Bewertung von Calcium in Sparks Intact Skelettmuskelfasern

Zusammenfassung

Hier wird ein Verfahren beschrieben, um Calcium Funken direkt zu messen, die Elementareinheiten der Ca ^{2 +-Freisetzung} aus Retikulum in intakten Skelettmuskelfasern. Dieses Verfahren nutzt osmotischen Stress-vermittelte Auslösung der Ca ^{2 +-Freisetzung} aus Ryanodinrezeptor in isolierten Muskelfasern. Die Dynamik und die Homöostase Kapazität der intrazellulären Ca ^{2 +-Signalisierung} kann eingesetzt werden, um die Muskelfunktion in Gesundheit und Krankheit zu beurteilen.

Zusammenfassung

Aufrechterhalten homöostatischen Ca ^{2 +-Signal} ein Grund physiologischer Prozess in lebenden Zellen. Ca ^{2 +-Sparks} sind die elementaren Einheiten der Ca ^{2 +-Signalgebung} in der quergestreiften Muskelfasern, die als stark lokalisierten Ca ^{2 +-Freisetzung} Veranstaltungen von Ryanodin-Rezeptor vermittelt (RyR) Ca ^{2 +-Freisetzung} Kanäle auf dem Sarkoplasmatischen Retikulum (SR)-Membran erscheinen. Die richtige Einschätzung der Muskel Ca ^{2 +-Sparks} könnten Auskunft über die intrazelluläre Ca ^{2 +} Handhabungseigenschaften von gesunden und kranken quergestreiften Muskeln. Obwohl Ca ^{2 +} Funken Ereignisse werden bei Ruhe Kardiomyozyten zu sehen, sind sie selten in Ruheskelettmuskelfasern beobachtet, somit besteht ein Bedarf an Verfahren zur Erzeugung und Analyse von Funken in Skelettmuskelfasern.

Detaillierte hier ist ein experimentelles Protokoll für die Messung Ca ^{2 +-Sparks} in isolierten Beuge digitorm brevis (FDB) Muskelfasern mit fluorescent Ca ^{2 +-Indikatoren} und konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie. Bei diesem Ansatz, isoliert FDB Fasern, um transiente hypoosmotischen Stress, gefolgt von einer Rückkehr zu isotonischen physiologischen Lösung ausgesetzt sind. Unter diesen Bedingungen wird eine robuste Ca ^{2 +-Antwort} Funken ist angrenzend an die Membran sarkolemmalen bei jungen gesunden FDB Muskelfasern nachgewiesen. Veränderte Ca ^{2 +} Funken Antwort wird in dystrophischen oder im Alter von Skelettmuskelfasern nachgewiesen. Dieser Ansatz wurde kürzlich gezeigt, dass Membran-getrennte Signalisierung mit Übersprechen zwischen Inositol-(1,4,5)-Triphosphat-Rezeptor (IP ₃ R) und RyR trägt zur Ca ^{2 +} Funke Aktivierung der Skelettmuskulatur. Zusammenfassend unsere Studien durch osmotischen Stress induzierte Ca ^{2 +} Funken zeigten, dass diese intrazelluläre Antwort spiegelt eine Muskelsignalisierungsmechanismus in der Physiologie und Altern / Krankheitszuständen, einschließlich Mausmodellen der Muskeldystrophie (mdx-Mäusen) oder Amyotrophe Lateralsklerose (ALS Modell).

Einleitung

Intrazellulären freien Ca ^{2 +} ([Ca ^{2 +]} _i) ist eine vielseitige und wichtige sekundäre Messenger, der mehrere zelluläre Funktionen in erregbaren Zellen wie Neuronen, Herz-, Skelett-und glatte Muskulatur reguliert (für eine Übersicht siehe Stutzmann und Mattson ^1). Geregelte Ca ^{2 +-Mobilisierung} und Übersprechen zwischen Sarkoplasmatischen Retikulum (SR) und T-Tubuli (TT)-Membranen sind grundlegende Regulatoren der Muskelphysiologie. Ferner können Änderungen in Ca ^{2 +-Signal} gezeigt worden war, um eine zugrundeliegende Mechanismus des kontraktilen Dysfunktion bei verschiedenen Erkrankungen zu sein.

Ca ^{2 +-Sparks} lokalisiert sind elementare Ca ^{2 +-Freisetzung} Ereignisse vom Öffnen des Ryanodin-Rezeptor (RyR) Kanal auf dem Sarkoplasmatischen Retikulum (SR) Membran ² stammen. Im Herzmuskel auftreten Funken spontan durch die Öffnung des RyR2-Kanal von einem Ca ^{2 +-induzierte} Ca ^{2 +} release (IKRK)-Mechanismus ^05.03. Im Skelettmuskel wird RyR1 ausschließlich durch den Spannungssensor an der Membran TT ^6,7 gesteuert. So Ca ^{2 +} Funken werden unterdrückt und in Ruhebedingungen in intakten Skelettmuskelfasern selten erkannt. Bis vor kurzem sarkolemmalen Membran benötigt, um durch verschiedene chemische oder mechanische "Hautbildung" Methoden aufgebrochen werden, um die Unterdrückung des Spannungssensors auf RyR1 entkoppeln und Ca ^{2 +-Ereignisse} erlaubt in Skelettmuskel ^8,9 detektiert werden entfachen. Ein Verfahren zuvor beschrieben erforderlich Permeabilisierung der Membran von Muskelfasern von Saponin Reinigungsmittel ^10.

Im Jahr 2003 entdeckten wir, dass entweder transient hypoosmotischen Stress oder hyperosmotischen Stress könnte peripheren induzieren Ca ^{2 +} Funken neben dem sarkolemmalen Membran in intakten Muskelfasern ^11. Dieses Verfahren ist seit modifiziert worden, um die molekularen Mechanismen und Modulation von Ca ^{2 +} zu studieren Release und Dynamik ^16.12. Hier beschreiben wir die Details unserer experimentellen Ansatz für Induktion, Erfassung und Analyse von Ca ^{2 +-Sparks} in intakten Skelettmuskulatur. Wir präsentieren auch unsere maßgeschneiderten Funke-Analyse-Programm, das verwendet werden kann, um die elementaren Eigenschaften der einzelnen Ca ^{2 +-Sparks} in der Skelettmuskulatur, z. B. Funken Frequenz und Amplitude (Δ F/F0, die die Offenwahrscheinlichkeit der RyR Kanäle spiegelt quantifizieren und die Ca ^{2 +-Last} in der SR), die Zeit bis zum Peak (Anstiegszeit) und Dauer (FDHM, Vollzeit bei halb-maximale Amplitude) der Funken, sowie die räumliche Verteilung der Ca ^{2 +-Funken.} Darüber hinaus präsentieren wir Beweise, die auf die verschiedenen pathophysiologischen Zuständen in der Skelettmuskulatur, wie Muskeldystrophie und amyotrophe Lateralsklerose verändert Ca ^{2 +-Sparks} Links.

Der Vorteil dieser Technik beinhaltet die Fähigkeit, Ca ^{2 +} in relativ unbeschädigt zu messengealterten Zellen, anstatt Strippen der Muskelfasern ermöglicht Aufnahme von Ca ^{2 +} Funken in physiologischen Bedingungen näher. Darüber hinaus bietet unsere maßgeschneiderten Programm genauere Berechnungen der Eigenschaften des Funkens in Bezug auf die Muskelfasern.

Protokoll

1. Einrichten osmotischen Stress-Perfusionssystem

Fig. 1 ist eine schematische Protokoll von Calcium Funken Bewertung in intakten Skelettmuskelfasern.

1. Richten Sie ein Drei-Achsen (xyz) Mikromanipulator in der Lage, die Positionierung der Steckdose Spitze der Perfusions-System mit mindestens zwei Kanälen. Weg Luer - - Lok Hahn auf und / oder aus der Strömung des Perfusionslösungen wechseln Dies könnte mit Luer-Spritzenzylinder mit drei befestigt werden. Diese Kanäle sollten Perfusion der Lage ist,> 1 ml / min der Lösung durch eine einzige Spitze mit einer Perfusion> 0,2 mm Durchmesser sein.
2. Legen Sie zwei Kanäle der Perfusion System, eine mit Isotonische Tyrode-Lösung und die andere mit Hypotone Tyrode-Lösung.

2. Vorbereiten Intakte Einzel Flexor digitorum brevis (FDB) Muskelfasern aus Maus

1. Nehmen Sie den Fuß von einer Maus eufolgenden NIH und IACUC Richtlinien mit einem Paar schwerer Sezieren von Schere schneiden durch die Bein oberhalb des Sprunggelenks thanized.
2. Pin den Fuß auf eine Dissektion Kammer mit Minimal Ca ^{2 +} Tyrode-Lösung gefüllt mit der Sohlenfläche nach oben zeigt.
3. Sezieren FDB durch Schneiden der Sehne und leichtes Ziehen auf der Sehne des Muskels aus dem umgebenden Gewebe zu trennen.
4. Beenden Dissektion durch Schneiden des distalen Sehnen wo es sich in einzelne Ziffern in den tiefen Schichten des Muskels.
5. Übertragen Sie die FDB Muskel durch Abheben mit der Pinzette über seine Sehnen, um zusätzliche Schäden an den Muskelfasern zu vermeiden und in einen Schlauch mit einem aufgetauten Aliquot Kollagenaseverdau Lösung vorgewärmt auf 37 ° C
6. Das Röhrchen FDB enthält aufrecht auf einem Orbitalschüttler bei 37 ° C für 60-90 min mit einer Drehzahl von 160 Umdrehungen pro Minute. Experimentell für verschiedene Stämme von Tieren untersucht werden Diese Muskelbündel Dissoziation Protokoll muss, Besonders für jene Krankheit / Mutante Fasern anfällig für Membranschäden.
7. Übertragen Sie die Faul FDB in das Rohr mit 700 ul Isotonische Tyrode-Lösung und sanft verreiben, um die Fasern durch Ziehen der Muskel mehrmals durch eine Reihe von 200-ml-Mikropipettenspitzen mit allmählich abnehmender Durchmesser über das Schneiden mit einer sauberen Rasierklinge freizugeben, um die Spitzen zu entfernen 200 ml Mikropipette. Um eine Beschädigung der Fasern in besonders schwachen Muskeln von der Krankheit zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass die Spitze ist gerade groß genug, um das Faserbündel durch ohne zu kleben passieren. Sie das Bündel durch eine Öffnung zu klein, nicht mit Gewalt.
8. Platte aus der FDB Fasern durch leichtes Klopfen resuspendiert und FDB Fasern in dem Rohr und dann Herausziehen 70 ml (1/10 der Gesamtfasern) mit einem Ausschnitt 200 ml Mikropipette in die Mitte einer 35 mm Delta TPG Schale mit 1 ml isotonischer Tyrode-Lösung, um die Diffusion über die Schüssel zu reduzieren.
9. Bestimmen der Anzahl der intakten, einzelnen Fasern in der dish mit einem Dissektionsmikroskop. Fügen Sie zusätzliche Aliquots der FDB Fasern zu 3-4 Fasern intakt auf den Teller zu bekommen.
10. Bewahren Sie zusätzliche isolierte Muskelfasern bei 4 ° C und innerhalb von 6 Stunden.

3. Fluo-04.00 Farbstoffbeladung und Ca ^{2 +-Imaging} (Sparks Measurement)

1. Über 500 ml Isotonische Tyrode-Lösung von plattierten Gericht mit FDB-Fasern in ein Rohr mit 10 ml Fluo-04.00 Lager (1 mM), vermischen und wieder in die Schüssel zu einer endgültigen Fluo-04.00-Konzentration von 10 mM. Alternativ können Pluronsäure verwendet werden, um Farbstoffbeladung Effizienz zu erhöhen.
2. Laden für 60 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
3. Waschen Sie die Fasern durch eine sorgfältige Zeichnung aus 500 ml Fluo-4 AM-haltigen Isotonische Tyrode-Lösung von der Schale mit einem ungeschnittenen 200 ml-Kunststoff-Mikropipettenspitze und ersetzen mit gleichen Volumen frischen Isotonische Tyrode-Lösung.
4. Wiederholen Sie diesen Vorgang drei Mal wiederholen.
5. Um die Funktion der Mitochondrien zu visualisieren, zu übertragen 500 ml Isotonic Tyrode-Lösung von Gericht mit FDB-Fasern in ein Röhrchen mit 5 ml TMRE Lager (1 mM), Mix, und fügen Sie zurück in die Schale für eine endgültige Konzentration von 50 nM.
6. Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min.
7. Waschen Sie die Fasern durch eine sorgfältige Zeichnung aus 500 ml TMRE haltigen Isotonische Tyrode-Lösung von der Schale mit einem ungeschnittenen 200 ml Kunststoff-Mikropipettenspitze und ersetzen mit gleichen Volumen frischen Isotonische Tyrode-Lösung.
8. Wiederholen Sie diesen Vorgang drei Mal wiederholen.
9. Die Schale in dem konfokalen Mikroskop und wählen Sie eine intakte Faser mit klaren Rillen und einer glatten sarkolemmalen Membran für Experimente.
10. Positionieren Sie die Spitze des Perfusionssystems 400-500 um weg von der Zielmuskelfaser und aus der Mitte mit Mikromanipulator Kontrollen.
11. Beginnen Fluss des Isotonische Tyrode-Lösung, um sicherzustellen, dass die FDB Faser bleibt an seinem Platz.
12. Nehmen Sie das Fluoreszenzsignal von Fluo-4 AM mit einem 40X Ölimmersionsobjektiv und begeistern Fluo-4 AM mit einArgon-Laser (Anregungswellenlänge 488 nm) und Rekordemissionssignale (Wellenlänge 510-580 nm). Die Intensität des Fluoreszenzsignals ist proportional zu der relativen Höhe der intrazellulären Ca ^{2 +-Konzentration} ([Ca ^{2 +]} _i).
13. Induzieren die Ca ^{2 +-Transienten} durch Änderung der osmotische Druck der extrazellulären Lösung, um auf osmotischen Stress Faser herzustellen. Perfusion zunächst die Fasern mit isotonischer Tyrode-Lösung (290 mOsM) (Basissammlung für 60 sec) und anschließend mit Tyrode-hypotonischen Lösung (170 mOsM) für 100 Sekunden, um das Quellen zu induzieren. Perfundieren die FDB Fasern zurück mit Isotonische Tyrode-Lösung. Im allgemeinen wird nur ein osmotischer Schock auf einen einzigen intakten Faser in einem Delta TPG Schale und den Funkenereignisse letzten 10 min für die Datenerfassung angelegt wird.
14. Datensatz räumliche Lokalisierung von Ca ^{2 +} Funken (Fig. 2) unter Verwendung einer Zeitreihe von xy zweidimensionalen Bildern mit Scan-Geschwindigkeit von 166 LPS (Zeile pro Sekunde, und each Linie von 512 Pixeln, was zu 3,08 sec / Rahmen) für jede Bedingung der isotonischen (1 min umfasste), hypotone Stress (100 sec) und Post-hypotone Stress (5 min). Speichersignale für die Offline-Analyse, um die Verteilung und die Häufigkeit von Ca ^{2 +} Funken nach Abschluss des Experiments zu bewerten.
15. Suchen Sie eine neue Faser auf einem neuen Teller und folgen den gleichen osmotischen Schock-Protokoll zu induzieren Ca ^{2 +-Transienten.} Verwenden Sie einen konfokalen Zeilen (xt)-Modus (512 Pixel in der Länge, Abtastrate von 2 ms / Zeilen Ca ^{2 +-Transienten} für eine Minute (dh 30.000 Zeilen) mit dem konfokalen Scanlinie direkt unter sarkolemmalen Membran platziert aufzuzeichnen (Abbildung 3 ). Ändern Sie den Zeilen zu unterschiedlichen Fokusebenen zu drei aufeinanderfolgende Serie (bei ​​1-min-Takt) des Linescans für die Analyse der Größe und der Kinetik der einzelnen Ca ^{2 +-Sparks} aufzeichnen.

4. Datenanalyse

1. Sammeln einer großen Anzahl vonxt Zeilen Spuren, die Morphologie und die Kinetik der einzelnen Ca ^{2 +-Sparks-Parameter} zu bewerten, dh die Amplitude (F / F _0; wobei F ₀ ist die Ruhe Ca ^{2 +-Fluoreszenz),} Anstiegszeit, Zeit bis zum Gipfel, Dauer (FDHM , Vollzeit bei halber Größe) und räumliche Breite (FWHM, volle Breite bei halber Größe) der aufgezeichneten Funken. Diese Parameter stellen die grundlegenden Eigenschaften des Gating RYR Ca ^{2 +-Kanäle} wie das Ca ^{2 +-Fluss} (Amplitude) und Gating-Kinetik des RyRs (Dauer).
2. Analysieren Sie digitale Bilddaten mit einem speziell entwickelten, halbautomatische Algorithmus, der mit Bildbearbeitungssprache IDL (Interactive Data Language) erstellt wurde, wie zuvor beschrieben, ^11,16. Weil die einzigartige Kinetik der Ca ^{2 +-Freisetzung} im Fall von Ca ^{2 +-Sparks} in FDB Fasern durch osmotischen Stress induziert, ist es besser, die manuelle und automatisierte Funktionen von Ca ^{2 +} Veranstaltungen kombinieren FunkeIdentifikation und Bearbeitung mit dieser Bild custom-build-Analyseprogramme ^11. Dieser Algorithmus ist sehr nützlich, wenn es notwendig ist, in einigen Muskelerkrankung Modelle manuell identifizieren ROI (Region of Interest). Sobald ein ROI definiert ist, könnte der Algorithmus die oben genannten Parameter Funken, die dann auf Excel-Datei exportiert werden könnten, automatisch abzuleiten. Alternativ kann die Öffentlichkeit verfügbaren Bildverarbeitungssoftware, wie zB SparkMaster in ImageJ, verwendet, um die kinetischen Eigenschaften von Ca ^{2 +} Funken und ihre räumliche Verteilung im Skelettmuskel ¹⁷ definieren.

Ergebnisse

Frühere Studien zeigten, dass vorübergehende hypoosmotischen Stress induzierte periphere Ca ^{2 +} Funken neben dem sarkolemmalen Membran in intakten Muskelfasern ^11. Abbildung 1 zeigt die Bilder der intakten einzelnen Muskelfasern mit glatten sarkolemmalen Membran und charakteristischen Rillen klar. Abbildung 2 zeigt typische Ca ^{2 +} Funken (als xy-Bilder) wurden durch transiente (100 sec) Behandlung mit einer Lösung, die die hypoosmotischen FDB...

Diskussion

Diese Methode zur Beurteilung der Ca ^{2 +-Sparks} in intakten Skelettmuskel ist ein nützliches Werkzeug für Muskelphysiologie und Krankheitsforschung. Wir zeigten, dass die Ca ^{2 +-Funken} Reaktion wurde unter verschiedenen Bedingungen verändert wurde, einschließlich Muskeldystrophie ^11, Alterungs ^{_18, 19,} sowie in der amyotrophen Lateralsklerose ^20. Unsere aktuelle Studie ergab auch, funktionelle Kopplung zwischen IP _3-Rezeptor und RyR, die ein...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting microscope			Dissect out fibers and check muscle integrity
Dissection tools -scissors and fine tip forceps	Fine Science Tools
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	DOW CORNING	184 SIL ELAST KIT	Make ahead of time for fiber dissection. Mix 5 ml liquid Sylgard components and pour into a 60 mm glass Petri dish and waiting 48 hr to let the Sylgard compound become a clear, colorless solid substrate.
60 mm glass Petri dish	Pyrex	3160	Fiber dissection
Isotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Minimal Ca2+ Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Hypotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Collagenase type I	Sigma-Aldrich	C-5138	Fiber digestion
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201	Fluorescent Ca2+ imaging dyes
TMRE	Invitrogen	T669	mitochondrial membrane potential fluorescent dyes
Delta TPG dishes	Bioptechs	0420041500C	35 mm glass bottom dish for imaging
Spark Fit software			data analysis software
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope	Bio-Rad
3 Axis Micromanipulator	Narishige International	MHW-3
Temperature controllable orbital shaker	New Brunswick scientific		Fiber dissociation