Fütterung von Zecken auf Tiere, die zur Übertragung und Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Zusammenfassung

Lyme-Borreliose ist die am häufigsten berichteten Vektor-übertragene Krankheit in Nordamerika. Der Erreger ist Borrelia burgdorferi Spirochäten Bakterium übermittelt durch Schildzecken. Übertragung und Erfassung von Infektionen in Tiermodellen durch die Verwendung von Zecken Fütterung, die wir hier beschreiben optimiert.

Zusammenfassung

Die Übertragung der Erreger der Lyme-Borreliose, Borrelia burgdorferi, tritt durch die Anbringung und Blut Fütterung von Ixodes Zecken auf Säugetierarten Gastgeber. In der Natur kann diese zoonotischen bakteriellen Erreger eine Vielzahl von Reservoirwirten verwenden, aber die weiß-footed Maus (Peromyscus leucopus) ist der wichtigste Reservoir für die Larven-und Nymphen Zecken in Nordamerika. Menschen sind Neben Gastgeber am häufigsten infiziert mit B. burgdorferi durch den Biss von Zecken im Nymphenstadium. B. burgdorferi passt seine Hosts am enzootische Zyklus, also die Fähigkeit, die Funktionen dieser Spirochäten und deren Auswirkungen auf Säugetierwirte erforschen erfordert die Verwendung von Haken Fütterung. Darüber hinaus ist die Technik der Xenodiagnose (unter Verwendung des natürlichen Vektor für Erkennung und Wiederherstellung eines Infektionserregers) hat sich als nützlich in Studien der kryptischen Infektion. Um diese zu erhalten, Nymphen Zecken Hafen B. burgdorferi,Zecken werden live Spirochäten in der Kultur durch Kapillaren zugeführt. Zwei Tiermodelle, Mäusen und nicht-menschlichen Primaten, werden am häufigsten für die Lyme-Borreliose Studien mit Zeckenzeit verwendet. Wir zeigen die Methoden, mit denen diese Zecken können auf zugeführt werden, und von den Tieren entweder für Infektion oder Xenodiagnose erholt.

Einleitung

Im Jahr 2011, Lyme-Krankheit war die 6. häufigste Landesmeldepflichtige Krankheit in Nordamerika ( http://www.cdc.gov/lyme/stats/index.html ). B. burgdorferi ist ein vielseitiges Mikrobe, genetisch und antigene (Übersicht in ^1). Seine genetische Konstitution umfasst eine große (> 900 kB) Chromosom und bis zu 21 Plasmide (12 lineare, kreisförmige 9), die mit Plasmid-Gehalt unter unterschiedlichen Isolaten. Viel ist über diese Spirochäten gelernt werden, da mehr als 90% der Plasmid-offenen Leserahmen mit keinem der bekannten bakteriellen Sequenzen sind ^2,3. B burgdorferi bietet eine Vielzahl von Antigenen als mögliche Ziele der Wirtsimmunität. Doch eine unbehandelte Infektion oft anhält. Das Zusammenspiel der Spirochäten mit der Zecke Milieu und dem Wirbel Host-Umgebung erfordert Anpassung von B. burgdorferi während des Infektionsprozesses. Mehrere Plasmid-kodiertenGene sind dafür bekannt, unterschiedlich in Reaktion auf Änderungen der Temperatur, des pH, der Zelldichte und sogar Stufe des Lebenszyklus der Zecke ^4-8 ausgedrückt.

Die Studie von B. burgdorferi Anpassung während seiner Enzootische Zyklus und Wirtsreaktionen nach der Infektion durch den natürlichen Weg beruht auf der Fähigkeit, Zecken auf geeigneten Tiermodellen zu ernähren. Solche Studien sind mit den technischen Herausforderungen der Erzeugung von Zecken, die B. Hafen erfüllt burgdorferi und die Sicherstellung der effizienten Übertragung und / oder Fütterung von Zecken auf dem Modell-Host. Darüber hinaus ist die Rückhaltung und Gewinnung von infizierten Zecken wesentlich. Unter den verwendeten Modelle sind Mäusen und nicht-menschlichen Primaten, von denen jeder dient als wertvolles Werkzeug bei Lyme-Borreliose Forschung. Wie mit dem weiß-footed Maus, die ein natürliches Reservoir für B. Host ist burgdorferi, ist die Labormaus ein sehr anfällig Host, persistierende Infektion unterstützt von B. ^{burgdorferi-9.} Folgende Infektion Krankheit anfälligen Mäusen, wie den C3H-Stamm, der Spirochäten zu verbreiten, um mehrere Gewebe, einschließlich der Haut, der Blase, Muskeln, Gelenke und Herz. Entzündliche Reaktionen auf die Infektion erkrankten Herz-und Gelenkgewebe führen. Während die Spirochäten bestehen in diesem Wirt und infektiös bleiben können entzündliche Läsionen intermittierende werden, nicht anders als der Prozess beim Menschen. Das Mausmodell ist damit vorgesehen viel Informationen über B. burgdorferi-induzierten Pathologie, einschließlich Arthritis und Karditis und Host-Immunantworten ^10-12. Aus der Perspektive des Erregers sind bestimmte Gene in Säuger Infektion differentiell exprimiert wird, da einige notwendige zur Übertragung von der Zecke Vektor ^13-21 haben.

Obwohl mehrere Tierarten verwendet worden, um die Lyme-Krankheit ²² studieren, Rhesusaffen am ehesten imitieren die Multi-Organ-Charakter der menschlichen Krankheit ^23. Im Gegensatz zu anderenTiermodelle, die Breite von Krankheitserscheinungen wie Erythema migrans, Karditis, Arthritis und Neuropathien des peripheren und zentralen Nervensysteme bei Makaken beobachtet. Bei Mäusen, die Reservoirwirt für B. burgdorferi, variiert Krankheit durch Mausstamm und ²⁴ Jahren, während der frühen und späten verbreitet Manifestationen sind selten ^9. Darüber hinaus sind andere Nagetiere, Hasentiere, und Eckzähne alle scheitern zu neurologischen Krankheit von B. zeigen burgdorferi-Infektion ^25. Wichtig ist, Makaken zeigen Anzeichen, die charakteristisch für alle drei Phasen der Lyme-Borreliose, nämlich früh lokalisierte, Früh verbreitet, und im Spätstadium Lyme-Borreliose sind ^26-28. Erythema migrans (EM) ist gedacht, um in 70-80% der Fälle bei Menschen ²⁹ auf, und ist auch in Rhesusaffen ^28,30 ersichtlich. Nach der Infektion verbreiten die Borrelien aus der Impfstelle, mehrere Organe. Spirochäten DNA wurde in Skelett mu erkanntscles, Herz, Blase, periphere Nerven-und Plexus sowie im zentralen Nervensystem (Gehirn-, Hirnstamm und Kleinhirn, Rückenmark und Dura mater) ^31.

Kreuzen Sie ernähren sich von Mäusen, wurde von uns und anderen Forschungsteams wurden für die Vermehrung von Zecken Kolonien genutzt, im Vorratsbehälter Kompetenz studiert ^32-36 und in den Studien von B. burgdorferi Pathogenese ^37-40. Diese Technik ist auch für Xenodiagnose und Prüfung von Impfstoffwirksamkeit bei Mäusen ^41-44 verwendet. Wir haben eingespeist Ixodes Zecken auf nicht-menschlichen Primaten für die Modellentwicklung ^28, eine Studie über die Wirksamkeit des Impfstoffes ⁴⁵ und für Xenodiagnose in der Beurteilung der Persistenz Post-Antibiotika-Behandlung ^46. Zecken diesem Hafen B. burgdorferi kann in einem natürlichen Zyklus, indem Enzootische Larven auf infizierten Mäusen und mit den Nymphen für Studien, wie die Borrelien werden durch die Lebensphasen übertragen beibehalten werden. In diesem BerichtWeisen wir auf, wie man Zecken mit Wildtyp-oder Mutanten-B-Infektion erzeugen burgdorferi, mit Kapillarrohr-Fütterung. Dies kann auch durch Mikroinjektion ⁴⁷ und ⁴⁸ durch Eintauchen durchgeführt werden. Der Zweck der Einführung von künstlichen B. burgdorferi in Zecken sein kann, Mutanten-Stämme, deren Übertragbarkeit ist nicht bekannt, zu untersuchen, um eine Gruppe von Zecken mit einer hohen Infektionsrate zu erzeugen und Fehlerpotential zu reduzieren, indem sie eine saubere und sonst nicht infizierten Zecke Kolonie. Darüber hinaus zeigen wir, Tick Fütterung auf Mäuse und nicht-menschlichen Primaten, um Eindämmung und Rückgewinnung von Zecken voll zu gewährleisten. Die Verwendung von Haken Fütterung ist für zukünftige Studien der Immunantwort auf B. burgdorferi-Infektion, mögliche Lyme-Impfstoff Wirksamkeit und Xenodiagnose zum Nachweis von okkulten Infektionen.

Protokoll

Eine experimentelle Umriss Zeckenimpfung und Fütterung bei Tieren für die Lyme-Borreliose Forschung ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Impfen Nymphen Ixodes Zecken mit B. burgdorferi Mit Kapillarrohr-Fütterung

Bei der Durchführung von Manipulationen mit Zecken werden weiße Laborkittel mit elastischen Ärmel, Handschuhe und Einweg füllig Mützen getragen.

1. Unser Verfahren ist eine modifizierte Version von dem durch Broadwater et al. ⁴⁹ gemeldet. Bereiten Kapillaren durch Erhitzen und Ziehen Pasteur Pipetten zu brechen Dünne Verwendung einer Pipette Magnet. Mit einer Pinzette und Binokular, brechen Sie die Tipps zur optimalen Durchmesser (ca. 0,2 mm). Ein Rohr standardisiert auf Mundwerkzeuge der Zecke Größe als der Bemessung. Ein Gesichtsschutz sollte bei der Vorbereitung der Pipetten getragen werden.
2. Wachsen B. burgdorferi zwischen 2-8 × 10 ⁷ / ml (mid-log-Phase) in BSK-H-Medium (Sigma) conhaltige 6% Kaninchenserum.
3. Verwenden Nymphen Zecken, die bei 23 ° C für 4-6 Wochen nach der Häutung der Larven abgelegt wurden. Ort Zecken auf eine kleine 60 x 15 mm Petrischale mit einem doppelseitigen Klebeband auf der äußeren unteren Oberfläche der Schale. Legen Sie die Zecken ventralen Seite nach oben.
4. Tauchen Sie die Kapillare Spitze in der B. burgdorferi Kulturröhrchen nach dem Mischen. Legen Sie die Kapillare über das Hypostom der Zecke Mundteile mit einem Binokular. Verwenden Knetmasse, um den Schlauch zu fixieren, wie in 2A gezeigt.
5. Legen Sie die Petrischalen mit aufgeklebten Zecken in einem großen, klaren Kunststoffwanne für einen zusätzlichen Grad des Einschlusses. Nasse Handtücher werden hinzugefügt, um Feuchtigkeit zu versorgen. Zeigen die Zecken in einem 37 ° C warmen Inkubator für 30 Minuten-2 Stunden, bis der Defäkation ist offensichtlich. Dies zeigt, dass die Medien, die Spirochäten wurde durch die Zecke übergeben.
6. Seien Sie die Zecken für 2-4 Wochen bei 23 ° C, um die Anpassung an die Umwelt Tick vor der Fütterung zu ermöglichensie auf Tiere.

2. Infizieren Mäuse mit B. burgdorferi von Tick

1. Verdünnen Ketamin Lager 1:10 in sterilem Wasser. Betäuben jeder Maus mit 100 mg / kg Ketamin durch intraperitoneale Injektion mit einer Tuberkulinspritze
2. Sobald die Maus vollständig betäubt wird, rasieren Sie die Maus von den Ohren bis zur Mitte zurück mit einem feinen (Remington glatt und seidig) Elektro-Trimmer.
3. In einem weißen Pfanne ohne andere Gegenstände in der Nähe, übertragen Sie die Nymphen Zecken (Hafen, dass B. burgdorferi) mit einem angefeuchteten Pinsel auf den haarlosen Bereich der Maus. Alternativ können nicht infizierten Zecken auf Mäuse für Xenodiagnose von Mäusen mit verdächtigen Infektion platziert werden. Die Verwendung eines sauberen, weißen Oberfläche Zecken Platzierung wird sichergestellt, dass alle Zecken ungebunden ist leicht ersichtlich.
4. Platzieren Sie die Maus in spezialisierten Käfighaltung (Käfighaltung Allentown, Allentown, PA). Die Käfighaltung besteht aus einem Edelstahl-Grill aus dem Boden des Käfigs erhöht. Ter Käfig oben wurde von unserer hauseigenen Werkstatt modifiziert, um den Flaschenhalter genug, um freie Bewegung der Maus unterhalb erlauben zu erheben. Die Pfanne wird mit etwa ½ Zoll von Wasser zu stoppen alle Zecken, die aus Mäusen (3A) fallen gefüllt. Um die Gefahr der Unterkühlung zu minimieren, wiederverwendbare Wärmekissen, Mikrowelle vor verwenden, werden unter den Käfigen, bis Mäuse aus der Narkose aufwachen komplett. Tiere sind oft Ataxie, als sie aus der Narkose und reiben gegen Lebensmittel-und Wasserschalen zu erholen, so müssen diese entfernt werden. Der Wasserstand ist niedrig genug, um Gliedmaßen von Mäusen aus Untertauchen verhindern.
5. Setzen Sie den Käfig in einem Fach, das mit Tangle-Trap-Paste (Contech, Victoria, BC, Kanada) und Band gesäumt wurde, um den Einschluss von Arthropoden zu gewährleisten. Die Mäuse werden einzeln in Käfigen gehalten und kontinuierlich während der Dauer der Anästhesie beobachtet.
6. Innerhalb von 2 Stunden, wenn Mäuse sind völlig aus der Narkose erwacht, das Essen Schale und Wasserflasche sind in den Käfig ersetzt. Nach 24 Stunden, das Gehäuse Bereicherung, bestehend aus einem Kunststoff-Hütte und Nylabone ersetzt wird.
7. Nach 3, 4 und 5 Tage, prüfen Sie die Maus, Käfig und Käfig Wasser gefüttert Zecken. Der Käfig Wasser wird durch einen weißen Metallwanne gesiebt (zB "Goldwaschen"). Spülen gefüttert Zecken in sauberem Wasser und lagern in Plastikdosen (Abbildung 3B). An den Tagen 3 und 4 ersetzen Wasser im Käfig mit sauberem Wasser. Am Tag 5, überprüfen Sie nicht nur den Käfig, aber die Maus gründlich nach Zecken absuchen. In der Regel von dieser Stelle alle Zecken zugeführt und die Mäuse können regelmäßige Käfighaltung zurückgegeben werden.
8. Zeigen alle Abfälle aus den Mäusekäfige, einschließlich Flüssigkeiten, Biohazard Behälter für Autoklavieren und Entsorgung. Halten Sie ein Protokoll von der Anzahl der Zecken auf Mäuse und solche, jederzeit wiederhergestellt platziert.

3. Füttern Ticks auf nicht-menschlichen Primaten für die Infektion mit B. burgdorferi oder Xenodiagnose

1. Bereiten Sie die Zecke Aufnahme-Vorrichtung: Schneiden Sie ein 1 ¾ Zoll Durchmesser Kreis in der 3-Zoll-x3-Zoll-LeFlap (Flap) mit einem sauberen Skalpell und die Mess-Reiseführer. Verwenden Sie den Ausschnitt als Vorlage, um Kreise von identischer Größe in der Biatane Schaum und Duoderm geschnitten. Der Schaum wird zur Klappe über der Oberfläche der Haut erhöhen und verhindern, dass mögliche Zerschlagung der Zecke. Die Duoderm fügt eine weitere Schicht der Polsterung und überlagert die Kanten der Aufnahme-Vorrichtung für zusätzliche Sicherheit durch Zecken Flucht. Ein Diagramm der Aufnahme-Vorrichtung ist in Fig. 4 dargestellt.
2. Veterinär Personal wird das Tier mit 5-8 mg / kg Telazol durch intramuskuläre Injektion betäuben.
3. Clip das Haar des Tieres mit elektrischen Trimmer (Oster) mit der Größe 40 Messern ausgestattet. Alle Bereiche, die von der Jacke abgedeckt werden, werden abgeschnitten: Rücken, Front, Oberarme. Mit Rasierschaum und Dual-Blade Einwegrasierer, dicht eine Fläche von ca. 25 cm x 20 cm vertikal horizontal rasieren. Wischen Sie mit einem feuchten Papiertüchern und trocken blasen mit geringer Wärme, um die Haut zu trocknen.
4. Legen Sie die Klappe auf ter Tierrücken, knapp unterhalb des Schulterblatts, auf jeder Seite der Wirbelsäule. Verwenden Sie eine Markierung, um den Kreis an dieser Stelle verfolgen. Bereiten Sie den Hautbereich, um den Kreis von mit SkinPrep abwischen. Dadurch wird Öl in die Haut, die die Haftung von Klebstoff-und Containment-Geräte beeinträchtigen könnten. So dass etwa 1 cm Umfang der Raum um den Kreis, eine Schicht der Hautkleber (SkinBond) mit einer Breite von ca. 4 cm.
5. Entfernen Sie die Schutzfolie von der Biatane Schaum und bringt die Haut in die entsprechende Stelle. Die Tiere werden wieder von Tierärzten mit 5 mg / kg Telazol betäubt. Dichten Sie die Ränder mit Hautkleber und Hypafix Band. Entfernen Sie die Schutzfolie von der Klappe und bringen auf dem Biatane. Zeigen Hypafix Band um die Kanten des LeFlap, dann kleben Sie die Maschen des Klappen und legen Sie die Jacke auf das Tier. Band-und Tangle-Trap-Paste wird auf dem Boden in einem Umkreis um den menschlichen Primaten Käfighaltung für zusätzliche Sicherheit angewendet.
6. Um die Auswirkungen zu minimieren chemicALS in Schritt 3.4 auf Pump Fütterung verwendet wird, werden die Zecken hat 24 Stunden nach der Aufnahme-Vorrichtung an Ort und Stelle ist. An diesem Punkt wird die Sicherheit der Vorrichtung inspiziert und auch verstärkt werden, wenn nötig. Typischerweise werden 20 nüchterne Nymphen (4-8 Wochen nach der Häutung der Larven) auf die Haut im Gerät mit einem Pinsel aufgenommen.
7. Entfernen Sie die Schutzfolie aus dem Netz der Klappe und verschließen Sie sie fest. Schließlich entfernen Sie die Duoderm Unterstützung, um Kleber freizulegen, und legen Sie oben auf der Aufnahme-Vorrichtung. Fügen Sie ein Stück Hypafix Band über das offene Mesh-Kreis und die Jacke ersetzen. Die fertige Behältervorrichtung ist in Fig. 5A gezeigt.
8. Nach 5 Tagen, die Tiere zu betäuben, wie oben und die Jacken entfernt. Entfernen Sie das Band erste Zecke Fütterung durch die Maschen (5B) zu inspizieren. Ziehen Sie vorsichtig die Duoderm weg von der Klappe.
9. Ziehen Sie den Netzabschnitt an den Rändern, um Zugang zu den Zecken bereitzustellen. Fed Zecken werden häufig in der Nähe oder im Internet unterder Schaum Kreis (Fig. 5C) und werden entfernt und mit einem Pinsel in reinem Wasser gegeben. Entfernen Sie das Gerät einmal alle sichtbaren gefüttert Zecken gesammelt (5D).

Hinweis: Normalerweise können die Rückhaltevorrichtung einfach von der Haut abgezogen werden. Wenn die Haftung ist stark und könnte die Haut schädigen, wird Unisolve Lösungsmittel auf den Bereich für schonende Entfernung aufgetragen. Die Haut wird mit Isopropanol abgewischt und Zecken werden bei 23 ° C gelagert Wenn für die Infektion verwendet wird, kann die Zecken zerkleinert, um die Nummer, die B enthalten bestätigen burgdorferi. Wenn für Xenodiagnose verwendet wird, werden die Zecken für 1-3 Wochen vor der Analyse der Mitteldarminhalt gehalten.

Ergebnisse

Nach der Beendigung der kapillaren Zuführung, die Zecken werden typischerweise bei 23 ° C für 2-3 Wochen ruhen, bevor sie an Tieren für die Übertragung zugeführt. Verwendung der kapillaren Zufuhr Technik haben wir festgestellt, dass über 90% des zugeführten Zecken Hafen B. burgdorferi. Der Prozentsatz der positiven Zecken wird durch Waschen bestimmt Zecken in Wasserstoffperoxid und Ethanol, dann locker und in sterilem PBS mit einem Mikrozentrifugenröhrchen förmige Stößel. Die Mitteldarminhalt in die...

Diskussion

Um Zecken diesem Hafen B zu erhalten burgdorferi für nachfolgende Untersuchungen kann die Zecken werden: (1) bei infizierten Mäusen im Larvenstadium zugeführt wird, (2) in B. taucht burgdorferi Kulturen entweder an der Larven oder Nymphenstadium ^48, (3) mit B. mikroinjizierten ^{burgdorferi-47,} oder (4)-Kapillare zugeführt B. ^{burgdorferi-49.} Während jedes dieser Verfahren hat den Zweck, zu gewährleisten, dass ein großer ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
BSK-H	Sigma	B-8291
Ketamine HCl
Tangle Trap coating Paste	Ladd research	T-131
SkinPrep	Allegro Medical Supplies	177364
LeFlap, 3" x 3"	Monarch Labs
Hypafix tape	Allegro Medical Supplies	191523
SkinBond	Allegro Medical Supplies	554536
UniSolve	Allegro Medical Supplies	176640
Biatane Foam, adhesive 4"x4"	Coloplast	3420
DuoDerm CGF Dressing - 4" x 4", (3/4)" adhesive border	Convatec	187971
Nonhuman primate jackets with flexible 2" back panels; add drawstrings at top and bottom	Lomir Biomedical Inc.
EQUIPMENT
Pipet puller	David Kopf Instruments	Model 700C
Dark field microscope	Leitz Wetzlar	Dialux
Dissecting microscope	Leica	Zoom 2000
Mouse caging	Allentown caging