vapor deposition instrumentSpecialty Coating SystemsPDS 2010 Labcoter 2
High-voltage function generatorTrek615A-1 615-3
MVX10 microscopeOlympusOptional (facilitates tracking of droplets on DMF hub)
QIClick digital CCD cameraQImagingQIClick-F-CLR-12Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub)

Referenzen

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