Erfassen, Visualisieren und Quantifizierung der Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies in einem Modellsystem Amoeba

Zusammenfassung

Wir geeignet einen Satz von Protokollen für die Messung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die in verschiedenen Amöben und Säugerzellmodellen für die qualitative und quantitative Untersuchungen angewendet werden können.

Zusammenfassung

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) umfassen eine Reihe von reaktiven und kurzlebigen, sauerstoffhaltigen Moleküle, die dynamisch ineinander oder entweder katalytisch oder spontan eliminiert. Aufgrund der kurzen Lebensdauer der meisten ROS und der Vielfalt ihrer Quellen und subzellulärer Lokalisierungen kann ein vollständiges Bild nur durch sorgfältige Messungen mit einer Kombination von Protokollen erhalten werden. Hier präsentieren wir eine Reihe von drei verschiedenen Protokolle mit OxyBurst Green (OBG)-beschichteten Perlen oder Dihydroethidium (DHE) und Amplex UltraRed (AUR), qualitativ und quantitativ zu überwachen verschiedenen ROS in professionellen Phagozyten wie Dictyostelium. Wir optimierten die Perlen Beschichtungsverfahren und gebrauchten OBG-beschichteten Perlen und Live-Mikroskopie intraphagosomal ROS Generation auf Einzelzellebene dynamisch visualisieren. Wir identifizierten Lipopolysaccharid (LPS) aus E. coli als potenter Stimulator für ROS Generation in Dictyostelium. Darüber hinaus haben wir dntwickelt Echtzeit, Mitteldurchsatz-Assays mit DHE und AUR zur ​​quantitativen Messung der intrazellulären Superoxid-und extrazellulären H ₂ O _2-Produktion auf.

Einleitung

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) in einer Vielzahl von biologischen Prozessen wie der Wirtsabwehr, Signalisierung, Gewebeentwicklung und Reaktion auf eine Verletzung und Bluthochdruck und Krebs beteiligt. Die gut untersuchten phagosomalen NADPH-Oxidase-Maschinen, um eine schnelle ROS Generation, wie die oxidative burst bekannt gewidmet, um Bakterien in Neutrophilen 'Phagosomen ¹ aufgenommen zu töten. Darüber hinaus wurde eine Leckage von Elektronen als ein Nebenprodukt der mitochondrialen Atmungskette bisher angenommen lediglich für eine ungeregelte Quelle von ROS sein. Aber vor kurzem wurde es als ein wichtiger Mechanismus, um intraphagosomal Abtötung von Bakterien in Maus-Makrophagen ² beitragen identifiziert. In den letzten Jahren, die soziale Amöbe Dictyostelium, hat sich zu einem leistungsstarken und beliebten Modell zu Zelle intrinsischen Mechanismen der angeborenen Immunantwort zu untersuchen. Tatsächlich Dictyostelium und Menschenfresszellen teilen sich eine überraschend hohe Niveau der Erhaltung in molecular Maschinen für Bakterien erfassen, Einwirkung und Tötung ^3,4 verantwortlich. Die Homologen von Proteinen und Enzymen, um die ROS-Produktion oder Entgiftung, wie NADPH-Oxidase, Katalase, Superoxiddismutasen stehen, kann sowohl in der Human-und Dictyostelium gefunden werden. Als die am besten untersuchten Amöbe Dictyostelium stellt mehrere einzigartige Vorteile gegenüber Säugermodellsystem. Sie wachsen bei Raumtemperatur ohne die Notwendigkeit für CO _2, mit einer Verdopplungszeit von 8-10 Stunden. Sie können leicht als adhärente oder Suspensionskulturen gehalten werden. Darüber hinaus dank ihrer vollständig sequenziert und annotierte haploiden Genom, und einfach genetische Manipulation, Dictyostelium hat sich zu einem sehr attraktiven experimentellen Modellorganismus.

In früheren Studien verschiedene chlorierte und fluorierte Derivate von Fluorescein-Fluoreszenz, die nach der Oxidation durch ROS emittieren (kollektiv als OxyBurst Grün, OBG bekannt), wurden als ROS-Reporter verwendet. Handy-permeant esterified Derivate zur zytoplasmatischen ROS zu messen, während die Zell-impermeante Dextran-oder Protein-gekoppelten Derivate zur extrazellulären ROS messen. Insbesondere haben OBG BSA-beschichteten Kügelchen bereits zur phagosomalen ROS-Produktion in Säugerzellen ⁵ zu erkennen. Allerdings kann die Mikroplatten-Reader-Ansatz geben nur eine gemittelte ROS Erzeugungskurve aus einer Population von Zellen. Mit der vorliegenden Protokolls unter Verwendung Dictyostelium, eine professionelle Phagozyten und optimierte Versuchsbedingungen erhalten wir stabile und effiziente Phagozytose ohne jede Konjugation Opsonin auf die Perlen. DHE in verschiedenen Modellsystemen, wie Säuger Neutrophilen und Makrophagen verwendet worden, um zu erkennen ROS ^6-9. Inzwischen gibt es einige Kontroversen über die Spezifität und Sensitivität der Methode ^8,10. Als verbesserte Version Amplex Red, der Fluoreszenzintensität von AUR weniger empfindlich auf pH-Wert, die es geeignet macht, um zu messenROS in nicht neutrale oder schwach sauren Milieus. AUR wurde kürzlich in mehreren Säugetiersystemen ^11,12 aufgebracht, aber ihre Verwendung in Säuger-Modelle, die ziemlich oft erforderlich schwach sauren Wachstumsmedien, wurde noch nicht berichtet worden. Darüber hinaus gibt es keine veröffentlichten Protokoll quantitativ und dynamisch zu messen ROS-Produktion und Lokalisierung in der sozialen Amöbe Dictyostelium.

Das Ziel der dargestellte Satz von Protokollen ist, eine einfache und vielseitige Lösung für verschiedene ROS und deren Lokalisation überwachen und weitere Einblicke in ROS bezogenen zellulären Mechanismen. Für die OBG-Test, haben wir Live-Mikroskopie, um den gesamten Prozess der phagosomalen ROS Generation nach Aufnahme von OBG-beschichtete Beads Dictyostelium-Zellen zu überwachen, und ein neuer Ansatz, den Mechanismus der intraphagosomal Abtötung von Bakterien zu untersuchen. Wir haben mittel-Durchsatz DHE und AUR-Assays in Dictyostelium optimiert, um die intrazelluläre Superoxid messenide und extrazellulären H ₂ O _{2-Produktion,} bzw. mit Hilfe LPS als potenter Stimulator ROS. Beachten Sie, dass LPS wurde kürzlich gezeigt, dass die bakterizide Aktivität von Dictyostelium Richtung Phagozytose Bakterien ¹³ zu erhöhen. Zusätzlich Behandlung mit DEDTC und Katalase ausdrücklich bestätigt, dass diese beiden Methoden speziell messen verschiedene Typen und subzellulärer Lokalisierungen von ROS in Dictyostelium. Schließlich kann der Test zur OBG anhaftendem phagozytische Zelle ferner opsonisierender der Kügelchen mit Liganden für die phagozytische Rezeptoren von tierischen Zellen angepasst werden. Im Prinzip können die DHE und AUR-Assays auch fein abgestimmt für Messungen in anhaftendem oder nicht-adhärenten Zell unter geeigneten experimentellen Bedingungen.

Protokoll

1. Visualisierung und qualitative Messung der ROS-Produktion in Phagosomen

Die OBG-beschichteten Kügelchen sollten im Voraus vorbereitet werden. Die Perlen Beschichtungsverfahren und Agar Overlay-Technik werden die veröffentlichten Referenzen ^5,14 angepasst.

1. 1 ml Suspension von 3,0 um carboxylierten Silica-Kügelchen (ca. 1,8 x 10 ⁹ Perlen) in ein 1,5-ml-Röhrchen, waschen Sie die Beads 3x mit 1 ml PBS durch schnelle Drehung und Vortex.
2. Resuspendieren der Kügelchen in 1 ml PBS mit 25 mg / ml Cyanamid (die carboxylierten Silicakügelchen aktivieren kovalent vormarkiert BSA zu binden), Inkubation auf einem Rad 15 min.
3. 3x Waschen mit 1 ml Kopplungspuffer (0,1 M Natrium-Borat, pH 8,0) durch schnelle Runde (Zentrifuge bei voller Geschwindigkeit in einer Tischzentrifuge für Mini 5 Sekunden oder alternativ Zentrifuge bei 2000 g für 1 min in einer Tischzentrifuge) und Vortexen, um überschüssige Cyanamid zu entfernen.
4. Mischen Sie die gewaschenen Perlen mit 500 ul coupling Puffer mit 1 mg OxyBurst Green (OBG) H2HFF (dihydro-2 ', 4,5,6,7,7'-hexafluorofluorescein)-BSA, füllen Sie das Rohr mit Stickstoffgas aus einer Standard-Gas-Dose vor der Deckelung und Inkubation auf einem Rad 14 Stunden (über Nacht) bei RT im Dunkeln.
5. Waschen Sie die Beads 2x mit 1 ml Löschpuffer (250 mM Glycin in PBS), um nicht umgesetzte OBG zu entfernen, und zweimal mit Kupplungspuffer, um den Löschpuffer durch schnelle Drehung und Verwirbelung zu entfernen.
6. 1 ml Kopplungspuffer, enthaltend 50 &mgr; g des Alexa Fluor 594 Succinimidylester an BSA konjugiert. Das Rohr wird vor dem Verschließen mit Stickstoff und Inkubieren auf einem Rad für 1,5 h bei Raumtemperatur im Dunkeln.
7. Waschen Sie die Beads 3x mit 1 ml Puffer Abschrecken durch schnelle Drehung und Wirbeln, um die Reaktion zu stoppen, dann waschen die Beads 3x mit 1 ml PBS durch schnelle Drehung und Vortex.
8. Schließlich Resuspendieren der Kügelchen in 1 ml PBS mit 2 &mgr; l 10% w / v Azid für langfristige Lagerung. Messen Sie die concentration der Raupen in der Suspension mit einer Zählkammer (in der Regel etwa 1-2 x 10 ⁹ Perlen / ml), füllen Sie das Rohr mit Stickstoff vor der Deckelung, und bei 4 ° C im Dunkeln.
9. Die Beschichtungseffizienz des OBG Fluorescein kann durch Prüfen des Emissionsspektrums mit einer Anregung bei 500 nm getestet werden. Wenn H ₂ O ₂ in Gegenwart von Meerrettichperoxidase (HRP) oxidiert, die Fluoreszenzintensität des oxidierten Perlen, bei Emissionspeaks (538 nm), ist die 11-12-fach höher als die der nicht-oxidierten beschichteten Perlen.
10. Ernte exponentiell wachsenden Dictyostelium-Zellen aus einer 10 cm Petrischale, Platten unterschiedlicher Dichte der Zellen auf 3 cm Gerichte mit einer optisch klaren Kunststoff-oder Glasboden, und wachsen sie über Nacht. Wählen Sie die Gerichte, die etwa 80% konfluent für das Experiment sind. Ein detailliertes Protokoll für die Kultivierung von Dictyostelium-Zellen wurde veröffentlicht ^15.
11. Ersetzen Sie das Kulturmedium mit LoFlo Medium (LF-Medium), Inkubation2 h vor dem Experiment, um die extrazellulären und intraendosomal Autofluoreszenz des HL5C Kulturmedium zu verringern.
12. Parallel Schmelze 10 ml 1,5% Bacto Agar in LF Medium, gießen Sie die Agar auf eine flache Oberfläche (dh eine Glasplatte von 10 cm x 10 cm), um eine Agar-Schicht etwa 1 mm Dicke zu bilden, warten Sie 10-15 min verfestigt. Schneiden Sie die Agar-Schicht in 2 cm x 2 cm große Quadrate und in LF Medium für die spätere Verwendung.
13. Unterdessen bereiten die Spinnplatte oder Weitfeldmikroskop, stellen Sie die Temperatur der Klimakammer bei 22 ° C und die Einstellungen für dieses Experiment. (Siehe weitere Kommentare in der Diskussion).
14. Nach 2 Stunden Inkubation absaugen LF Medium von der 3 cm Schale, aber die Zellmonoschicht sollte noch mit einem dünnen Film des Mediums erfasst werden. Verdünnen Sie die beschichteten Kügelchen bis 1,5 x 10 ⁷ Perlen / ml, und fügen Sie 10 ul auf die Zellschicht.
15. Nehmen Sie ein Quadrat Agar Blatt, abtropfen überschüssige Flüssigkeit aber feucht halten. Sanft legte the-Agar Quadrat auf der Oberseite der Zellschicht. Den Agar-Quadrat nicht, wenn er sich auf den Zellen liegen. Die Agar-Overlay wird verwendet, um den Kontakt zwischen Perlen und Zellen zu erhöhen, wodurch die Verbesserung der Aufnahme, und es auch leicht komprimiert die Zellen, halten sie besser in der Brennebene des Objektivs.
16. Setzen Sie den Deckel auf die Schüssel, legen Sie es auf den Mikroskoptisch, und automatisch Bilder in den Rot-, Grün-und Phasen Kanäle alle 1 min für 2 Stunden oder länger.
17. Wählen und konzentrieren sich auf die zelluläre Ereignisse, die den gesamten Prozess der Phagozytose enthalten. Zusammenführen der drei Kanäle optimiert und montieren Sie die Bilder in einen Film mit professionellen Bildbearbeitungssoftware. Quantifizieren Fluoreszenzintensitäten von jeweils ausgewählten Perlen in rot und grün-Kanälen, und das Verhältnis von Grün / Rot wird die dynamische phagosomalen ROS-Produktion der Zellen reflektieren.

2. Quantitative und Medium-Throughput-Messung der intrazellulären Superoxid-Produktion

1. Sammeln one 80% konfluent Gericht aus Dictyostelium in 10 ml HL5C Medium. Centrifuge Dictyostelium-Zellen bei 850 g für 5 min, sorgfältig und vollständig absaugen überschüssiges Medium. Die Zellen in SS6.4 Puffer [0,12 M Sorbitol in Sorensen-Puffer (14,69 mM KH ₂ PO ₄ und 6,27 mM Na ₂ HPO _4), pH 6,4], zählen Zellen und zu verdünnen, um eine endgültige Dichte von 6 x 10 ⁶ Zellen / ml (siehe weitere Kommentare in der Diskussion).
2. In 50 ul der Zellsuspension in jede Vertiefung einer undurchsichtigen weißen 96-Well-Platte (siehe zusätzliche Kommentare in der Diskussion).
3. Verdünnen DHE Lager (30 mM in DMSO) 500-fach mit SS6.4, Pipette 50 ul verdünnte DHE in jede Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette, wenn nötig. Die Endkonzentration von DHE 30 uM. Die Reaktion beginnt sofort.
4. Stimuli oder Inhibitoren können an dieser Stelle nach den spezifischen Bedürfnissen zugegeben werden, oder zu anderen Zeitpunkten.
5. Verwenden Sie den Endpunkt "top Lesen & #34; Modus eines Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader, mit Fluoreszenzanregung / Emission bei 522 nm nm/605, lesen Sie alle 2 min für 1 h, mittel-Shake 5 sec / min, bei 22 ° C

3. Quantitative und High Throughput Messung der extrazellulären H ₂ O _2-Produktion

1. Befolgen Sie die gleichen Schritte wie in 2.1 und 2.2 beschrieben.
2. Bereiten verdünnten HRP durch Zugabe von 5 ul HRP Lager (100 U / ml in destilliertem Wasser) in 10 ml SS6.4, Vortex oder das Röhrchen gut mischen und auf Eis für die spätere Verwendung zu halten. Die verdünnte Lösung ist HRP bei 0,05 U / ml.
3. Bereiten Sie die AUR Reaktionsgemisch durch Mischen der AUR Lager (10 mM AUR in DMSO) und die verdünnte Lösung in HRP SS6.4 Puffer, um die endgültigen Konzentrationen von 6,25 uM und 0,005 U / ml. Als ein Beispiel, um das Reaktionsgemisch für 40 Reaktionen vorzubereiten, mischen Sie 1600 ul SS6.4 mit 400 ul der verdünnten HRP und 2,5 ul AUR-Stammlösung.
4. In 50 ul AUR-Mixtur in jede Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette, wenn nötig. Nun ist die Reaktion beginnt.
5. Stimuli oder Inhibitoren können an dieser Stelle nach den spezifischen Bedürfnissen zugegeben werden, oder zu anderen Zeitpunkten.
6. Verwenden Sie den Endpunkt "top Lesen"-Modus eines Fluoreszenz-Mikroplattenleser, mit Fluoreszenzanregung / Emission bei 530 nm nm/590, lesen Sie alle 2 min für 1 h, mittel-Shake 5 sec / min, bei 22 ° C

Ergebnisse

Die Erzeugung von ROS in Phagosomen qualitativ und dynamisch durch Mikroskopie (File S1) visualisiert werden. Die rote Fluoreszenz von Alexa Fluor 594 emittiert ist pH-unempfindlich und bleibt in der Umgebung phagosomalen konstant, während die Oxidation von OBG erhöht die Fluoreszenz im grünen Kanal. Die Emissionsspektren von in vitro oxidiert und oxidierte OBG-beschichteten Kügelchen sind in Fig. 1B verglichen wird, zeigt eine deutliche Erhöhung der Intensität nach der O...

Diskussion

Im Vergleich zu den zuvor beschriebenen Verfahren, das OBG-Assay visualisiert dynamisch den Prozess der phagosomalen ROS auf Einzelzellebene, anstelle der Messung einer durchschnittlichen ROS Signal von einer Population von Zellen. Solche Bevölkerungs-Mittelungsverfahren neigen dazu, wichtige Informationen von nicht-synchronen Phagozytose verursacht verschleiern. Wir haben erfolgreich DHE und AUR Assays Dictyostelium angepasst und optimiert die Protokolle. Am wichtigsten ist, wir die angegebenen Typen und subz...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
OxyBURST Green H2HFF BSA	Invitrogen	O-13291
Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-20004
Carboxylated silica beads	Kisker Biotech	PSi-3.0COOH
HL5C medium	ForMedium	HLC0102
LoFlo medium	ForMedium	LF1001
Bacto agar	BD	204010
Dihydroethidium	Sigma	37291-25MG
Amplex UltraRed	Invitrogen	A36006
Horseradish peroxidase	Roche	10108090001
Diethyldithiocarbamate (DEDTC)	Sigma	D3506-100G
Catalase	Sigma	C9322-1G
Cyanamide	Sigma	187364-25G
Lipopolysaccharides	Sigma	L2630-25G
EQUIPMENT
ibidi μ-Dish 35 mm, high	ibidi	81156	Bottom made of optically clear plastic
MatTek dish 35 mm	MatTek corporation	P35G-1.5-14-C	Bottom made of a glass coverslip
Scepter Cell Counter	Merck Millipore	PHCC00000
White 96 well plate	Nunc	236108
Centrifuge	SORVALL	Legend RT
Microplate reader	BioTek	Synergy Mx