Isolation von Fettgewebe Immune Cells

Zusammenfassung

Fettgewebe (AT) ist ein Ort der intensiven Immunzellaktivierung und Interaktion. Fast alle Zellen des Immunsystems sind in AT und ihre Verhältnisse werden durch Fettleibigkeit verändert. Proper Isolierung, Quantifizierung und Charakterisierung von AT Immunzellpopulationen sind entscheidend für das Verständnis ihrer Rolle in immunometabolic Krankheit.

Zusammenfassung

Die Entdeckung erhöht Makrophageninfiltration im Fettgewebe (AT) von übergewichtigen Nagern und Menschen hat zu einer Intensivierung des Interesses an Immunzellen Beitrag zur lokalen und systemischen Insulinresistenz geführt. Isolierung und Quantifizierung der verschiedenen Immunzellpopulationen in schlanken und adipösen AT ist heute ein häufig genutzt Technik in immunometabolism Laboratorien; noch extremer Sorgfalt muss sowohl in Stromazellen vascular cell Isolation und in der Durchflusszytometrie-Analyse gemacht werden, so dass die erhaltenen Daten zuverlässig und interpretierbar ist . In diesem Video zeigen wir, wie man Hackfleisch, verdauen, und zu isolieren, das Immunsystem Zellen angereicherte Stromazellen vaskulären Fraktion. Anschließend zeigen wir, wie man Antikörper Label Makrophagen und T-Lymphozyten und wie man richtig Tor auf sie in der Durchflusszytometrie Experimente. Repräsentative Durchflusszytometrie Plots aus fettarm-fed schlank und fettreichen-fed fettleibigen Mäusen vorgesehen sind. Ein wichtiges Element dieser Analyse ist die Verwendung von Antikörpern, die zu tunfluoresziert nicht in Kanälen, in denen AT Makrophagen sind natürlich autofluoreszierenden, sowie die Verwendung der richtigen Kompensation Kontrollen.

Einleitung

Historisch ist das Fettgewebe (AT) als inertes Organ Lipidspeicherung, die expandiert und kontrahiert in Reaktion auf Energiebilanz betrachtet. Wir verstehen jetzt, dass bei einem dynamischen endokrine Organ, das aktiv sondert eine Reihe von Hormonen, die direkten Einfluss auf das Fressverhalten und systemische Glukosehomöostase darstellt. Darüber hinaus in den letzten zehn Jahren hat es eine zunehmende Wertschätzung für die zahlreichen Populationen von Immunzellen mit Wohnsitz in der AT Stromazellen vaskulären Fraktion (SVF), sowie ihren Beitrag zur AT-Homöostase.

Die Fähigkeit, die AT Adipozyten und SVF Verwendung einer Kollagenase-Verdau trennen gefolgt durch differentielle Zentrifugation wurde zuerst von Rodbell 1964 ¹ beschrieben. Collagenase II wird am häufigsten für Adipozyten und SVF Trennung aufgrund von Wartungsarbeiten von Adipozyten Insulin-Rezeptoren ¹ verwendet. Schon früh, enzymatische Fraktionierung von AT wurde in erster Linie eingesetzt, um adipo studierenCyte Stoffwechsel und Präadipozyten zu isolieren. In jüngerer Zeit hat diese Technik, mit der weit verbreiteten Verfügbarkeit von Durchflusszytometern und der ständig steigenden Anzahl von kommerziell erhältlichen fluorophorkonjugierten Antikörper kombiniert, die Charakterisierung von AT Immunzellen erleichtert.

Obwohl die Anwesenheit von Immunzellen im entzündeten AT hatte zuvor ² beschrieben, die bahnbrechenden Arbeiten von Weisberg et al. und Xu et al. veröffentlicht im Jahr 2003 waren die ersten, die Anhäufung von AT Makrophagen (ATMs) in Fettleibigkeit, die inflammatorische Zytokine sezernieren und korrelieren mit AT-spezifische und systemische Insulinresistenz ^3,4 dokumentieren. Diese Beobachtungen diente als Grundlage für ein neues Forschungsfeld vor kurzem geprägt, "immunometabolism", ⁵ und wurden von Studien implizieren verschiedene Immunzellen Bevölkerungsgruppen, einschließlich dendritischen Zellen ^{6, 7} Mastzellen, T-Zellen ⁸ gefolgt ^-10, B-Zellen ^{11, 12} NKT-Zellen, Eosinophile ¹³ und Neutrophilen ^14,15 in der Entwicklung von Adipositas Insulinresistenz.

Das Ziel dieses Artikels ist es, eine detaillierte Beschreibung der Kollagenase Digest Technik verwendet, um Zellen des AT SVF zu isolieren und zu charakterisieren Geldautomaten und AT T-Zellen über Durchflusszytometrie bieten. Dieses Protokoll wurde für Maus optimiert wurde AT, aber die Zuschauer können von der Lektüre einen ausgezeichneten Artikel bieten umfangreiche Detail auf die Optimierung dieser Technik für den menschlichen AT ¹⁶ profitieren. Die Zielgruppe dieses Artikels enthält Ermittler mit begrenzter Erfahrung im Umgang mit Maus und AT Durchführung Durchflusszytometrie. Mehrere praktische Überlegungen zum Ausgleich zellulären Ertrag und Rentabilität mit Zeit und Ressourcen sowie eine optimale Durchflusszytometrie Kontrollen zur Charakterisierung AT Immunzellpopulationen vorgestellt. Zusätzlich zu unserem Protokoll werden die Leser referred einer aktuellen JoVE Artikel von Basu et al. für eine ausgezeichnete Diskussion über einige der technischen Aspekte der Durchflusszytometrie, um eine ordnungsgemäße Kontrollen und Kompensationen ¹⁷ umfassen.

Protokoll

1. Reagenzien und Zubehör

Vor Beginn dieses experimentelle Protokoll, bereiten Sie die folgenden Reagenzien:

1. 70% Ethanol
2. 1X PBS
3. 1X DPBS (ohne Ca und Mg) mit 0,5% BSA ergänzt
4. FACS-Puffer: 1X DPBS (ohne Ca und Mg), 2 mM EDTA und 1% FCS
5. ACK-Puffer: 150 mM NH ₄ Cl, 10 mM KHCO ₃ und 0,1 mM Na ₂ EDTA in Wasser

2. Ernte und Herstellung von Fettgewebe

1. Euthanize Mäusen nach IACUC genehmigten Modalitäten der einzelnen Institution.
2. Gründlich benetzen das Fell mit 70% Ethanol.
3. Einen Einschnitt auf der Ebene des Xiphoidbasis (unterer Teil des Brustbeins) und öffnen Sie die Brusthöhle, um das Herz aussetzen, kümmert sich nicht um irgendwelche großen Blutgefäße durchtrennen.

Hinweis: An dieser Stelle ist es auch hilfreich, um die Membran intakt lassen so viel wiemöglich und eine Kerbe geschnitten aus der rechten Seite des Brustkorbs, um Blut zu ermöglichen und Perfusat zu fließen aus der Brusthöhle.

4. Befestigen Sie den rechten Vorhof, um Blut zu ermöglichen und um das Perfusat Kreislaufsystem zu entkommen.

Hinweis: Beim Umgang mit übergewichtigen Mäusen, überschüssige pericardial AT müssen entfernt werden, um Zugang zum Herzen zu ermöglichen.

5. Fassen Sie das Herz mit einer Pinzette vorsichtig und legen Sie eine Nadel in die linke Herzkammer durch den Scheitelpunkt. Langsam versorgen die Maus mit 15 ml sterilem PBS.

Hinweis: Reduzieren Sie die Anzahl der Perfusion, wenn die Lunge zu füllen und zu erweitern beginnen.

6. Öffnen Sie die Bauchhöhle und entfernen Sie die perigonadal Fettpolster mit Sorgfalt, um alle gonadal Gewebe zu vermeiden.
7. Zeigen Fettpolster in ein Wiegeschiffchen auf Eis mit 2 ml 1X DPBS (ohne Mg oder Ca) mit 0,5% BSA ergänzt, und zerkleinern das AT in feine Stücke.

Hinweis: Begrenzen Sie die Menge von AT pro wiegen Boot bis 1,2 g. Wenn die Menge von mehr als 1,2 g, teilen sie gleichmäßig zwischen zwei Booten wiegen.

8. Halten AT Proben auf Eis und bereiten 3 ml Kollagenase Abbaulösung pro AT Probe, bestehend aus 1X DPBS mit 0,5% BSA, 10 mM CaCl ₂ und 4 mg / ml Collagenase Typ II ergänzt.

3. Kollagenaseverdau

1. Übertragen AT bis 50 ml konische Röhrchen, indem die Homogenat und Spülen das Boot mit 1 ml DPBS (0,5% BSA) und 3 ml Collagenase II Abbaulösung wiegen.
2. Inkubieren bei Homogenat in einer Rotationsrichtung Schüttler (200 Upm) bei 37 ° C für 20 min.
3. 10 ml DPBS (0,5% BSA) auf konische Röhrchen und auf Eis.
4. Man reibt Homogenat mehrmals mit einer serologischen Pipette 10 ml, und übergeben Zellsuspensionen durch 100 um-Filter in einer neuen 50 ml konischen Röhrchen.
5. Zentrifuge Zellsuspension bei 500 g für 10 min bei 4 & dz. B., C.
6. Dekantieren Überstand und resuspendieren SVF Zellpellet in 3 ml ACK-Puffer zur Lyse verunreinigen Erythrozyten.
7. In 12 ml FACS-Puffer und Zentrifuge Zellsuspension bei 500 × g für 10 min bei 4 ° C.
8. Dekantieren Überstand und resuspendieren SVF Zellpellet in FACS-Puffer.

Hinweis: Verwenden Sie die Größe des Zellpellets als Leitfaden für wie viel FACS Puffer resuspendieren in. Wenn das Zellpellet bedeckt den Boden des 50 ml konischen Röhrchen, verwenden 0,5-1 ml FACS-Puffer, andernfalls in 0,25-0,5 resuspendieren ml.

9. Proben auf Eis stellen und bereiten 1:10 Verdünnung Aliquots jeder Probe zur Zellzählung durch Mischen von 40 ul FACS-Puffer, 50 ul Trypanblau-Lösung (0,2%), und 10 ul Zellsuspension.
10. Anzahl lebensfähiger Zellen basierend auf Trypanblauausschluß und verdünnte Zellsuspensionen zu einer Endkonzentration von 5-10 x 10 ⁶ Zellen / ml.

4. Die Färbung der Zelloberflächenantigene

1. In anti-Maus CD16/CD32 Antikörper (Fc-Block) auf eine Endkonzentration von 0,5-1 ug/10 ⁶ Zellen und Inkubation auf Eis für 10 min.
2. Transfer-Proben (≥ 10 ⁶ Zellen) bis 12 x 75 mm Polystyrol Rundbodengefäße. Bereiten getrennten Röhren, wenn die Analyse Geldautomaten und T-Zellen, und kombinieren Sie zusätzliche Zellen, um eine ausreichende Anzahl von Rohren vorzubereiten, um die erforderlichen Ausgleichs-und modifizierten Fluoreszenz minus eins (FMO) Kontrollen unterzubringen.

Hinweis: Als ein Beispiel, bei der Quantifizierung des Anteils von Geldautomaten auf F4/80 und CD11b, die folgende Vergütung und FMO Kontrollen basieren, müssen vorbereitet werden:

- Unstained (Zellen)

- DAPI oder Propidiumiodid (PI) einzigen Fleck (Zellen, fügen Sie nicht Lebensfähigkeit Farbstoff bis Schritt 5.1)

- F4/80 APC einzigen Fleck (Zellen oder Entschädigung Perlen)

- CD11b FITC einzigen Fleck (Zellen oderEntschädigung Perlen)

- FMO 1 (Zellen): Ratte IgG2a κ Isotypenkontrolle APC + CD11b FITC + Lebensfähigkeit Farbstoff (aufgenommen bei Schritt 5.1)

- FMO 2 (Zellen): F4/80 APC + Ratte IgG2b κ Isotypenkontrolle FITC + Lebensfähigkeit Farbstoff (aufgenommen bei Schritt 5.1)

3. In fluorophorkonjugierten Primärantikörper und / oder Isotypkontrollen in der entsprechenden Konzentration (siehe Tabelle von Reagenzien und Materialien).
4. Schützen Proben aus Licht und Inkubation bei 4 ° C für 30 min.
5. 2 ml FACS-Puffer und Zentrifuge Zellsuspension bei 500 xg für 5 Minuten bei 4 ° C.
6. Dekantieren Überstand und resuspendieren SVF Zellpellet in 2 ml FACS-Puffer.
7. Zentrifuge Zellsuspension 500 xg für 5 min bei 4 ° C und resuspendieren SVF Zellpellet in ≥ 400 ul FACS-Puffer.
8. Übertragen Proben bis 12 x 75 mm Polystyrol Rundbodengefäße mit einer 35 um Zellsieb tube tops ausgestattet.
9. Vor Licht und Aufbewahrung der Probe bei 4 ° C bis FACS-Analyse.

Hinweis: Für optimale Ergebnisse sollte immeadiately Zellen analysiert werden, jedoch FACS-Analyse mit diesem Protokoll wurde erfolgreich auf markierten Zellen in FACS-Puffer gespeichert 1-2 h durchgeführt bei 4 ° C. Wenn Zellen, die an Lagerzeit zu erhöhen, dann können markierten Zellen mit 2% Paraformaldehyd bei 4 ° C für 24 Stunden vor der FACS-Analyse fixiert werden. Antikörper Unternehmen deuten darauf hin, dass für die markierten Zellen gespeichert werden können bis zu einer Woche, aber dies nicht im Rahmen dieses Verfahrens geprüft.

5. FACS-Analyse

1. Vor FACS Analyse hinzuzufügen Lebensfähigkeit Farbstoff und entsprechende Kontrollen für Live / Dead Zelldiskriminierung ermöglichen.

Hinweis: Zahlreiche Lebensfähigkeit Farbstoffe sind im Handel erhältlich, aber DAPI und PI empfohlen je nach Anregung / Emission Prof.iles der Fluorophor-konjugierten Antikörpern verwendet wird. DAPI und Propidiumiodid werden zu jeder Probe in einer Endkonzentration von 0,2 mg / ml zugegeben.

2. Verwenden Sie einen ungefärbten negativen Kontrollprobe, vorzugsweise Zellen aus dem gleichen Gewebe wie die experimentellen Proben isoliert, um Seitwärtsstreuung (SSC) und Forward Scatter (FSC) so einstellen, dass die Zell-Population (n) von Interesse auf der Skala sind.

Hinweis: Für die Analyse von AT SVF Zellen, es wird empfohlen, dass SSC in einer logarithmischen Skala gegen FSC in einer linearen Skala angezeigt werden. Die Verwendung einer logarithmischen Skala für SSC ist besonders wichtig bei der Analyse von ATMs, die oft sehr groß und Granulat.

3. Zeichnen Sie eine erste Lichtstreuung Tor von der Art der Zelle (n), die analysiert basierend, und stellen Sie den Photomultiplier (PMT) gewinnen, so dass die ungefärbte Zellen auf der anderen von einem einzigen Parameter-Histogramm nach links (etwa auf 10 ² zentriert) sind für die entsprechenden Kanäle.

Hinweis: Es wird empfohlen, Lymphozyten und Makrophagen (oder anderen myeloischen Zellen) gesondert aufgrund von Unterschieden in Autofluoreszenz analysiert werden.

4. Benutzen gefärbten Kontrollen oder Antikörper-Einfang Entschädigung Perlen Multi-Color-Kompensation durchzuführen.

Hinweis: Die Verwendung der Entschädigung Perlen wird empfohlen, jedoch Verträglichkeit jedes Antikörpers muss gewährleistet sein. Zum Beispiel kann eine Entschädigung Perlen nicht mit Kaninchen-Antikörper, in welchem ​​Fall isolierten Zellen erforderlich ist, um eine angemessene Kontrolle einzigen Fleck erhalten werden Kreuzreaktion.

5. Set experimentellen Toren auf modifizierten FMO Kontrollen.
6. Stellen Sie die Durchflusszytometer, die entsprechende Anzahl von Ereignissen über die Prävalenz der Bevölkerung von Interesse basierend sammeln und aufzuzeichnen experimentellen Daten.
7. Export FCS-Dateien für die Offline-Analyse. Es gibt zahlreiche Programme für Durchfluss cytometry Datenanalyse. Wir empfehlen Cytobank, eine web-basierte Plattform, die investigatores zu speichern und zu analysieren und erzeugen Bilder von jedem Computer mit Internet-Zugang ¹⁸ erlaubt. Darüber hinaus bietet Cytobank die Fähigkeit, Daten öffentlich zugänglich sind oder der Zugriff auf Mitarbeiter.

Ergebnisse

Collagenase Verdauung von AT durch differentielle Zentrifugation wurde die SVF von Nebenhoden Fettpolster männlichen C57BL/6J-Mäusen isolieren zugeführt einer fettarmen (10% kcal aus Fett) oder hohen Fett (60% kcal aus Fett) Ernährung (LFD und HFD , jeweils) für 16 Wochen. Zellen des SVF wurden dann mit einem Fluorophor konjugiert primären Antikörpern markiert, um den Anteil von lebensfähigen Geldautomaten (1) und T-Zellen (2) über FACS-Analyse quantifiziert. Initial Gating, ei...

Diskussion

Das zunehmende Interesse an der Rolle des Immunsystems in den metabolischen Konsequenzen der Adipositas hat die weit verbreitete Verwendung von Durchflusszytometrie, um Immunzellen des AT charakterisieren geführt. Obwohl die genaue Protokoll zwischen den Labors auf ihre eigene Erfahrung und die Ausstattung variieren, bezogen wird, sind die kritischen Schritte Kollagenaseverdau, differentielle Zentrifugation und Zelloberflächenantigen Kennzeichnung. Das Ziel des vorliegenden Artikels ist es, ein detailliertes Protokoll...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml	Life Technologies	14190-250
DAPI	Life Technologies	D3571
BSA	Sigma	A2153-100G
collagenase	Sigma	C6885-5G
propidium iodide solution	Sigma	P4864-10 ml
stable stack 20 microliter	Rainin	SS-L10
20 microliter filter tips	Rainin	SRL10F
stable stack 250 microliter tips	Rainin	SS-L250
1000 microliter tips	Rainin	GPS-L1000
1000 microliter filter tips	Rainin	GP-L1000F
250 microliter Filter Tips	Rainin	SR-L200F
FC Block	BD Biosciences	553142
fisher 100mn strainers	Fisherbrand	22-363-549
medium weigh dish	Fisherbrand	02-202B
aluminum foil	Fisherbrand	1213100
mincing scissors	Fisherbrand	089531B
Vortex	Fisherbrand	2215365
50 ml conical tubes	BD Falcon	14-959-49A
filter top FACS tubes	BD Falcon	352235
10 ml pipette case 200	BD Falcon	1367520
round bottom tubes	BD Falcon	352058
5 ml syringe	BD Falcon	309646
V Bottom Plates	Costar	07-200-107
transfer bulb pipette	Thermo Scientific	13-711-22
Shaker	Thermo Scientific	11 676 071
Adhesive mat	Thermo Scientific	1368750
Cell Culture Centrifuge	Sorvall	75253839
Adapters	Sorvall	75003723
Rat anti-mouse CD16/CD32	BD Biosciences	553142	Concentration: 0.5 - 1 μg/ 106 cells
Rat anti-mouse F4/80	eBioscience	17-4801	Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 17-4321
Rat anti-mouse CD11b	eBioscience	11-0112	Fluorophore conjugate: FITC Concentration: 0.5 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 11/1/4031
Armenian Hamster anti-mouse CD11c	eBioscience	12-0114	Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: Dec-88
Goat anti-mouse MGL1/2	R&D Systems	FAB4297P	Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P
Goat anti-mouse CD206	R&D Systems	FAB2535P	Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P
Rat anti-mouse CCR2	R&D Systems	FAB5538P	Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC013P
Armenian Hamster anti-mouse TCRβ	BD Biosciences	553174	Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 553956
Rat anti-mouse CD8a	BD Biosciences	552877	Fluorophore conjugate: PE-Cy7 Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 552784
Rat anti-mouse CD4	BD Biosciences	557956	Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700 Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 557963
Table 1. List of Materials and Reagents.