Modelle und Methoden zum Transport von Drug Delivery Systems über zelluläre Barrieren Bewerten

Zusammenfassung

Viele therapeutische Anwendungen erfordern sicheren und effizienten Transport von Arzneistoffträger und ihre Ladungen über zelluläre Barrieren im Körper. Dieser Artikel beschreibt eine Anpassung der etablierten Verfahren, um die Geschwindigkeit und der Mechanismus der Medikamententransport Nanoträger (NCS) über zelluläre Barrieren, wie der gastrointestinalen (GI) Epithel auszuwerten.

Zusammenfassung

Sub-Mikrometer-Träger (Nanotransporter; NCs) verbessern die Wirksamkeit von Arzneimitteln durch Verbesserung der Löslichkeit, Stabilität, Zirkulationszeit, Targeting, und loslassen. Zusätzlich ist für sowohl die orale Verabreichung von therapeutischen NCs in den Kreislauf und den Transport von Blut in Gewebe, in denen eine Intervention erforderlich ist Laufen Zellbarrieren im Körper. NC Transport durch Zellbarrieren wird erreicht durch: (i) der parazellulären Weg, über vorübergehende Unterbrechung der Übergänge, die benachbarte Zellen oder (ii) die transzelluläre Route, wo Materialien durch Endozytose internalisiert, in dem Zellkörper transportiert und sezerniert verzahnen auf der gegenüberliegenden Zelloberfläche (transyctosis). Liefer über zelluläre Barrieren können durch Kopplung Therapeutika oder ihre Träger mit Targeting-Mittel, die spezifisch an Zelloberflächenmarker in Transport beteiligt binden erleichtert werden. Hier stellen wir Methoden, um das Ausmaß und den Mechanismus der NC-Transport über ein Modell Zellbarriere, whi messenLm besteht aus einer Monolage von gastrointestinalen (GI) Epithelzellen auf einer porösen Membran in einem Transwell-Einsatz angewachsen. Bildung einer Permeabilitätsbarriere durch Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) transepithelialen Transport einer Kontrollsubstanz und Immunfärbung von tight junctions bestätigt. Als Beispiel sind ~ 200 nm NCs Polymer verwendet, das eine therapeutische Ladung tragen und mit einem Antikörper, der ein Zelloberflächen-Determinante zielt beschichtet. Der Antikörper oder das therapeutische Ladung mit ¹²⁵ I-Radioisotop zur Verfolgung markiert und etikettiert NCs mit der oberen Kammer über die Zellschicht für unterschiedliche Zeiträume zugesetzt. NCs zu den Zellen und / oder an der darunterliegenden Kammer transportiert assoziiert erkannt werden. Messung von freiem ¹²⁵ I ermöglicht Subtraktion des abgebauten Fraktion. Die parazellulären Weg ist durch die potenzielle Veränderung von NC Transport zu den oben beschriebenen Sperrparameter verursacht beurteilt. Transzellulären Transport is, indem sie die Wirkung der Modulation Endozytose und Transzytose Wege bestimmt.

Einleitung

Zellbarrieren im Körper als Gateway zwischen der äußeren Umgebung und Innenfächer. Dies ist der Fall für die epitheliale Auskleidung Trennen des außen freiliegenden Oberfläche des Magen-Darm-Trakt (GI) und den Blutkreislauf ^1-3. Zellbarrieren auch stellen die Schnittstelle zwischen dem Blutstrom und dem Parenchym und zellulären Komponenten von Geweben und Organen. Dies ist der Fall für die innere endotheliale Auskleidung der Blutgefäße, wie beispielsweise Blut-Lungen-Schranke, Blut-Hirn-Schranke, etc. ^1. Die Fähigkeit, diese Zellbarrieren im Körper zu durchlaufen ist entscheidend für die effiziente Abgabe von therapeutischen und diagnostischen Mitteln in den Kreislauf und Gewebe / Organen, wo Eingreifen erforderlich ist.

Die Lieferung von therapeutischen oder diagnostischen Mittel zu verbessern, können diese Verbindungen in sub-Mikrometer Nanoträger (NCS) geladen werden. Diese Arzneimittelabgabeträger kann mit einer Vielzahl von formuliert werdenChemie und Strukturen des Drogen Löslichkeit, Schutz, Pharmakokinetik, Freigabe, ^4,5 und Stoffwechsel zu optimieren. Nanokristalle können auch mit Affinität oder Targeting-Einheiten (z. B. Antikörper, Peptide, Zucker, Aptamere etc.) funktionalisiert werden, um die Haftung zu Bereichen des Körpers, wo die therapeutische Wirkung benötigt wird ^2,6 zu erleichtern. Targeting von NCs Determinanten auf der Oberfläche der Zellbarrieren ausgedrückt kann der Transport noch weiter zu erleichtern, in und / oder über diese Auskleidungen ^2,6.

Die Rolle der selektiven Transport von Stoffen zwischen zwei Umgebungen erfordert bestimmte einzigartige Eigenschaften unter Zellschichten. Eine solche Funktion ist die Zellpolarität ist, wobei die apikale Membran, die das Lumen der Hohlräume hängt von der basolateralen Membran auf das Gewebe Interstitium orientiert, in Bezug auf Membranmorphologie und Zusammensetzung von Lipiden, Transporter, Rezeptoren und ^2. Ein weiteres Merkmal beinhaltet inter junctions, die benachbarte Zellen. Regulierung der Proteine, die Tight Junctions, insbesondere junctional Adhäsionsmoleküle (Staus), Occludine und Claudinen bilden, modulieren die Barrierefunktion, um selektiv zu ermöglichen oder nicht Transport von Substanzen zwischen den Zellen, wie parazellulären Transport bekannt, die den Durchgang von Material aus dem Lumen der basolateralen Raum ^3. Bindung von vielen natürlichen und synthetischen Elementen (Leukozyten, Moleküle, Partikel, und Wirkstoffabgabesysteme), um Zellbarrieren im Körper Zellöffnung Übergang zu induzieren, die flüchtig und relativ harmlose oder mehr verlängert werden kann, und daher unsicher Zutritt unerwünschten Substanzen über die Barriere ^2,5,7-9. Folglich kann dieser Weg durch das Messen der transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) und passive parazelluläre Diffusion von Molekülen (hierin als parazelluläre Leckage) bewertet werden, wobei verringerten Widerstand auf einen elektrischen Strom oder eine erhöhte parazelluläre Leckage eines inert Verbindung in der basolateralen Raum geben Eröffnung der Zellverbindungen, bzw. ^5,10,11. Um diese Verfahren zu ergänzen, kann jeder der oben aufgeführten tight junction-Proteine ​​gefärbt werden, um ihre Integrität zu beurteilen, wo Färbung sollte an den Zell-Zell-Grenzen auf der ganzen Peripherie der Zelle konzentriert ^5,10,12 erscheinen.

Alternativ Arzneimittelabgabesystemen, die spezifische Zelloberflächen-Determinanten, wie diejenigen, die Clathrin-beschichteten Vertiefungen oder kolbenförmigen Einstülpungen Membran genannt Caveolae assoziiert Ziel kann vesikuläre Aufnahme in die Zellen durch Endozytose auszulösen, wodurch ein Weg für die Arzneimittelabgabe zu intrazellulären Kompartimenten ^{5, 13.} Darüber hinaus kann die Endozytose von Vesikeln mit dem Menschenhandel über die Zellkörper für die Freigabe an der basolateralen Seite, ein Phänomen, wie transyctosis bekannt oder transzellulären Transport ¹⁴ führen. Daher kann die Kenntnis der Kinetik und Mechanismus der Endozytose verwendet, um intrazelluläre ein auszunutzennd transArzneimittelAbgabe, die einen relativ sicheren und kontrollierten Art der Verabreichung bietet gegenüber den parazellulären Weg. Der Mechanismus der Endozytose kann mit Modulatoren der klassischen Wege (Clathrin-und Caveolin-vermittelte Endozytose und Makropinozytose) oder nicht-klassischen Wege ausgewertet werden ((CAM)-vermittelte wie bei der Zelladhäsionsmolekül Endozytose) ^5,13,15 .

Während intrazellulären Transport ist oft in Standard Brunnen oder Deck studiert, das Fehlen einer basolateralen Fach schließt Zellpolarisation und die Fähigkeit, den Transport durch Zellschichten zu untersuchen. Um dieses Hindernis zu überwinden, hat den Transport über lange Zellmonoschichten untersucht mit Transwell-Einsätze ^10,11,16,17, die aus einem oberen (apikal) Kammer, einem porösen durchlässige Membran, wo Zellen befestigen und bilden eine dichte Monoschicht bestehen, und eine untere worden (basolateralen) Kammer (Abbildung 1). In dieser Konfiguration kann der Transport in die gemessen werdenapikal-zu-basolateral-Richtung durch die Verabreichung einer Behandlung in der oberen Kammer, nach dem Transport durch die Zellmonoschicht und der darunterliegenden porösen Membran, und schließlich das Sammeln des Mediums in der unteren Kammer für die Quantifizierung des transportierten Materials. Transport in der basolateralen-to-apikal kann auch durch anfängliche Verabreichung in die untere Kammer und die anschließende Sammlung aus der oberen Kammer ^5,10,12,16 gemessen werden. Es gibt verschiedene Techniken, um die Bildung der Permeabilitätsbarriere auf Transwells, einschließlich TEER und parazellulären Transport-Assays zu überprüfen, wie oben beschrieben. Darüber hinaus kann das permeable Filter auf denen Zellen kultiviert werden zur Bildanalyse (z. B. durch Fluoreszenz, konfokale, Elektronenmikroskopie) entfernt werden, wie weitere Validierung der Zellmonolayer-Modell sowie dem Transportmechanismus. Auswahl des Membrantyps, die in unterschiedlichen Porengrößen, Materialien und Oberflächen verfügbar ist, hängt von verschiedenen factors wie die Größe von Stoffen oder Gegenständen, die transportiert werden, Zelltyp und Bildgebungsverfahren ^16,18-20. Transwell-Einsätze im Vergleich zu komplexen Säugersystemen als Volumina der Kammern und der Zelloberfläche sind bekannte Konstanten gesteuerte und genaue Quantifizierung der Transport erleichtert auch. Während viele Faktoren bei der in-vivo-Lieferung beteiligt sind beseitigt, einschließlich der Anwesenheit von Darmschleim-, Scher-Stress, Verdauungsenzyme, Immunzellen etc., bietet dieses kleinen Maßstab in vitro-Modell nützlich vorläufige Informationen über Transport.

Als ein Beispiel, um die Anpassung dieser Verfahren an NC Transport durch Zellbarrieren ^10,11,16,17 studieren zu verdeutlichen, beschreiben wir hier einen Fall, wo das Potenzial für die NC-Transport über die GI Epithel wurde durch die Beurteilung Gang eines Drug-Delivery-Modell modelliert System durch eine Monoschicht von menschlichen epithelialen kolorektalem Adenokarzinom (Caco-2-Zellen). Hierzu cEllen wurden in Transwell-Einsätze, auf einem 0,8 &mgr; m Poren Polyethylenterephthalat (PET)-Filter (6,4 mm Durchmesser), die transparent ist und kann zur Mikroskopie verwendet werden. Der Status der Permeabilitätsbarriere durch Messen TEER, apikale zu basolateralen Transport einer Kontrollsubstanz, Albumin und Fluoreszenzmikroskopie Visualisierung eines Elements der tight junctions, Occludinproteins validiert. Ein Modell des Ziel NC Polymer verwendet wird, die aus 100 nm, Polystyrol nicht biologisch abbaubaren Nanopartikel. NCs durch Oberflächenadsorption mit einem Targeting-Antikörper allein oder einer Kombination aus einer Targeting-Antikörper und einem therapeutischen Ladung, wobei jede Komponente mit ¹²⁵ I-Radioisotop zur Verfolgung markiert werden beschichtet. Im gewählten Beispiel erkennt interzelluläres Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1) der Antikörper, exprimiert ein Protein auf der Oberfläche von Epithelzellen GI (und anderer Zellen), von dem gezeigt wurde, um die intrazelluläre und transzellulären Transport o erleichtern f Wirkstoffträger und ihre Ladungen ^21. Die Ladung ist alpha-Galactosidase (α-Gal), ein therapeutisches Enzym zur Behandlung der Fabry-Krankheit, einer genetischen lysosomalen Speicherkrankheit ²² verwendet.

Die beschichteten Nanokristallen, von etwa 200 nm groß sind, um die apikale Kammer über der Zellschicht für unterschiedliche Zeiträume, gegeben und bei 37 ° C inkubiert, wonach ¹²⁵ mit der Zell-Monoschicht und / oder die zugehörige kann ich auf NCs erkannt werden auf die basolaterale Kammer unter den Zellen transportiert. Zusätzliche Bestimmung von freiem ¹²⁵ I ermöglicht Subtraktion des abgebauten Fraktion und Schätzung von beschichteten NC Transport. Der Transportmechanismus wird durch die Veränderungen der Durchlässigkeit der Barriere in Bezug auf den parazellulären Weg, durch den oben beschriebenen Parametern, während transzellulären Transport wird durch die Veränderungen der Transportwege bei der Modulation der Endozytose und Transzytose bestimmt beurteilt.

NHALT "> Diese Methoden liefern wertvolle Informationen über die Zellbarriere Modelle, das Ausmaß und die Geschwindigkeit des Transports von Drug-Delivery-System, und den Mechanismus solcher Transport, insgesamt die Auswertung des Potentials für die Arzneimittelabgabe über zelluläre Barrieren.

Protokoll

1. Kultivieren einer Zellmonolayer in Transwell-Einsätze

1. In einem sterilen, Sicherheitsstufe 2 Zellkultur Kapuze, legen 0,8 mm Poren PET Transwell-Einsätze in eine 24-Well-Platte (4 Wells pro Bedingung für statistische Signifikanz) mit einer Pinzette. Alle Materialien in die Abzugshaube mit Ethanol sterilisiert werden.

Hinweis: Die Porengröße der Filter muss in Übereinstimmung zu der mittleren Größe der verwendeten NC ausgewählt werden, um den Transport durch die Membran zu ermöglichen. Auch für statistisch signifikante Ergebnisse zu jeder experimentellen Bedingung erfordert ein Minimum von vier Wiederholungen (Vertiefungen) in dem gleichen Experiment, und mindestens 3 unabhängigen Experimenten.

2. Vorbereitung Zellkulturmedium, das DMEM-Medium mit 4,5 g / l Glucose, 15% fötalem Rinderserum und 1% Pen-Strep ergänzt und Hitze auf 37 ° C in einem Wasserbad.
3. Verdünnen humanen epithelialen kolorektalen Adenokarzinom (Caco-2-Zellen) in Zellmedium und Ort200-400 ul der Zell-Lösung in die obere (apikale) Kammer des Transwell-Einsatzes, bei einer Dichte von 1,5 x 10 ⁵ Zellen / cm ^2. Füllen Sie den unteren (basolateralen) Kammer mit 700 bis 900 ul Zellmedium.
4. Kulturzellen bei 37 ° C, 5% CO ₂ und 95% Feuchtigkeit für 16-21 Tage, Ersetzen des Mediums in der oberen und unteren Kammer alle 3-4 Tage unter Verwendung der in Schritt 1.3 angegebenen Mengen. Medium ersetzen in der folgenden Reihenfolge, um den Druck oben (statt unten) die Zellmonolayer zu erhalten: saugen das Medium aus der unteren Kammer, saugen das Medium aus der oberen Kammer, die obere Kammer mit frischem Medium zu füllen, und die untere Kammer mit füllen frisches Medium.

2. Validierung des GI Epithelial Durchlässigkeit Barrier Mit transepitheliale Elektrischer Widerstand (TEER) und Immunfärbung von Tight Junctions

1. Für Kurzzeitspeicher (weniger als 2 Wochen), tauchen STX100 Elektroden in einem Elektrolyt Lösungennung (0,1-0,15 M KCl oder NaCl). Verbinden des Elektrodenkabels an den Anschluss auf der Elektrode EVOM Volt-Ohm-Meter, so dass das System intern kurzgeschlossen wird und die Elektrode Symmetrie beibehalten wird. Für langfristige Lagerung, spülen Sie mit dH ₂ O und an einem trockenen, dunklen Zustand.
2. Um die Elektroden zu sterilisieren, tauchen in Ethanol für 15 min und an der Luft trocknen für 15 Sekunden. Alternativ können die Elektroden in einem UV-Haube gelagert werden. Spülen Sie die Elektroden in eine sterile Elektrolytlösung (Phosphatpuffer Kochsalzlösung, PBS) oder 0,1-0,15 M KCl oder NaCl-Lösung, vor jeder Widerstandsmessung.
3. Mit dem Volt-Ohm-Meter an den Widerstandseinstellung gesetzt, vertikal platzieren Elektroden in eine gut mit der Transwell-Einsatz, mit der kurzen Elektrode in der oberen Kammer und der langen Elektrode in der unteren Kammer zu berühren den Boden des Brunnens. Sobald die EVOM Wert fest den Widerstandswert (in Ohm angegeben; Ω) für jeden gut.
4. Berechnen Widerstand (resistanCE Bereich normalisiert; Ω × cm ²⁾ der Proben durch Subtrahieren Hintergrund Widerstand (TEER von Transwell-Einsätze ohne Zellen) und Multiplizieren mit der Membranoberfläche. Widerstandswerte werden am häufigsten in der Literatur berichtet. (Siehe Diskussion)
5. Wiederholungsmessungen alle 1-2 Tage bis TEER-Werte zu einem Maximum und Plateau, was die Bildung der Permeabilitätsbarriere, was typischerweise 2-3 Wochen ab dem Zeitpunkt der Zell Flechten. Plateau TEER-Werte und Zeit notwendig, um die Integrität der Barriere erreichen können je nach Zellpassage Zahl variieren.
6. Um die Gegenwart von Tight Junctions in der Zellmonoschichten mit hoher TEER (gleich oder höher als der Schwellenwert für die Barrierebildung) Verifizierung fixieren Zellen durch Inkubation mit kaltem 2% igem Paraformaldehyd für 15 min. Dann waschen Zellen mit PBS und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur mit 1 &mgr; g / ml Anti-Occludin. Waschen der Zellen einmal mit PBS und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur mit 7,5 ug / ml fluorescently-markierten Sekundärantikörper. Verwenden Brunnen mit niedrigen TEER als negative Kontrolle für barriere Bildung.

Anmerkung: Als Ersatz für Anti-Occludin-Antikörper können alternativ zu tight junction-Proteine ​​verwendet werden.

7. Vorsichtig herausschneiden der Filtermembran, auf dem die Festmonoschicht angebracht ist, und montieren Sie auf Objektträger für die Bildgebung mit Epi-Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskopie.

3. Auswertung transepitheliale Transport Gezielte Carriers

1. Beschriftung der Targeting-Antikörper (Maus-monoklonalen Antikörper gegen ICAM-1, anti-ICAM, in diesem Beispiel) mit ¹²⁵ I, wie zuvor beschrieben ^7. Bradford-Test verwenden, um die Proteinkonzentration und eines Gammazählers, um zu ermitteln ¹²⁵ I Inhalt des Antikörpers zu bestimmen, dann die Berechnung der spezifischen Aktivität in Zählungen pro Minute (CPM) / mg eines markierten Antikörpers.

Hinweis: Um die Spezifität zu kontrollieren, wiederTorf, das Verfahren durch Kennzeichnung Maus-IgG, die verwendet werden, um nicht gezielte beschichteten NCs bereiten wird. Um den Transport eines therapeutischen Fracht zu untersuchen, in diesem Beispiel das Verfahren wiederholen Beschriftung der Ladung, zB alpha-Galactosidase (α-Gal). Alternativen können für das Targeting-Mittel, nicht-spezifische Kontrolle oder therapeutische Ladung verwendet werden. Alternative Verfahren können ebenfalls verwendet werden, um Verbindungen zu kennzeichnen und die Schätzung der Konzentration des markierten Gegenstücken sein.

2. Paare der markierte Targeting-Antikörper (anti-ICAM in unserem Beispiel) auf die Oberfläche der Nanokristalle. In diesem Beispiel inkubieren Polystyrol Nanokügelchen (100 nm Durchmesser) 1 h bei Raumtemperatur mit ¹²⁵ I-Anti-ICAM zu Oberfläche Adsorption zu ermöglichen, wie beschrieben ^7.

Hinweis: Für die nicht-spezifische Steuerung verwenden ¹²⁵ I-IgG. Um den Transport einer Ladung verfolgen, verwenden eine Kombination von Targeting-Antikörper und ¹²⁵ I-markiertem Ladung (α-Gal in unserem Beispiel).

3. Zentrifugieren bei 13.000 g für 3 min und entfernen Sie die nicht-beschichteten Pendants in den Überstand durch Aspiration. Das Pellet enthält, beschichteten NCs mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS durch Pipettieren und beschallen bei geringer Leistung, um mögliche Partikel-Aggregate (20-30 kurze Impulse) zu stören.
4. Für NC-Charakterisierung, messen Größe, Polydispersität und ζ-Potential der beschichteten Partikel mittels dynamischer Lichtstreuung (nach Anbieter Anweisungen) und quantifizieren die Anzahl der ¹²⁵ I-markierten Targeting-Antikörper-Moleküle (zB Anti-ICAM) auf der Partikeloberfläche mit einer Gamma-Zähler.

Anmerkung: Diese Methoden können für die unspezifische und therapeutischen Gegen wiederholt werden. Die Größe der beschichteten Teilchen im Bereich um 200 nm auf.

5. Add ¹²⁵ I-Antikörper NCs (zB ¹²⁵ I-Anti-ICAM NCs, 56 nCi / ml) in die obere Kammer oberhalb konfluenten Caco-2-Monoschichten mit TEER &# 8805; 350 Ω x cm ² (siehe Diskussion) über Hintergrund (16-21 Tage nach der Aussaat). Inkubieren bei 37 ° C für eine oder mehrere gewünschte Zeitintervalle. Messen TEER (Abschnitt 2.3) vor und nach Inkubation, um die Auswirkungen von Nanokristallen auf der Permeabilitätsbarriere beurteilen.

Hinweis: Dieses Verfahren kann für die unspezifische und therapeutischen Gegen wiederholt werden.

6. Sammeln Sie das Medium aus den oberen und unteren Kammern und einmal waschen Sie sie mit 0,5 ml DMEM bei 37 ° C (obere Kammer) oder 1 ml dH ₂ O (untere Kammer). Sammeln Sie die Waschanlagen für die Messung der Gesamtradioisotop Inhalt mit einem Gamma-Zähler.
7. Zur Messung der Zellfraktion, die auszuschneiden lässigen Filter, z. B. mit einer Rasierklinge um die Kanten geschnitten, und Inkubieren in einem Gamma-Zählrohr mit 1% Triton X-100 für 10 min (um die Zellinhalte freizusetzen), bevor Messzelle -assoziierten Gesamtradioaktivität.
8. Zur Messung ¹²⁵ I wiederNCS beim Transport oder aufgrund möglicher Abbau ersten Mischung 300 ul Probe (von der oberen, unteren oder Zellfraktionen) mit 700 ul 3% BSA in PBS und 200 ul Trichloressigsäure (TCA) vermietet. Inkubieren bei Raumtemperatur für 15 min. Inzwischen ist diese Zeit, messen Sie die Radioaktivität dieser Probe in einem Gamma-Zähler.
9. Zentrifuge TCA Proben bei 3000 g für 5 min auf intakte Protein (Pellets) aus dem abgebauten Proteins oder ¹²⁵ I-Fraktion (Überstand) zu trennen. Quantifizierung der Radioaktivität des freien ¹²⁵ I-Fraktion und subtrahieren Sie diesen Wert von der Gesamtradioaktivität gemessen vor der Zentrifugation. Dies wird die Menge an markiertem Protein, das nicht abgebaut wird.

4. Mechanismus der transepitheliale Transport Gezielte Nanotransporter

1. Label-Albumin mit ¹²⁵ I, wie in Abschnitt 3.1 beschrieben und zuvor berichtet ^sieben.

Anmerkung: Albumin ist ein 66,5kDa-Protein, und daher eine relativ große Substanz. Obwohl ein gültiges Steuer für passive Transport größerer Gegenstände (welche hier z. B. 200 nm NCs), sollte mit kleineren inerten Tracer-Moleküle, wenn das Studium Transport von kleineren Wirkstoffträger ersetzt werden (siehe Diskussion).

2. Zu beurteilen, parazellulären Transport mit Albumin para Leckage Kultur Caco-2-Monoschichten auf Transwell-Einsätze, wie oben beschrieben.
3. Um die obere Kammer Medium über der Zellschicht, fügen Sie entweder allein ¹²⁵ I-Albumin (Negativkontrolle, die die Basisniveau von Leckagen) oder ¹²⁵ I-Albumin und nicht-radioaktiv markierten Antikörper-bezogene NCs (wie in Abschnitt 3.5 beschrieben). Bei 37 ° C für den gewählten Zeitintervall (s), die die untersuchten bei der Prüfung von NC Transport entsprechen sollte. Messen Sie TEER (Abschnitt 2.3) vor, während und nach der Inkubation, dann sammeln Sie alle Fraktionen für insgesamt ¹²⁵ I und ¹²⁵ I frei Messungen wie angegeben. Abschnitt 3 Hinweis: Die gleichzeitige Zugabe von ¹²⁵ I-Albumin und nicht-radioaktiv markierten Kontroll-IgG NCs kann als Kontrolle verwendet werden.
4. Als positive Kontrolle für die Öffnung der interzellulären Kontaktstellen, fügen Zellmedien, enthaltend 5 mM H ₂ O ₂ zu der oberen und unteren Kammern des Transwell-Einsatzes, und bei 37 ° C für 30 min. Dann messen TEER (Abschnitt 2.3), und fügen Sie ¹²⁵ I-Albumin in die obere Kammer für die ausgewählten Zeitintervallen. Messen Sie TEER zu verschiedenen Zeitpunkten während der Inkubationszeit zu TEER Wertverfall von H ₂ O _2-induzierte Öffnung der Zellverbindungen verursacht zu identifizieren.
5. In parallelen Experimenten, bewerten transzellulären Transport, auch Transzytose, der ¹²⁵ I-bezogene NCs durch Inkubation konfluenten Caco-2-Monoschichten mit entweder 50 &mgr; M monodansylcadaverine (MDC; Inhibitor der Clathrin-vermittelte Endozytose), 1 ug / ml filipin (Inhibitor caveolare vermittelte Endozytose), 0,5 &mgr; M Wortmannin (Inhibitor der Phosphatidylinosit-3-Kinase [PI3K], in Makropinozytose beteiligt sind) oder 20 &mgr; M [5 - (N-Ethyl-N-isopropyl) Amilorid] (EIPA, Inhibitor Makropinozytose und CAM-vermittelte Endozytose ^15).

Hinweis: ¹²⁵ I-IgG NCs und ¹²⁵ I-Albumin als negative Kontrollen für die Wirkung dieser Inhibitoren verwendet werden, und andere Verfahren (z. B. siRNA-Techniken) können weitere selektive Hemmung bereitzustellen.

6. Messen TEER (Abschnitt 2.3) vor, während und nach der Inkubation der Zellen mit Inhibitoren und radioaktiv markierten Materialien, als zusätzliche Kontrolle für die Wirkung der Inhibitoren auf die Monoschicht Durchlässigkeit.

Ergebnisse

Validierung der Zellmodell zu transepithelialen Transport von gezielten NCs studieren, Fig. 2 zeigt, dass die Caco-2-Zellmonolayer plattiert bei einer Dichte von 1,5 × 10 ⁵ Zellen / cm ² Konfluenz erreichten ~ 12. Tag gehalten und Mono Integrität bis zu Tag 18, von TEER (2A) angegeben. Dies wurde durch die Anwesenheit von Occludin-positiven Tight Junctions (2B) in Monoschichten mit hohen TEER (390 Ω × cm ^2, Tag 14) bestätigt, im Ver...

Diskussion

Unter Verwendung der oben diskutierten Verfahren kann ein Zellmodell für die Untersuchung der Zieltransport NCs über zelluläre Barrieren geschaffen werden, wie das für Caco-2-Epithelzellen, die relevant für die Bewertung der Verkehrs GI Lumen in dem Blut in dem Fall vorgesehen ist beispiels der oralen Medikamentenabgabesysteme. Kultivierung von GI epithelialen Zell-Monoschichten in Transwell-Einsätzen aktiviert Messung TEER und Fluoreszenz-Immunfärbung von tight junctions, um die Bildung einer Zelle Permeabilitä...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transwell inserts	BD Falcon	353095
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x	Cellgro	10-013-CM
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cellgro	35-015-CV
Pen Strep	Gibco	15140
Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells	ATCC	HTB-37TM
125Iodine	Perkin Elmer	NEZ033H002MC	Radioactive hazard
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Gibco	14190-235
Bovine Serum Albumin (BSA)	Equitech Bio	BAH-66
Paraformaldehyde (16%)	Fisher Scientific	15710
Mouse Immunoglobulin G (IgG)	Jackson ImmunoResearch	015-000-003
Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM)	Marlin 1987
α-Galactosidase, from green coffee beans	Sigma	G8507-25UN
FITC latex beads, 100 nm	Polysciences, Inc.	17150
Triton X-100	Sigma	234729-500ML
Trichloroacetic acid (TCA)	Fisher Scientific	SA433-500
Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human	Santa Cruz Biotechnology	Sc-27151
Monodansylcadaverine (MDC)	Sigma	D4008
Filipin	Sigma	F9765
5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA)	Sigma	A3085
Wortmannin	Sigma	W1628
Gamma counter	Perkin Elmer	Wizard2
Volt-ohm meter	World Precision Instruments	EVOM2
TEER electrodes	World Precision Instruments	STX100	Electrodes available for different well-plates
Dynamic Light Scattering (DLS)	Malvern	Nano-ZS90