Systematische Analyse von<em&gt; In-vitro-</em&gt; Zellroll Mit einer Multi-Well-Platte mikrofluidischen System

Zusammenfassung

Diese Studie verwendet eine Multi-Well-Platte mikrofluidischen System, deutlichen Erhöhung des Durchzellroll Studien unter physiologisch relevanten Scherströmung. Angesichts der Bedeutung der Zellvoll in der Mehrschrittzellen Homing Kaskade und die Bedeutung der Referenzzelle nach systemischer Abgabe exogener Populationen von Zellen in Patienten, bietet dieses System als Screening-Plattform zellbasierte Therapie verbessern Potential.

Zusammenfassung

Eine große Herausforderung für zellbasierte Therapie ist die Unfähigkeit, systemisch Ziel, eine große Menge von lebensfähigen Zellen mit hoher Effizienz zu Geweben von Interesse nach intravenöser oder intraarterieller Infusion. Folglich erhöht Zelle Homing wird derzeit als eine Strategie, um die Zelltherapie zu verbessern sucht. Zell Rollen auf dem vaskulären Endothel ist ein wichtiger Schritt im Prozess der Zell Homing und kann in-vitro unter Verwendung eines Parallelplattenlaufkammer (PPFC) untersucht werden. Dies ist jedoch ein extrem mühsam, niedrige Durchsatz-Assay, mit schlecht eingestellten Strömungsbedingungen. Stattdessen haben wir eine Multi-Well-Platte mikrofluidischen System, das Studium der Zellrolleigenschaften unter genau kontrollierten, physiologisch relevanten Scherströmung ^1,2 ermöglicht einen höheren Durchsatz. In dieser Arbeit wird gezeigt, wie die Rolleigenschaften von HL-60 (menschliche Promyelozytenleukämie-Zellen) auf P-und E-Selectin beschichteten Oberflächen sowie auf Zellmonoschicht-beschichteten Oberflächen werden readily sucht. Um besser zu simulieren entzündlichen Bedingungen wurde die mikrofluidische Kanaloberfläche mit Endothelzellen (ECs), die dann mit Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α) aktiviert wurden, signifikant erhöht Wechselwirkungen mit HL-60-Zellen unter dynamischen Bedingungen beschichtet. Die verbesserte Durchsatz und integrierter Multi-Parameter-Analyse-Software-Plattform, die eine schnelle Analyse von Parametern wie Walzgeschwindigkeiten und Rollbahn ermöglicht, sind wichtige Vorteile für die Beurteilung der Zellrollverhalten in-vitro. Die eine schnelle und genaue Analyse von technischen Konzepten, die auf Zell Walz-und Referenz auswirken, kann diese Plattform Voraus exogene zellbasierte Therapie helfen.

Einleitung

Eine der großen Herausforderungen bei der erfolgreichen klinischen Übersetzung von Zell-basierten Therapie ist die ineffiziente Lieferung oder Targeting von systemisch infundiert Zellen an gewünschten Stellen ^3,4. Folglich gibt es eine ständige Suche nach Ansätzen zur Zelle Homing zu verbessern, und zwar Zelle Rollen, als eine Strategie, um die Zelltherapie zu verbessern. Zellroll auf die Blutgefäße ist ein wichtiger Schritt in der Zelle Homing Kaskade, klassisch für Leukozyten, die zu Krankheit Stellen ⁵ rekrutiert werden, definiert. Dieser Schritt wird durch spezifische Interaktionen zwischen Endothelzellen Selektine geregelt, dh P-und E-Selektin (P-und E-sel) und ihre Gegenliganden auf der Oberfläche von Leukozyten ^5,6. Ein besseres Verständnis und eine verbesserte Effizienz der Zell Homing und insbesondere der Walzschritt, sind von großer Bedeutung bei der Suche nach neuen Plattformen, um zellbasierte Therapie zu verbessern. Bisher ist dies durch die Verwendung parallel Platte Strömungskammern (PPFCs), bestehend aus zwei flachen Plattform erreichtes mit einer Dichtung dazwischen, mit einem Zulauf-und Ablauföffnung auf der oberen Platte angeordnet ist, durch welche eine Zellsuspension wird unter Verwendung einer Spritzenpumpe ^{7,8, 9} perfundiert. Die Oberfläche der Bodenplatte kann mit einer entsprechenden Zellmonolayer / Substrate beschichtet werden und die Interaktion zwischen Zellen durchblutet und der Oberfläche unter Scherströmung ist dann ⁷ erkundet. Allerdings ist PPFC ein niedriger Durchsatz, Reagenz aufwendig und ziemlich langweilig Methode, mit Blasenbildung, Leckage, und schlecht kontrollierten Fluss präsentiert große Nachteile.

Eine alternative Technik zur herkömmlichen PPFC ist ein Multi-Well-Platte mikrofluidischen System, ermöglicht höhere Durchsatzleistung der zellulären Assays (bis zu 10 mal höher als PPFCs) unter genauer, computergesteuerten Scherströmung mit geringen Reagenzienverbrauch ^1,10. Zellrollversuche sind in den mikrofluidischen Kanälen durchgeführt, die mit Zellmonoschichten oder gentechnisch Substrate beschichtet werden können und abgebildet using ein Mikroskop, mit Rolleigenschaften analysiert leicht mit einer geeigneten Software. In dieser Studie zeigen wir die Fähigkeiten dieser Multi-Well-Platte mikrofluidischen System, indem man die Rolleigenschaften des menschlichen Promyelozyten-Leukämie (HL-60)-Zellen auf verschiedenen Oberflächen. HL-60 rollen auf Substraten wie P-und E-sel als auch auf Zellmonoschichten, die verschiedene Walz Rezeptoren analysiert. Zusätzlich Antikörper (Ab) wurde verwendet, um die Blockierung direkte Beteiligung von spezifischen Selectine bei der Vermittlung der Rollbewegung des HL-60 auf diesen Oberflächen zu demonstrieren. Roll Experimente wurden mit erhöhten Durchsatz unter stabilen Scherströmung durchgeführt wird, mit minimalen Reagenz / Zelle Verbrauch, die eine effiziente Analyse der wichtigsten Parameter wie Rollwalzgeschwindigkeit, die Anzahl der rollenden Zellen und Rollweg Eigenschaften.

Protokoll

1. Zellkultur

1. Menschlichen Promyelozytenleukämie (HL-60-Zellen)
   1. Kultur HL-60-Zellen in 75 cm ^2-Kolben mit 15 ml Iscove-modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM) mit 20% (v / v) fötalem Rinderserum (FBS), 1% (v / v) L-Glutamin und 1 ergänzt % (v / v) Penicillin-Streptomycin.
   2. Ändern Medien alle 3 Tage durch Absaugen Hälfte der Zellsuspension Volumen und mit komplettem IMDM Medien zu ersetzen.
   3. Für Carboxyfluoresceindiacetat, Succinimidylester (CFSE) Färbung Zentrifuge HL-60-Zellsuspension (400 × g, 5 min), Resuspendieren in einer 1 &mgr; M CFSE-Lösung (in vorgewärmtem PBS) und Inkubation für 15 min bei 37 ° C. Dann Zentrifuge Zellen absaugen Stand und resuspendieren Zellen in frischem vorgewärmten Medium für 30 min. Waschen der Zellen in PBS und dann zum Walzversuche (siehe 1B für repräsentative Bild von CFSE-gefärbten HL-60-Zellen auf P-sel-beschichtete Oberfläche).

Hinweis: CFSE-Färbung ist optional und wird hier vorgestellt, um den Roll Phänomen in der mikrofluidischen Kanal zu demonstrieren. Die Analyse der in dieser Handschrift präsentiert Walzparameter wurde am ungefärbten Zellen unter Verwendung von Standard-Hell Bildgebung durchgeführt.

2. Lung mikrovaskulären Endothelzellen (LMVECs)
   1. Mantel 100 mm Petrischalen mit 0,1% Gelatine-Lösung (v / v in PBS) und bei 37 ° C für mindestens 30 min.
   2. Kultur LMVECs auf mit Gelatine beschichteten 100 mm Petrischalen in völliger endothelialen Wachstumsmedium (Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2)), mit einer spezifischen Wachstums Ergänzung Kit ergänzt, siehe Reagenzien). Ändern Medien jeden zweiten Tag und Sub-Kultur-Zellen bei Erreichen von 80-90% Konfluenz.
   3. Für Sub-Kultur, waschen Sie die Zellen mit PBS und dann lösen die Zellen mit 4 ml 1x Trypsin-EDTA für 3 min bei 37 ° C und neutralisieren in einem gleichen Volumen von kompletten EBM-2-Medien. Übertragen der Zellsuspension in ein 15 ml-Röhrchen und SchleuderE (400 × g, 5 min). Nach der Zentrifugation das Pellet in 1 ml komplette Medien-und Endothelzellen zählen Zellen mit einer Zählkammer. Nicht über-Durchgang der Zellen, da dies Auswirkungen auf ihre Morphologie und Funktion-Nutzung nur Zellen unter Kanal 7 für alle Experimente.

3. Chinese Hamster Ovary-P-Selectin (CHO-P) Zellen
   1. CHO-P-Zellen, die stabil transfizierten CHO-Zellen der menschlichen P-sel auszudrücken sind, wurden von Mitarbeitern (Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School) ^11,12 vorgesehen.
   2. Kultur CHO-P-Zellen in T175-cm ^2-Kolben in 25 ml F-12-Medium.
   3. Zur Passagierung waschen Zellen mit 10 ml PBS für 4-5 sec und dann in 10 ml 1 × Trypsin-EDTA trypsinize für 3 min bei 37 ° C, gefolgt von Neutralisation in Vollmedien.
   4. Centrifuge die Zellsuspension (400 × g, 5 min), vorsichtig den Überstand aspirieren, Zellpellet in 1 ml Voll Medien und zählen Sie die Zellen miteine Zählkammer.

2. Der Betrieb der integrierten Multi-Well-Platte mikrofluidischen System

1. Achten Sie darauf, alle Geräte richtig angeschlossen ist, und schalten Sie die verschiedenen Module: Computer, Controller, invertierten Mikroskop und CCD-Kamera.
2. Öffnen Sie die Imaging-Software, stellen Sie sicher, dass der Multi-Well-Platte-Modul und das Abbildungsmodul richtig auf dem Bildschirm dargestellt.
3. Verbinden Sie die Rohre der Dampffalle (an den Controller angeschlossen), und schließen Sie sie auch auf die Druckschnittstelle.
4. Legen Sie die Multi-Well-Platte in der Plattenheizung /-Adapter. Hinzufügen Reagenzien in die Vertiefungen (unten beschrieben) und legen Schnittstelle auf der Oberseite der Platte. Zeigen Platte für die Bildgebung auf automatisierten Bühne.
5. Die Schnittstelle wird an der Oberseite der Platte und wendet einen pneumatischen Druck von der Steuerung an der Oberseite der Vertiefungen, die Antriebsfluid durch die Mikrofluidkanäle mit der festgelegten Durchflussrate leicht gesteuert unter Verwendung der Multi-Well-PlatteModul-Bildschirm unter Handbetrieb.
6. Reagenzien in der Kanalströmung über einem Beobachtungsraum, zwischen den Brunnen entfernt. Mikrofluidik-Kanal Abmessungen sind 350 um breit x 70 um groß. Die Länge des linearen Kanals beträgt 1 mm und der Boden der Kanäle weist eine 180 um Deckglas, das mit Hellfeld, Phasen, Fluoreszenz-und konfokale Mikroskopie kompatibel ist.
7. Erwerben Sie Videos mit einer CCD-Kamera (Strom Erwerb, 11 Bilder / s) und über kompatible Software zu analysieren.

3. Beschichtung von Mikrofluidik-Kanäle mit einem Protein-Substrat oder eine Zellschicht

1. Die Beschichtung mikrofluidischen Kanal mit Fibronektin oder P-/E-selectin
   1. Herstellung von 1 ml von 20 ug / ml Fibronektin-Lösung in PBS. Volumen ändern, basierend auf der Anzahl von Kanälen zu beschichtende (25-50 verwenden ul Fibronectin pro Kanal).
   2. In 25-50 ul von Fibronektin-Lösung zu jeder Eintritts gut. Bewerben Scherkraft von 2 dyn / cm ²für 5 Minuten, um den Kanal zu durchströmen. Bitte beachten Sie die Perle der Flüssigkeit, die in der Steckdose auch. Inkubation für 30-45 min bei RT
   3. Saugen Sie die Lösung aus Brunnen (nicht direkt aus dem Mittelkreis, die den Kanal speist nicht absaugen) ^1,13. In 200 bis 500 ul PBS in die Steckdose und gut waschen Kanal mit PBS, indem Scherströmung von 2 dyn / cm ² für 5 min. Der Kanal wird nun korrekt mit Fibronektin und einsatzbereit beschichtet.
   4. Zur Beschichtung mit P-oder E-sel, bereiten eine 5 ug / ml Lösung des gewünschten humanen rekombinanten Protein in PBS, und die Mantel-Kanäle, wie oben bei 37 ° C beschrieben, wobei 1 h Inkubation, um die Oberflächenbeschichtung zu ermöglichen.
2. Erstellung von CHO-P oder LMVEC Monoschicht innerhalb der mikrofluidischen Kanal
   1. Sanft trypsinize Zellen aus den Kulturschalen für 3 min, löschen mit einem 2-fachen Volumen der Voll Medien und Zentrifuge (5 min bei 400 x g). Die Zellen mit 10 ml Voll Medien und Zentrifuge (5 min bei 400 x g) again.
   2. Zählen der Zellen, um die Zellkonzentration in der Suspension zu bestimmen. Um die Bildung einer konfluenten Monoschicht LMVEC innerhalb des Kanals sicherstellen, einen Zellkonzentration auf 15-20 Millionen Zellen / ml. Für einen konfluenten CHO-P Zellschicht, verwenden Sie 50-60000000 Zellen / ml. Verwenden 25-50 ul Zellsuspension für jeden Kanal - bestimmen Anfangszellzahl für das Experiment entsprechend verwendet.
   3. In 25-50 ul der Zellsuspension in der entsprechenden Konzentration an den Einlass auch. Legen Sie die Platte auf dem Mikroskoptisch und Zellen einzuführen in den Kanal (2 dyn / cm ^2), bis die Zellen werden auf dem Bildschirm füllt den gesamten Kanäle beobachtet und dann den Fluss zu stoppen.
   4. Füllen Sie beide Auslass-und Einlass mit 200 ul entweder voll oder CHO LMVEC Medien. Lassen Sie die Zellen absetzen und sich für 3 Stunden in den Brutschrank (37 ° C, 5% CO _2).
   5. Nach 3 Stunden Inkubation, waschen Sie den Kanal mit Vollmedien (2 dyn / cm ^2, 10-15 min) zu entfernen ungebundenZellen. Zellen sollte nun erscheinen vollständig konfluenten und der Kanal ist jetzt einsatzbereit. Je nach Anfangszellaussaatdichte, können zusätzliche 2-3 Stunden Absetzzeit erforderlich sein, um eine vollständige Bedeckung der Oberfläche mit den Zellen zu gewährleisten.

4. LMVEC Pro-inflammatorische Aktivierung und Blockierung der Antikörper P-/E-selectin

1. Bereiten Sie eine TNF-α-Lösung (10 ng / ml) in LMVEC Grundmedien.
2. Entzündliche Aktivierung LMVEC in den Kanälen zu induzieren, werden 100 &mgr; l der TNF-α-Lösung zu dem Einlaß und auch die Lösung in den Kanal einzuführen, indem Scherströmung von 2 dyn / cm ² für 5 min. Für Steuerkanäle (nicht aktivierten ECs), 100 l LMVEC Grundmedien mit dem Einlass gut und in den Kanal (2 dyn / cm ^2, 5 min) einzuführen. Channel ist nun bereit für ein Walztest.
3. Um P-sel und E-sel auf LMVECs und CHO-P-Zellen zu blockieren, führen zu neutralisieren P-sel (Klon AK4, 5 pg / ml in basal Medien) oder E-sel (Klon P2H3, 5 ug / ml in Basalmedium)-Antikörper in den Kanal und Inkubation für 1 h bei 37 ° C. Weiter, Waschkanälen mit Basalmedium (2 dyn / cm ² für 5 min). Kanäle sind nun bereit für ein Walztest.

5. HL-60-Rollen-Assay auf Substrat / Zellmonolayer-Coated mikrofluidischen Kanälen

1. Sorgfältig die Kanäle unter dem Mikroskop, um zu bestätigen, dass die Kanäle richtig beschichtet (im Fall der Beschichtung mit Zellen sollten bei einer vollständig konfluenten Zellmonoschicht beobachtet werden.)
2. Um HL-60-Zellsuspension für die Rollversuche, Zentrifuge HL-60-Zellsuspension (5 min bei 400 x g) vorbereiten und einmal mit Grundmedien waschen. Zählen der Zellen und Resuspension in IMDM (Grundmedium, enthaltend Ca ^{2 +} und Mg ^{2 +),} um eine HL-60-Zellsuspension mit 5 Millionen Zellen / ml zu erstellen. Verwenden 25-50 ul Zellsuspension für jeden Kanal, den Rolltest durchzuführen.
3. In 25-50 ul der Zell UntBrnsion, um gut in der temperaturgesteuerten Halteplatte (37 ° C) und auf den Mikroskoptisch Entnahmestelle, Ort Platte. Nächstes vorstellen Zellen in den Kanal, indem Scherkraft von 2 dyn / cm ² (Zellen sollten innerhalb von 10-15 sec aus der Steckdose zum Einlass fließt beachten).
4. Um die Roll Reaktion als Funktion der Scherbeanspruchung zu untersuchen, reduzieren Scher bis 0,25 dyn / cm ² und in jeder gewünschten Scher erwerben 20-30 sec-Videos (mit Hilfe der Funktion "Strom Erwerb") (Scher erhöhen allmählich von 0,25 bis 5 dyn / cm ^2. Es ist auch möglich, höhere Schere verwenden).
5. Erwerben Sie Videos mit einer CCD-Kamera (Strom Erwerb, 11 Frames / s) und zu analysieren, Rollwege und Rollgeschwindigkeiten über kompatible Software.

6. Durchflusszytometrie zur Expression von Oberflächenmolekülen erkennen

1. Nach Trypsinierung, bereiten eine Zellsuspension (mit 1-2 x 10 ⁵ Zellen / Probe) des gewünschten Zelltyp (HL-60, CHO-P oder LMVECs) in PBS (- / -), mit 2% FBS. Waschen der Zellen zweimal und bringen Probenvolumen 50 ul (unter Verwendung des gleichen Puffers).
2. Inkubation jeder Probe mit dem gewünschten fluorophorkonjugierten Ab (siehe beigefügte Tabelle für detaillierte Informationen) bei 4 ° C für 20 min (mit Alufolie abdecken).
3. Waschen Sie die Zellen (gleichen Puffer) und bringen endgültige Volumen von gefärbten Zellsuspension zu 200 ul. Analyse Proben unter Verwendung eines Durchflusszytometers, um die Expression von Oberflächenmolekülen zu detektieren.

Ergebnisse

HL-60-Zellen rollen auf P-und E-Selektin-Oberflächen, aber nicht auf Fibronektin

HL-60-Zellen gelten als Goldstandard "Rollen", wie sie eine Vielzahl von Homing-Liganden, einschließlich der rollenden Liganden P-Glykoprotein-sel-Liganden-1 (PSGL-1) und Sialyl-Lewis-X (SLeX) ^5,14 (Abbildung 1A ausdrücken ). Die Oberflächenprotein PSGL-1 wirkt als ein Gerüst für das Tetrasaccharid SLeX, Vermittlung spezifische Wechselwirkung mit P-und E-sel, der auf dem ...

Diskussion

Eine der großen Herausforderungen in der erfolgreichen Übersetzung von exogenen zellbasierte Therapie ist die Unfähigkeit, effizient liefern Zellen zu Websites von Verletzungen und Entzündungen, die mit hoher Effizienz engraftment ^3. Zellroll stellt einen entscheidenden Schritt in den Prozess der Zell Homing, die Erleichterung der Verzögerung der Zellen an den Wänden der Blutgefäße, was schließlich zu ihrem festen Adhäsion und Trans durch das Endothel in das Gewebe ⁵ führt. Besseres Vers...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Lung Microvascular Endothelial Cells	Lonza	CC-2527
P-selectin-expressing Chinese Hamster Ovary Cells (CHO-P)	Kind gift by Dr. Barbara Furie11,12
HL-60 Cells	ATCC	CCL-240
Cell Culture Reagents
Endothelial Basal Medium	Lonza	CC-3156
EBM-2 Media	Lonza	CC-3156
Endothelial Basal Medium Supplements	Lonza	CC-4147
EGM-2 MV SingleQuots	Lonza	CC-4147
IMDM - Iscove's Modified Dulbecco's Medium 1x	Gibco	12440
F-12 (1x) Nutrient Mixture (Ham)	Gibco	11765-054
Penicillin Streptomycin (P/S)	Gibco	15140
L-Glutamine (L/G) 200 mM	Gibco	25030
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta Biologicals	Sa550
Petri Dishes	BD Falcon	BD-353003
100 mm Cell Culture Dish, Tissue-Culture Treated Polystyrene
Centrifuge Tubes (15 ml polypropylene conical tubes)	MedSupply Partners	TC1500
T75 Flasks	BD Falcon	353136
Gelatin Solution (2%)	Sigma	G1393
dPBS (without calcium chloride and magnesium chloride)	Sigma	D8537
Trypsin-EDTA Solution (10x)	Sigma	T4174
Antibodies
Anti-hE-Selectin/CD62E	R&D Systems	BBA21
FITC Conjugated Mouse IgG1	R&D Systems	BBA21
Anti-hP-Selectin	R&D Systems	BBA34
FITC Conjugated Mouse IgG1	R&D Systems	BBA34
FITC Mouse IgG­1 κ Isotype Control	BD Bioscience	555748
Anti-SLeX /CD15s Ab, Clone: 5F18	Santa Cruz	SC70545
FITC Conjugated	Santa Cruz	SC70545
Normal Mouse IgM-FITC Isotype Control	Santa Cruz	SC2859
PE Mouse Anti-Human CD162, Clone: KPL-1	BD Pharmingen	556055
PE Mouse IgG1 k Isotype Control	BD Pharmingen	550617
Anti-P-Selectin Ab (AK4)	Santa Cruz	SC19996
Anti-E-Selectin Ab, Clone P2H3	Millipore	MAB2150
Mouse IgG1 Isotype Control	Santa Cruz	SC3877
Other Reagents
Recombinant Human TNF-alpha	PeproTech	300-01A
Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit - For Flow Cytometry	Invitrogen	C34554
Human P-selectin-FC recombinant protein	R&D Systems	137-PS-050
Human E-selectin-FC recombinant protein	R&D Systems	724-ES-100
Fibronectin Human, Plasma	Invitrogen	33016-015
Equipment
Bioflux 1000	Fluxion Biosciences	Bioflux Montage was the software used to run the experiments and analyze the data
BioFlux 48-well plates	Fluxion Biosciences
BD Accuri C6 Flow Cytometer	BD Bioscience	CFlow Plus was the software used to run the experiments and analyze the data
Nikon Eclipse Ti-S	Nikon
CoolSnap HQ2 CCD camera	Photometrics