Flexible Koloskopie in der Maus, um die Schwere der Colitis und kolorektalen Tumoren auswerten mit einem validierten Endoskopische Scoring System

Zusammenfassung

In den vergangenen Jahren wurden neue Generation Endoskope wichtige diagnostische Forschung Hilfsmittel zum Auswerten murinen Colitis und kolorektalen Tumoren entwickelt. Wir stellen hier ein detailliertes Protokoll für endoskopische Beurteilung von Entzündungen und kolorektalen Tumoren in Mäusen, sowie eine neuartige Bewertungssystem, das Dezimal-Identifikatoren verwendet, um die Schwere der endoskopischen ulcerosa und kolorektalen Tumoren dokumentiert.

Zusammenfassung

Der Einsatz der modernen Endoskopie für Forschungszwecke hat unser Verständnis von Magen-Darm-Erkrankungen erleichtert. Insbesondere hat experimentelle Endoskopie sehr nützlich für Studien, die wiederholt Einschätzungen in einem einzigen Versuchstier, wie die Bewertung der Mechanismen von chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen und das Fortschreiten von Darmkrebs erforderlich gewesen. Jedoch sind die verschiedenen Studien verwendeten Verfahren sehr variabel. Mindestens drei endoskopischen Scoring-Systeme sind für murine ulcerosa veröffentlicht und veröffentlichte Protokolle zur Beurteilung von kolorektalen Tumoren nicht die Anwesenheit von Begleit Kolonentzündung adressieren. Diese Studie entwickelt und validiert eine reproduzierbare endoskopische Scoring-System, die Auswertung der beiden Entzündungen und Tumoren gleichzeitig integriert. Diese neue Scoring-System besteht aus drei Hauptkomponenten: 1) Bewertung des Ausmaßes und der Schwere der Entzündung kolorektalen (basierend auf perianalen Ergebnisse, die Transparenz der wall, Schleimhautblutungen und fokale Läsionen), 2) quantitative Erfassung der Tumorläsionen (Netzkarte und Balkendiagramm) und 3) numerischen Sortierung der klinischen Fälle durch ihre pathologischen und Forschungs Relevanz basierend auf Dezimaleinheiten mit zugeordneten Kategorien von Läsionen beobachtet und endoskopischen Komplikationen (dezimal Kennungen). Die Video-und Manuskript hier vorgestellt wurden vorbereitet, nach IACUC genehmigten Protokolle, damit die Ermittler ihre eigenen Versuchsmäusen punkten mit einem gut validierten und hoch reproduzierbare endoskopische Methode, mit der Möglichkeit, System, distal von proximalen endoskopische ulcerosa (D-PECS unterscheiden ).

Einleitung

Murine Endoskopie hat als nützliches Forschungswerkzeug für über ein Jahrzehnt ^1-3 durchgeführt. Bis heute haben die meisten Studien unter Verwendung muriner Endoskopie starre Endoskope verwendet, obwohl einige auch Sigmoidoskopie. Murine Endoskopie liefert sofortige Ergebnisse und eine objektive Schätzung der Höhe der Darm Normalität, der Schwere der Entzündung und Tumorprogression im Vergleich zu indirekten Maßnahmen wie Gewichtsverlust, Durchfall und Histologie (was suboptimal ist, wenn Läsionen sind lückenhaft), während bietet Einblicke auf die allgemeine Gesundheit des Dickdarms. Vor allem ermöglicht die Endoskopie für die wiederholte Beurteilung der Versuchstiermodellen über die Zeit, im Gegensatz zu herkömmlichen histologischen Untersuchung, die das Tier eingeschläfert werden Doppelpunkte und für die Analyse geerntet ¹ erfordert. Trotz dieser Vorteile hat sich die Verwendung von murinen endoskopische Technik nicht weit verbreitet gewesen, und ist durch das Fehlen von standardisierten Protokollen zur Implementie begrenztauf und Scoring von pathologischen Befund. Richtig umgesetzt, murine Endoskopie ist sehr vielversprechend, um unser Verständnis und Charakterisierung von Tiermodellen von mehreren chronischen Magen-Darm-Erkrankung Staaten, darunter entzündliche Darmerkrankungen, Colitis, und kolorektalen Tumoren weiter zu erleichtern.

Der Nutzen der murinen endoskopische Technik Scharniere auf seine Reproduzierbarkeit und Objektivität, die die Existenz von standardisierten Untersuchungsverfahren und eine konsistente, nicht-redundante und zuverlässige Scoring-System für Darmerkrankungen erfordert. Mindestens drei beschreibende Bewertungssysteme für die endoskopische Beurteilung ulcerosa ^4-6 sowie für Kolon-Tumoren in Mäusen ^4,7,8 veröffentlicht worden. Diese berichtet, Ansätze und Scoring-Systeme sind jedoch nicht ohne weiteres vergleichbar zwischen den Studien. In vielen Fällen gibt es keine klare Definition der Kriterien für die Klassifizierung von Läsionen verwendet, und wenn Kriterien gegeben sind, stark variieren sie. Außerdemgibt es keine Berichte über Scoring-Systeme, die die Bewertung sowohl ulcerosa und Tumoren, zwei der häufigsten Darmerkrankungen, die gleichzeitig auftreten und interaktive Effekte auf das Ergebnis kann in einem einzigen Messinstrument zu integrieren. Schließlich sind die endoskopischen Scoring-Systeme, die für die Colitis existieren oft entzündliche Kategorien mit Diskriminierung beschränkt (dh. Engen Scoring-Optionen über kurze ganze Zahl Waage, oft 1-4), um richtig darstellen Fortschreiten der Krankheit Szenarien und ermöglichen den Einsatz von parametrischen statistischen Analyse.

In diesem Papier beschreiben wir die Verwendung eines flexiblen Endoskops, um die Schwere von Mäuse ulcerosa und Kolontumoren bewerten und beschreiben ein Standardprotokoll für die Anwendung dieser Technologie in der anatomischen Beurteilung der perianalen Region, Rektum und distalen Kolons. Wir veranschaulichen, effektiven Fehlersuche während der Endoskopie, um Trauma-und Bildartefakte zu minimieren, und wir beschreiben eine reproduzierbare Bewertungssystembasierend auf validierten veröffentlichten klinischen Parametern. Das Scoring-System integriert Auswertung der beiden Darmentzündung und Tumoren mit einem hohen Grad an Diskriminierung mit 12 möglichen Sorten von Entzündungen, Tumor Mapping-und Zeichenoptionen und einer neuartigen Dezimaleinheit System (dh, Dezimal-Kennungen), um Ergebnisse mit spezifischen diagnostischen Wert zu markieren ( dh Tumorentwicklung, Komplikationen während der Endoskopie, etc.). Die Verwendung von Dezimalkennungen ermöglicht eine schnelle Verfolgung der relevanten Datensätze für Downstream-Analyse. Schließlich führen wir Zuverlässigkeit und Gültigkeit Testen der Scoring-System in mehreren murinen Modellen von Colitis ulcerosa und-assoziierten Krebs (Dextransulfat-Natrium (DSS)-induzierter Kolitis, Clostridium difficile-Infektion, und azoxymethane / DSS-induzierten Dickdarmkrebs).

Protokoll

1. Einrichten des Endoskopie-System

1. Stellen Sie das System vor der Endoskopie Anästhesie die Mäuse nach der Anleitung des Herstellers. Verwenden Sie ein Video Ureteroskop für den Menschen für dieses Protokoll entwickelt (Abbildung 1). Der Außendurchmesser des Einführungsrohres beträgt 9,9 Fr (3,3 mm), dessen distales Ende 8.5 Fr (2,8 mm), und der Innendurchmesser des Instrumentenkanals 6 Fr (1,2 mm).
2. [9] Obwohl die Verwendung von Endoskopen nicht auf die Übertragung von Krankheiten in Verbindung gebracht worden, Sterilisieren des Endoskops und der Linse mit 70% Ethanol ¹⁰ oder mit geeigneten Techniken bei der Arbeit mit sporenbildenden Mikroorganismen. Bereiten bakteriostatische steriles Gleitmittel und nicht kratz wischen Gewebe, um die Endoskopspitze zu sättigen.
3. Bringen Sie ein 3-ml-Spritze voller Luft (oder eine geeignete CO _{2-Gasgemisch)} an die Spitze des Instrumentenkanals.
4. Schalten Sie den Strom an und richten Sie den Weißabgleich in normalen weißen Licht,sowie Narrow Band Imaging (NBI)-Modus, wenn anwendbar. Seit 2001 hat NBI diagnostische Bildgebung gewährt hat, es feinen Blutgefäßstrukturen auf Schleimhäuten, einschließlich Colitis und Tumorläsionen, die charakteristisch abnormale Gefäß ¹¹ haben betont. NBI-Filter-Modus beschränkt die Wellenlänge des einfallenden Lichts, um 390-445 nm und 530-550 nm, die Strukturen mit Hämoglobin hervorhebt.
5. Drucken Sie das Formular Scoring-Bewertung (Abbildung 2), um Ihre Ergebnisse aufzuzeichnen. Machen Sie sich mit erwarteten normalen und NBI Bilder (3A) sowie die Definition und Qualitäten der einzelnen Kriterien vor der Prüfung vertraut (siehe Abschnitt 6.1).
6. Vorbereitung einer farbstoffbasierten Lösung auf Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) für Chromoendoskopie, falls gewünscht. In Chromoendoskopie wird die Prüfung durchgeführt, mit einem Farbstoff als Kontrastmittel zu Schleimhautveränderungen zu markieren. Verwenden Methylenblau (0,1-1%) und Indigokarmin (0,1%)-Lösungen (Abbildung 3B). Anmerkungdaß Methylenblau ist ein Oxidations-Reduktionsmittels, die oxidierende Radikale, indirekte Vernetzung der Aminosäurereste und Abbau der DNA ^12, die mit der Probe Analyse stören könnten produzieren kann.

2. Allgemeine Anästhesie der Maus

1. Wählen Sie das Narkosemittel und Art der Anwendung. Konsultieren Sie einen Tierarzt von einem Tier Ressource Einrichtung oder Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) in Bezug auf eine mögliche Störung von Medikamenten mit dem Immunsystem und Forschungsziele. Einige Medikamente können Zytokinprofils Ausdruck bei Tieren beeinflussen, einschließlich ¹³ Nagetiere. Verwenden injizierbaren Tribromethanol für Terminal Verfahren oder Isofluran für das Überleben Endoskopien, zusammen mit den entsprechenden Kontrollen.
2. Für die Induktion, verwalten 4-5% Isofluran in 100% Sauerstoff bei einer Rate von 0,2-0,5 L / min; verwenden 0,5-2% für die Wartung. Dieses Protokoll ist nicht für alle Tiere geeignet. Fragen Sie Ihren Tierarzt Anlagefür die richtige Anleitung und Schulung. Halten Sie sich an relevanten IACUC Empfehlungen, die höchsten Standards für den Tierschutz zu erreichen. Stellen Sie sicher, dass die Maus, wenn vollständig betäubt.
3. "Strap" der narkotisierten Maus an einer Tragfläche in einer Tabelle oder dorsalen Bauchlage mit Labor Klebeband. Hüten Sie sich vor der anatomischen Orientierung auf Ihrem Bildschirm Endoskop. Sichern Sie ihre unteren Extremitäten und Schwanz. Ein Band von Band kann auch auf der Brust angebracht werden, um eine Bewegung weg von dem Beatmungsgerät zu verhindern, aber nicht einzuschränken Brustatmungsbewegungen.

3. Detaillierte endoskopische Untersuchung

1. Suchen Sie nach perianalen Läsionen, bevor Sie das Endoskop in den Mastdarm, dann durch den Anus voran den Umfang.
2. Bestreichen Sie die Endoskop mit sterilen OP-Gleitmittel. Achten Sie darauf, die Oberfläche der CCD (Charge Coupled Device)-Sensor.
3. Legen Sie das Endoskop und die Aufnahme zu starten. Aufgenommene Videos sind nützlich für meticulous Auswertung der Endoskopie, wenn nach der Prüfung erforderlich ist. Versuchen Sie, die Endoskopie in der kürzesten Länge der Zeit, Darm-/ Schleimhautreizungen zu minimieren, durchzuführen.
4. Bewerben Luft mit einer Spritze auseinander die Darmwände langsam eingestellt. Je nach Größe des Maus verwenden 1-2 ml Luft. Vermeiden Sie übermäßige Luftinsufflation, es kann Atemnot und Tod des narkotisierten Maus verursachen.
5. Voraus das Endoskop nach vorne, wie Sie den Weg mit Luft oder sanfte Drehung des Anwendungsbereichs zu löschen. Sie das Endoskop voran nicht, wenn Sie nicht sehen, das Darmlumen. Perforationen oder rektale / Darm Tränen können in dieser Phase vor allem bei jungen Mäusen (<8-10 Wochen alt) auftreten. Machen Sie Fotos wie nötig.
6. Da der Anwendungsbereich geht, zu bewerten, ob es spontane Blutungen (definiert als natürliche Schleimhautblutungen nicht mit traumatischen Endoskopie verbunden sind). Spontane Blutungen beobachtet werden, wie das Endoskop in den Mastdarm und Dickdarm.
7. WieSess die Transparenz der Darmwand. Transparenz ist die Fähigkeit, um die intra-Blutgefäße in den Dickdarm zu visualisieren und dem der anderen umliegenden Eingeweide (Abbildung 4) definiert. Sanfte Bewegung der Rahmen (vor-zurück, rechts, links) wird dazu beitragen, zu bestimmen, ob die Blutgefäße in den Kontext anderer Eingeweide gesehen werden. Mesenterialen Fettgewebe kann auch gesehen werden. Beachten Sie, wenn das Rektum in der Beckenhöhle weniger transparent als der Dickdarmwand in die Bauchhöhle erscheint.
8. Überprüfen Sie, die Art und Anzahl der fokalen Läsionen (ödematösen Bereichen, Erosionen, Geschwüre, Tumormassen) zu bestimmen. Dies wird in der Scoring-Formular mit der Dickdarmentzündung Partitur und die dezimalen Kennungen, die entwickelt worden sind, aufgezeichnet werden.
9. Sobald der Bereich, in dem der Doppelpunkt biegt sich kaudal in den proximalen Dickdarm erreicht ist, ziehen Sie die Endoskop langsam und schauen auf das Vorhandensein von Kontaktblutungen (die wegen Brüchigkeit, nachdem die Schleimhaut trittEndoskop vorgeschoben oder entfernt). Es ist nicht notwendig, um den Darm Oberfläche absichtlich kratzen. Gesunde kolorektalen Schleimhaut nicht nach entsprechender endoskopische Untersuchung bluten.

4. Biopsie

1. Wenn Biopsien benötigt werden, legen Sie die Biopsiezange durch das Endoskop Kanal für Instrumente gewidmet. Überwachen Sie den Fortschritt der Zange am Endoskop Bildschirm, um Darm-Perforation zu verhindern.
2. Öffnen der Biopsiebecher der Zange um eine 60-80 ° cup-Vollwinkel, und sie auf dem Gebiet von Interesse. Übermäßig geöffnet Zange oder Druck können zusätzliche Schichten der Darmgewebe, das in einem Biopsie-induzierte Perforation der Darmwand transparent gesunde Ergebnisse zu erreichen. Wenn Perforation auftritt, das Tier einschläfern während der Narkose nach Ihrer IACUC Empfehlungen. Perforationen führen Endotoxämie und Peritonitis.
3. Schließen Sie die Biopsie-Tassen, und ziehen Sie sie aus, während die Zange geschlossen.
4. Remohabe die Probe von der Zange durch Spülen der Gewebe mit einer Lösung, die sanft zum Gewebe und der Zange ist. RNA und später PBS sind gemeinsame Arbeits Lösungen, und wenn erforderlich, mit der Nadel, um die Probe zu entfernen. Vermeiden Erodieren der forcep Tassen oder Schneiden.

5. Erwachen aus der Narkose

1. Nach Abschluss der Prüfung, eine warme Umgebung zu der Maus, bis er sich erholt. Verwenden Sie entweder eine elektrische Licht oder eine warme Unterlage, auf 37 ° C eingestellt Überhitzung vermeiden, periphere Vasodilatation beeinträchtigt Tier Erholung. Überwachen Sie die Maus eng bis zur vollständigen Genesung.

6. Integrierte Endoskopische Scoring System von Darmkrebs Gesundheit mit Dezimal Identifiers

1. Verwenden Sie die Scoring-Form (Abbildung 2) und die Parameterdefinitionen unten (Endoskopische Beurteilung der Murine Colorectal Entzündungen und Tumoren Mit einem Dezimal-gewichtete Scoring System: Parameter-Definitionen und-Protokoll) fürBeispiele und das optionale "Distal-Proximal Endoskopische Colitis Scoring System" (D-PECS) als Leitlinien für die Beurteilung nonbiased und detaillierte Aufzeichnungen.
2. Note die vier Parameter des kolorektalen Entzündung auf das Punktesystem Form (Abbildung 2) beschrieben. Akribisch bewerten die Perianalregion, Darm Transparenz, Art der Darm-Blutungen (wenn vorhanden) und Vorhandensein und die Menge von fokalen Läsionen (erosive, Colitis und / oder Tumor).
3. Bei der Beurteilung von Tumoren zu Forschungszwecken, untersuchen Sie die Menge, die Lage und Größe, und beschreiben sie mit Hilfe der Colon-Karte und Balkendiagramm auf der Scoring-Form. Die numerische Summe der erzielten Ergebnisse und der Anzahl der Läsionen (wenn zutreffend) die Hintergrund Kolon-Entzündungen, die vorherrschende Art der Verletzung, und die Anzahl der Läsionen zu bestimmen.

Ergebnisse

Die in dieser Studie präsentierten Protokoll und Bilder wurden mit einem Olympus-URF-V flexiblen Endoskops ¹⁴ und NBI ^11,15 hergestellt. Video Bilder wurden in MPEG-2-Format und Bilder im JPG, TIF, PNG oder DICOM-Format mit maximal 1.280 x 1.024 Pixel, Standard-USB-Flash-Speicher tragbaren übertragbar gespeichert. NBI verbessert den visuellen Kontrast von Hämoglobin-haltige Gewebe. Normales Licht und NBI-Bildgebung sind die Hauptmerkmale, die normale Anatomie des kolorektalen Schleimhaut und die...

Diskussion

Es gibt mehrere Überlegungen zur Modifikation und Fehlerbehebung der endoskopische Technik in Mäusen. Kritische Aspekte des Verfahrens, die während der Nutzung der flexiblen Endoskopie gemeistert werden müssen, gehören die Einstellung der Luftmenge benötigt, um Blähungen und Atemwegs Kompromiss der Maus zu verhindern, und kleinere technische Aspekte der Ansichtssteuerung bei der Koordinierung der Winkelung und Drehmomentsteuerungen . Drehmomentregelung ist wichtig, um das Risiko einer Darmdurchbruch zu minimieren...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane, USP	Webster Veterinary
Surgical lubricant	Savage laboratories	surgilube, 0281-0205-45
Phosphate Buffered Saline	Thermo Scientific	SH30256
RNAlater	Ambion	AM7021
Methylene Blue 1% Aqueous Solution	Fisher Science Education	S96393
Flexible digital ureteroscope	Olympus America	URF-V
Video system center	Olympus America	VISERA Pro OTV-S7 Pro
Xenon light source	Olympus America	VISERA Pro CLV-S40 Pro
Video recorder	MediCapture, Inc.	MediCap USB200
Flexible biopsy cup forceps	Olympus America	FBC-3115
Anesthesia machine	Euthanex Corporation	EZ-7000 Classic System