Förderung von Überleben und die Differenzierung neuraler Stammzellen mit Fibrin und Growth Factor Cocktails nach schweren Rückenmarksverletzungen

Zusammenfassung

Fibrin-Matrices, die Wachstumsfaktoren wurden verwendet, um aufgepfropften neuronalen Stammzellen in Websites von kompletten Durchtrennung des Rückenmarks zu behalten. Transplantierten Zellen die Läsion Hohlraum vollständig gefüllt ist und in mehrere neuronale Zelltypen, einschließlich Neuronen, die Axone in Wirtsrückenmark über lange Distanzen erweitert differenziert.

Zusammenfassung

Neuronale Stammzellen (NSCs) können Selbsterneuerung und Differenzierung in Neurone und Gliazellen. Transplantierte NSCs können verlorene Neuronen und Gliazellen nach einer Rückenmarksverletzung (SCI) zu ersetzen, und kann Funktionsrelais zu bilden, um wieder zu verbinden Rückenmarksegmente über und unter einer Läsion. Frühere Studien Transplantation neuraler Stammzellen durch unvollständige Überleben des Transplantats innerhalb des Rückenmarksverletzung Hohlraum begrenzt. Ferner Verfolgung Transplantat Überleben der Zellen, Differenzierung und Verfahren Verlängerung noch nicht optimiert. Schließlich ist in früheren Studien kultivierten Ratten NSC wurden typischerweise berichtet in Glia differenzieren, wenn der verletzten Rückenmarks, anstatt Neuronen gepfropft, außer Schicksal wurde auf einen spezifischen Zelltyp angetrieben. Um diese Probleme anzugehen, haben wir neue Methoden, um das Überleben, Integration und Differenzierung von NSCs zu den Orten der sogar schwere SCI verbessern. NSCs wurden frisch aus embryonalen Tag 14 Rückenmark (E14) von einer stabilen transgenen Rattenlinie Fischer 344 grün fl ausdrücken isoliertuorescent Protein (GFP) und wurden in eine Fibrinmatrix Wachstumsfaktoren enthält, eingebettet ist; diese Formulierung zielte darauf ab, transplantierten Zellen behalten in der Läsion Höhle und unterstützt das Überleben der Zelle. NSCs in der Fibrin / Wachstumsfaktor-Cocktail wurden zwei Wochen nach Brust-Ebene-3 (T3) komplette Rückenmarksquerschnitten erhalten implantiert, wodurch vermieden Spitzenzeiten der Entzündung. Resultierende Transplantate die Läsion Hohlraum vollständig gefüllt und in den beiden Nervenzellen, die Axone in die Wirtsrückenmark über erstaunlich große Entfernungen erweitert und Glia differenziert. Transplantate von kultivierten menschlichen NSCs, die GFP zu ähnlichen Ergebnissen. Somit sind Verfahren zur Verbesserung der neuronalen Stammzelltransplantation, das Überleben und die Analyse der in vivo Befunde definiert.

Einleitung

Rückenmarksverletzung (SCI) oft Schäden, die nicht nur der weißen Substanz, die Signale vom und zum Gehirn führen, sondern auch die zentrale graue Substanz, was Segmentverlust von Inter und Motor-Neuronen. Die Folge ist der Verlust der SCI sowohl motorische und sensorische Funktion unterhalb der Läsion. Leider hat der erwachsenen Zentralnervensystem (ZNS) nicht spontan regenerieren, was zu einer dauerhaften Funktionsdefizite ^ein. Daher ist der Wiederaufbau des verletzten Rückenmarks und Erwachsenen Verbesserung der motorischen, sensorischen und vegetativen Funktion ein wichtiges Ziel der SCI Forschung. Neuronale Stammzellen (NSCs), auch direkt aus embryonalen oder adulten ZNS isoliert, sind überzeugende Kandidatenzellen, um verlorene Neuronen und Glia zu ersetzen. Darüber hinaus sind diese Zellen haben das Potenzial, neue Funktionsrelais bilden axonalen Leitung über eine Läsion ^2,3 wiederherzustellen.

Bisher hat es nicht eine detaillierte Erläuterung der anatomischen, electrophysiologische und Verhaltenseffekte von neuronalen Relais Bildung durch transplantierte NSCs nach schweren SCI. Es gibt mehrere Gründe dafür: Erstens, NSCs oder transplantierten fetalen ZNS-Gewebe überleben schlecht, wenn sie in großen Läsion Hohlräume gepfropft. Frühere Studien zeigen erhebliche frühen Zellverlust, so dass große, leere zystische Läsion Hohlräume ^4,5. In einigen Studien die transplantierten Zellen anschließend aufteilen würde und füllen die Läsion Hohlraum ^4,5, aber dies könnte nach einer Verzögerung von Tagen bis Wochen auftreten, und anschließende Befüllung Läsion möglicherweise nicht vollständig oder konsistent sein. Zweitens, ein effizientes Tracking-System, das Sound-Daten auf das Überleben der Zellen, Differenzierung / Reifung und Auswuchs von transplantierten NSCs bietet fehlte. Die meisten frühen Studien genutzt antegrade und retrograde Markierung zu axonalen Projektionen aus Transplantationen ^2,3 verfolgen. Nur teilweise und oft undeutlich markierten axonale Projektionen aus transplantierten Zellen und Tracerverfahren Diese Techniken sind jedoch subjektivt, um Artefakte durch Farbstoff Leckage über den implantierten Zellen. Andere Gruppen verwendet menschlichen spezifischen neuronalen Marker zur axonalen Projektionen nach Transplantation von humanen fötalen NSCs in Rückenmark verletzt Nagetier ^5,6 kennzeichnen. Doch in jenen Studien, die Heterotransplantate nicht durchweg gut überleben. Kürzlich, virale Lieferung der GFP-Reporter-Gen wurde verwendet, um kultiviert NSCs ^7,8 kennzeichnen. Allerdings war die GFP-Expression oft widersprüchlich und kann nach unten reguliert werden ^7. Kürzlich wurde die Verwendung von transgenen Mäusen oder Ratten Spender des Reportergens GFP oder die menschliche plazentale alkalische Phosphatase stabil exprimieren, dramatisch verbessert die Verfolgung von transplantierten neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen in vivo ^9,11. Drittens, einige Studien zeigen, dass in vitro kultivierten Ratten NSCs entweder aus embryonalen oder adulten ZNS, ausschließlich in Gliazellen Linien differenzieren, wenn in das Milieu des intakten oder verletzten Erwachsenen Rückenmark transplantiertd ^7,12,13, trotz der Tatsache, dass diese neuronalen Stammzellen zur Differenzierung zu Neuronen und Gliazellen sowohl in vitro, was anzeigt, dass die lokalen Umgebungen kann das Schicksal von Stammzellen zu diktieren. Alternativ können kultiviert NSCs, vor allem aus adulten ZNS abgeleitet, intrinsische Eigenschaft defaulty müssen in Gliazellen Linien in vivo ¹³ unterscheiden.

Aufgrund der oben diskutierten Einschränkungen unserer Gruppe vor kurzem ein neues Protokoll entwickelt, um embryonale NSC-Tracking, das Überleben und die Differenzierung / Reifung in der schwer verletzten Erwachsenen Rückenmark zu verbessern. Kurz gesagt, begannen wir mit einer stabilen transgenen Fischer 344 Ratten-Inzuchtlinie einen GFP-Reporter-Gen, das die GFP-Expression in vivo nach Transplantation erhält ¹⁴ abzugeben. Weiter haben wir frisch getrennt NSCs aus embryonalen Tag 14 Fischer 344 Rückenmark, eine Stufe der Entwicklung, die das Potenzial, beide Neuronen und Gliazellen zu generieren behält. Schließlich haben wir eingebettetfrisch gewonnenen NSCs in eine Fibrin-Matrix Wachstumsfaktoren enthält, ^15-17, um die Zellen zu halten und verteilen sie in einem großen Hohlraum Läsion, mit dem Ziel, Transplantat Überleben der Zelle, Differenzierung und Integration. Die Transplantate wurden in Websites von T3 komplette Durchtrennung, zwei Wochen nach Verletzungen des Rückenmarks platziert. Diese transplantierten Zellen konsequent gefüllt vollständige Durchtrennung Standorten und in reichlich Neuronen, die eine große Anzahl von Axonen in Wirtsrückenmark über lange Distanzen ¹⁸ verlängert differenziert. Ähnliche Ergebnisse wurden mit kultivierten humanen neuralen Stammzelltransplantate zur Immun-Mangelratten ¹⁸ erhalten.

Protokoll

Alle Tier Protokolle werden von VA-San Diego Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) zugelassen. NIH-Richtlinien für Labortierhaltung und Sicherheit strikt befolgen. Tiere haben freien Zugang zu Futter und Wasser während der gesamten Studie und angemessen zur Minimierung Schmerzen und Beschwerden behandelt.

1. Herstellung von Fibrin Komponenten mit Wachstumsfaktor-Cocktails

1. Lösen Sie 25 mg Fibrinogen Ratte in 0,5 ml PBS auf 50 mg / ml 2x Stammlösung zu erhalten (siehe Materialien Tabelle). Fibrinogen ist schwierig zu lösen, und sollte in einem 37 ° C Brutschrank oder Wasserbad gestellt und geschüttelt alle 5-10 min für 1-2 Stunden werden.
2. Lösen 100 UN Ratte Thrombin in 2 ml 10 mM CaCl sterile ₂ bis 50 U / ml 2x Stammlösung zu erhalten.
3. Lösen Wachstumsfaktoren in PBS in den folgenden Konzentrationen zu 100 ul Stammlösung: 1 mg / ml: BDNF; NT-3 (hohe Konzentration Lager intrathekale Infusion in vivo ^{19); 200 ug / ml: GDNF; IGF; bFGF; EGF; PDGF; aFGF; HGF (etwa 1000 mal höher als für die Zellkultur verwendet werden).}
4. Lösen Sie 25 mg MDL28170 (Calpain-Inhibitor) in 1,3 ml DMSO auf 50 mM DMSO-Stammlösung zu erhalten, und dann verdünnen 50x in PBS auf 1 mM Stammlösung zu erhalten.
5. Mischen Sie 100 ul jeder Wachstumsfaktor-Komponente und 100 ul MDL28170 (1 mM Stammlösung) zu 1.000 ul Wachstumsfaktor-Cocktail-Lösung (Abbildung 1) zu produzieren.
6. Mischen Sie 500 ul Fibrinogen 2x Stammlösung mit 500 ul Wachstumsfaktor-Cocktail bis 25 mg / ml Fibrinogen Arbeitslösung bei -70 ° C zu erhalten, Wachstumsfaktoren enthält und Teilmenge in 10 oder 20 ul für die Lagerung Die Lösung wird bei -70 ° C für bis zu 12 Monate stabil
7. Ebenso mischen 500 ul Thrombin 2x Stammlösung mit 500 ul Wachstumsfaktor-Cocktail bis 25 U / ml Thrombin Arbeitslösung zu erhalten, Wachstumsfaktoren enthält, und in aliquoten ähnliche 10 oder 20 ul Volumen für die Lagerung eint -70 ° C für bis zu 12 Monate.
8. Am Tag der Transplantation stellen Fibrinogen-und Thrombin-haltigen Wachstumsfaktor Cocktails auf Eis, bis mit Zellen gemischt.

2. T3 Spinal Cord Trennung

1. Anesthetize erwachsenen weiblichen Fischer 344 Ratten oder athymischer Ratten mit akzeptablen Methoden. Themen sind tief anästhesiert, als Reaktion auf Schwanz und Pfote Prise fehlen völlig. Anmerkung: Wir verwenden typischerweise 150-200 g Fischer Ratten oder athymischen Ratten 180-220 g und einen Anästhesie-Cocktail (2 ml / kg) von Ketamin (25 mg / ml), Xylazin (1,3 mg / ml) und Acepromazin (0,25 mg / ml).
2. Bewerben Augensalbe zur Trockene Augen oder Verletzungen zu verhindern, während die Tiere in der Anästhesie.
3. Rasieren Sie den oberen Brustbereich und reinigen Sie die Haut mit Betadine.
4. Schneiden Sie die Haut und Muskeln mit # 15 Klinge, aussetzen T3 Wirbel mit einer Wund-Spreizer, und führen Sie eine Laminektomie bei T3 Wirbel zu entlarven T3 / 4 Rückenmark mit einer Zange.
5. Machen Sie eine longitudinal Mittellinienschnitt in der Dura von etwa 2 mm Länge unter Verwendung einer # 11 Klinge.
6. Zeigen Iridektomie Schere unter der Dura, um den rechten Seiten gesamte Rückenmark geschnitten. Machen Sie eine weitere Schnitt auf der gleichen Seite 1,5 mm mehr cadually.
7. Saugen Sie Rückenmarksgewebe zwischen den beiden Segmenten geschnitten mit einer stumpfen Nadel 23 G bis mäßiger Intensität Vakuum verbunden. Verwenden Sie visuelle Überprüfung, um eine vollständige Durchtrennung ventral und seitlich zu gewährleisten. Dies wird eine seitliche Hemisektion abzuschließen.
8. Um die Läsion zu einer vollbreiten Durchtrennung des Rückenmarks erstrecken, legen Spiegel Einschnitte in die linke hemicord. Versuchen Sie, die Dura intakt lassen, außer dem ersten Schnitt, um die Firma Graft / Fibrin-Matrix in der Läsion, wenn gepfropft zwei Wochen später erhalten.
9. Naht der Muskel, gelten Antibiotika-Pulver und heften Sie die Haut.
10. Inject Ringer-Laktat-(3 ml), Bannamine (2,5-5 mg / kg) und Ampicillin (80-100 mg / kg) (siehe Materialien Tabelle) unmittelbar nach der Operation und maintain Ratten in einem warmen Inkubator, bis der Thermoregulation wieder hergestellt.
11. Entleeren Sie die Blase und spritzen die Ringer-Lösung und Ampicillin zweimal am Tag für etwa zwei Wochen, bis die Einrichtung von Blasenentleerungsreflex (Abbildung 1B).

3. Vorbereitung der frisch gewonnenen embryonalen Tag 14 Spinal Cord Neural Stem Cells

1. Erhalten Inzucht transgenen GFP-F344-Ratten (F344-Tg (UBC-EGFP) F455Rrrc) aus Ratten-Ressourcen-und Research Center, University of Missouri.
2. Inject 40 ug des-Gly ^10, [D-Ala ^{6]-Leuteinizing} Hormone Releasing Hormone ethylamid (LHRH) in PBS in einer Konzentration von 200 ug / ml intraperitoneal (IP) pro reifen weiblichen Ratten (8 Wochen oder älter) nach 2 verdünnt -3 Stunden Licht Induktion zur Synchronisation von Embryo-Entnahme.
3. Kamerad mit einer reifen GFP homozygot oder heterozygot männlichen Ratten über Nacht 4 Tage nach der Injektion.
4. Sammeln Embryonen an den Tagen 13,5-14,5 postcoitus(Pc) in kaltem HBSS-Puffer, untersuchen GFP-Expression unter einer "Nightsea" Taschenlampe und Filtergläser (BLS1 - Bluestar-Taschenlampe und Modell VG1 und Sperrfilter) oder einem Fluoreszenzmikroskop.
5. Dissect Rückenmark aseptisch aus jedem GFP-positiven Fötus und zu entfernen, die über Hirnhaut und Rücken angebracht Ganglien mit Iridektomie Schere und Pinzette Juweliere.
6. Sammeln Sie die seziert Rückenmark in 2 ml kaltem HBSS-Puffer in einem 15 ml Cornical Rohr und auf Eis zu halten.
7. Folgen Referenz # 20 bis seziert Rückenmark distanzieren:
   1. Kurz gesagt, 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA auf die Röhrchen mit seziert Rückenmark (mehrere Kabel können zusammen verdaut werden, ein Kabel kann genügend Zellen für Transplantat von einem Thema erzeugen) und zu verdauen bei 37 ° C für 10-12 min.
   2. Stoppen der Reaktion durch Zugabe von Trypsin 10 ml DMEM mit 10% FBS auf das Rohr und das Gewebe Zentrifuge bei 2500 rpm für 2 min.
   3. Resuspendieren Gewebe in 2 ml Neurobasalmedium Containing 2% B27 und verreiben Sie die Rückenmarksgewebe mit immer kleiner feuerpolierten Pasteur Pipetten.
   4. Zentrifugation der Zellen bei 2500 rpm für 2 min, resuspendieren in 2 ml Neurobasalmedium B27 enthalten, und Filterzellen mit einer 40 &mgr; m Zellfilter Sieb.
8. Zähle die Zellen mit einem Hämozytometer und teilen die Zellen gleichmäßig in zwei Eppendorf-Röhrchen.
9. Zentrifugieren Sie die Zellen und Überstand vollständig entfernen (1-2 min sind erforderlich, um alle Überstand mit einer niedrigen Vakuum Spitze zurückziehen), so dass die Wachstumsfaktor-Cocktails nicht durch verbleibende Überstand nach Zell Resuspension verdünnt werden.
10. Resuspendieren jeder Hälfte der Zellen in der Fibrinogen bzw. Thrombin-Arbeitslösung, enthaltend Wachstumsfaktoren, jeweils in einer Konzentration von 250.000 Zellen / ul (Zellpellet zählt etwa ⅓ Endvolumen) und sie auf Eis vor der Transplantation (Fig. 1A). Beachten Sie, dass Fibrinogen kann spontan gelieren, wenn mit Zell gemischts vor der Kombination mit Thrombin an der Läsion / Transplantationsstelle; um vorzeitige Gelierung zu vermeiden, mischen Zellen in Fibrinogen unmittelbar vor der Zelltransplantation in vivo.

4. Transplantation

1. Reexpose den verletzten T3 / 4 Rückenmark zwei Wochen nach Durchtrennung des Rückenmarks.
2. 5 ul Fibrinogen-Zellen und 5 ul Thrombin-Zellen konnten direkt ohne erneutes Öffnen der Läsion in neun Punkten der Läsion durch Narbengewebe verschlossen und intakte Dura injiziert werden.
3. Verwenden Sie eine 27 G-Nadel zu 9 Löcher auf der Oberfläche des Narbengewebes und intakte Dura 1-2 Wochen nach Läsion zu erstellen: 3 in der Mitte (in einem mittleren Punkt und zwei seitlichen und Abstand voneinander 0,5 mm) und 3 in beiden rostralen und 3 im kaudalen-Schnittstelle (etwa 0,5 mm rostral und kaudal vom Zentrum der Läsion).
4. Dann spritzen die Hälfte des Volumens von Fibrinogen Zell-Lösung in drei zentralen Punkten der Läsion und einem Viertel Volumen in 3 Punkten des rostralen Schnittstelle und aquarter Volumen in 3 Punkten von der Schwanz Schnittstelle.
5. Dann sofort injizieren throbmbin Zellen in den gleichen Stellen. Die Mischung von Fibrinogen und Thrombin-Zellen Zellen in der Läsion wird Fibrin-Gel, um Zellen in Läsion halten zu bilden und die Wachstumsfaktor-Cocktails wird das Überleben der Zellen zu unterstützen. Die Zellen werden mit Hilfe gezogen Glaspipetten auf einen Picospritzer (General Ventil, Inc.) verbunden injiziert.
6. Transplantation kultivierter menschlicher NSC ²¹ in dem oben beschriebenen gleichen Verfahren und mit Fibrin-und Wachstumsfaktor-Cocktail aus humanen Reagenzien hergestellt.

Ergebnisse

GFP immunhistologische Markierung zeigt, dass die aufgepfropften Ratte NSCs in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (fehlt ein Fibrin-Matrix und Wachstumsfaktoren) resuspendiert schlecht überlebt in der T3 Trennung Ort, nur Befestigung an der Läsion / Host-Marge und verlassen die meisten der Läsion leer ohne transplantierten Zellen (Fig. 2A). Das Überleben der NSC verbessert, wenn mit Fibrin-Matrices allein cogepfropften, aber das Transplantat nicht vollständig füllen einen großen Läsion Hohlra...

Diskussion

Eine der wichtigsten Hürden für die NSC-Transplantation in das verletzte Rückenmark ist schlecht Überleben in der Läsion entfernt. Alle Lücken oder Hohlräume in der Läsion möglicherweise reduzieren oder zu schwächen, die Bildung von neuronalen Funktionsrelais zwischen supraspinalen Axonen und getrennten Rückenmarksegmente unterhalb der Verletzung. Darüber hinaus kann der schlechten Überlebens gepfropft NSCs ihre Integration mit dem Wirtsgewebe beeinflussen und somit zu reduzieren Konnektivität gepfropft Ne...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibrinogen (rat)	Sigma	F6755-25MG	2 hr at 37 °C to dissovle Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml
Thrombin (rat)	Sigma	T5772-100UN	Dissovle in 10 mM CaCl2 Stock Concentration: 50 U/ml Final Concentration: 25 mg/ml
bFGF (human)	Sigma	F0291 (25 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
EGF (murine)	Sigma	E1257 (0.1 mg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
BDNF (human)	Peprotech	452-02 (1 mg)	Stock Concentration: 1,000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl
NT-3 (human)	Peprotech	452-03 (1 mg)	Stock Concentration: 1,000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl
GDNF (rat)	Sigma	G1401 (10 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
IGF-1 (mouse)	Sigma	I8779 (50 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
aFGF (human)	Sigma	F5542 (25 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
PDGF-AA (human)	Sigma	P3076 (10 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
HGF (human)	Sigma	H9661 (5 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
MDL28170	Sigma	M6690 (25 mg)	Stock in DMSO Stock Concentration: 1 mM Final Concentration: 50 μM
PBS	Millipore	BSS-1005-B	Stock Concentration: 1x Final Concentration: 1x
DMSO	Sigma	D2650
Ketamine	Putney	26637-411-01	40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml
Xylazine	Lloyd	0410,	2.5-8 mg/ml Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 5.8 mg/ml
Acepromazine	Butler	003845	0.5-4 mg/ml Stock Concentration: 10 mg/ml Final Concentration: 0.25 mg/ml
Betadine	Healthpets	BET16OZ
Ringers	Abbott	04860-04-10	2-3 ml/inj
Banamine	Schering-Plough	0061-0851-03	2.5-5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 0.5 mg/ml
Ampicillin	Sandoz	0781-3404-85	80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/ml
LH-RH	Sigma	L4513	200 μg/kg Final Concentration: 200 μg/ml
HBSS	Gibco	14175-096
Trypsin	Gibco	25200056	Stock Concentration: 0.25 % Final Concentration: 0.125 %
DMEM	Gibco	11995073
FBS	Gibco	16000044	Stock Concentration: 100 % Final Concentration: 10 %
Neurobasal Medium	Gibco	21103049
B27	Gibco	17504044	Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x
Note, use human reagents for grafts of human NSCs