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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Lipoxygenase (LOX) Isozyme können Produkte erzeugen, die Neuroinflammation und Neurodegeneration erhöhen oder verringern können. Eine Gen-Umgebungs-Interaktionsstudie konnte LOX-isozymespezifische Effekte identifizieren. Die Verwendung des 1-Methyl-4-Phenyl-1,2,3,6-Tetrahydropyridin (MPTP)-Modells der Nigrostriatalschäden in zwei LOX-Isozymen-defizienten transgenen Linien ermöglicht einen Vergleich des Beitrags von LOX-Isozymen zur dopaminergen Integrität und Entzündung.

Zusammenfassung

Lipoxygenase (LOX) Aktivität wurde in neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit verwickelt, aber seine Auswirkungen bei der Parkinson-Krankheit (PD) Pathogenese sind weniger verstanden. Gen-Umgebung-Interaktionsmodelle haben Nutzen bei der Entlarvung der Auswirkungen bestimmter zellulärer Pfade in Toxizität, die nicht allein mit einem rein genetischen oder toxischen Krankheitsmodell beobachtet werden können. Um zu bewerten, ob verschiedene LOX-Isozyme selektiv zur PD-bezogenen Neurodegeneration beitragen, können transgene(d. h. 5-LOX- und 12/15-LOX-Mangel) Mäuse mit einem Toxin herausgefordert werden, das Zellverletzungen und Tod in der Erkrankung imitiert. Hier beschreiben wir die Verwendung eines Neurotoxins, 1-Methyl-4-Phenyl-1,2,3,6-Tetrahydropyridin (MPTP), das eine nigrostriatale Läsion erzeugt, um die unterschiedlichen Beiträge von LOX-Isozymen zur Neurodegeneration im Zusammenhang mit PD zu klären. Die Verwendung von MPTP in der Maus und nichtmenschlichen Primaten ist gut etabliert, um die nigrostriatalen Schäden in PD zu rekapitulieren. Das Ausmaß der MPTP-induzierten Läsion wird durch HPLC-Analyse von Dopamin und seinen Metaboliten und semi-quantitative Western-Blot-Analyse von Striatum für Tyrosinhydroxylase (TH), das ratenbegrenzende Enzym für die Synthese von Dopamin gemessen. Zur Beurteilung von Entzündungsmarkern, die LOX-Isozym-selektive Empfindlichkeit nachweisen können, werden glialfibrilläres saures Protein (GFAP) und Iba-1-Immunhistochemie an Hirnabschnitten durchgeführt, die Substantia nigra enthalten, und GFAP Western Blot-Analyse wird an stitaalen Homogenaten durchgeführt. Dieser experimentelle Ansatz kann neue Einblicke in Gen-Umgebung-Wechselwirkungen liefern, die der nigrostriatalen Degeneration und PD zugrunde liegen.

Einleitung

Die Verwendung von Gen-Umgebungs-Interaktionsmodellen bietet einen Ansatz zur Nachahmung von Risikofaktoren, die wahrscheinlich die idiopathische Parkinson-Krankheit (PD) beeinflussen, und bietet die Möglichkeit, mechanistische Erkenntnisse zu erkennen, die wahrscheinlich nicht durch den Einsatz eines genetischen oder toxischen Systems allein aufgeklärt werden können1,2. Hier veranschaulichen wir diesen Punkt und beschreiben die Anwendung des 1-Methyl-4-Phenyl-1,2,3,6-Tetrahydropyridin (MPTP) Mausmodells der nigrostriatalen Degeneration3, um die Selektivität der Lipoxygenase (LOX)-Isozymaktivität auf Neuroinflammation und Toxizität besser zu verstehen4. Während eine Rolle für LOX-Isozyme bei peripheren Erkrankungen5,6 sowie ZNS-Krankheit einschließlich Schlaganfall7 undAlzheimer-Krankheit 8,9weithin bewertet wurde, ist die Rolle der Familie der Isozyme in der nigrostriatalen Funktion und Degeneration im Zusammenhang mit PD nicht gut verstanden und rechtfertigt eine Studie. Das MPTP-Neurotoxin zeigt eine bevorzugte Degeneration des nigrostriatalen Weges und rekapituliert die striatale Dopamin-Erschöpfung und nigralen dopaminergen Zellverlust, der motorischen Beeinträchtigungen bei PD-Patienten zugrunde liegt10. Während dieses Modell nicht den vollständigen Kader der nicht-motorischen und motorischen PD-Verhalten und offen α-Synuclein-positive Lewy Körperpathologie reproduziert, war es nützlich, neue mechanistische Ziele, die zu nigrostriatalen Schäden beitragen und für frühphase translationale Tests, da es das am besten charakterisierte nichtinvasive Modell zur Verfügung, um zuverlässig nigralen Zelltod begleitet von striatalen Dopaminverlust11-15zu produzieren. Die breite Verwendung der MPTP-Maus, mit Paradigmen von akuten, subakuten bis chronischen16-18, hat eine Standardisierung der Dosing ermöglicht, um zu leichten bis schweren nigrostriatalen Schädenführen 19,20 mit Aktivierung verschiedener Mechanismen der Toxizität in Abhängigkeit von der Behandlungsschema18,21,22. Dies ermöglicht es, ein "Fenster der Läsion" gezielt zu zielen, das zu einer verstärkten oder reduzierten Nigrostriatal-Verletzung in Abhängigkeit vom therapeutischen Mittel oder dem transgenen Modell führen kann, das23-25verwendet wird.

Für translationale und Entdeckungsbiologie-Studien sind auch die Techniken zur Schadensbewertung und die Beweise, die solche Methoden liefern, unerlässlich. Für das MPTP-Mausmodell sind etablierte Metriken zur Beurteilung der Läsionsart die Messung von Markern des striatalen dopaminergen Tons, einschließlich Dopamin und seiner Metaboliten durch HPLC, und die Western-Blot-Analyse von Tyrosinhydroxylase (TH), dem ratenbegrenzenden Enzym in der Dopaminsynthese, und Indikatoren für degenerative Ereignisse wie die Gliaaktivierung mittels Western Blot Analysis und Immunohistochemistry4. Obwohl es sich um klassische neurochemische, biochemische und histologische Verfahren handelt, bieten die Techniken kritische und reproduzierbare Auslesungen über das Ausmaß der Schäden innerhalb des nigrostriatalen dopaminergen Weges, weisen auf Toxizitätsmechanismen hin und haben sich als wertvolle Werkzeuge zum Verständnis degenerativer Ereignisse bei PD erwiesen.

Protokoll

Hinweis: Alle Tierverfahren und Tierpflegemethoden sollten vom Institutionellen Ausschuss für Tierpflege und -nutzung (IACUC) der Einrichtung genehmigt werden. Die hier beschriebene Studie wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des IACUC von SRI International durchgeführt.

1. Erwerb und Wartung von LOX-Mäusen mit Mangel

  1. Kaufen Sie 5-LOX-mangelhafte oder 12/15-LOX-mangelhafte Mäuse und die entsprechenden Stamm- und Geschlechtskontrollen im Alter von 7-8 Wochen und lassen Sie mehrere Tage für die Akklimatisierung der Einrichtung nach der Ankunft.
  2. Halten Sie Mäuse in Gruppengehäuse auf einem 12-h Hell-Dunkel-Zyklus und geben Nahrung und Trinkwasser ad libitum.

2. MPTP-Vorkehrungen, Lagerung, Vorbereitung, Dekontamination und Entsorgung

Hinweis: MpTP-Intoxikation durch intravenöse Exposition beim Menschen hat gezeigt, dass Parkinsonismusverursacht 10; MPTP ist hoch lipophil und kann leicht die Blut - Hirn-Schranke26überqueren. Es sollten Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, um eine sichere Handhabung, Entgiftung und Entsorgung zu gewährleisten. Sein Stoffwechsel umfasst mehrere Schritte einschließlich Umwandlung in 1-Methyl-4-Phenyl-2,3-Dihydropyridinium durch das Enzym Monoaminoxidase B (MAO-B)27. MAO-B-Hemmer können bei versehentlicher menschlicher Vergiftung eingesetzt werden.

  1. Stellen Sie sicher, dass das Personal über angemessene Sicherheits- und Handhabungsschulungen verfügt, bevor Sie MPTP verwenden, wie vom Ausschuss für Gesundheit und Sicherheit der Institution diktiert. Jede Institution kann auf der Grundlage der in der Literatur17,22ausführlich dargelegten Empfehlungen ihre eigenen Standardverfahren für die Verwendung von MPTP festlegen und umsetzen.
  2. Vor der Vorbereitung sollten Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) einschließlich der folgenden: Einweg-Labormantel oder Ganzkörperanzug, Doppelte Nitrilhandschuhe, chirurgische Maske, Haarschutz, Schutzbrille und Einweg-Schuhbezüge. Bei der Vorbereitung von MPTP, dem Injektionsparadigma und 72 h nach der Injektion beim Umgang mit Tieren und/oder Bettwäsche sollte die richtige PSA getragen werden.
  3. Führen Sie Berechnungen vor der Vorbereitung durch. Die institutionellen Leitlinien für die Beweihrtung von Volumina sollten befolgt werden; Lieferung von 100-150 l wird typischerweise für 25-30 g Mäuse verwendet.
    1. Um eine 3 mg/ml MPTP-Lösung in Saline vorzubereiten, wenden Sie einen Korrekturfaktor an (1.211 MPTP-HCl: 1.0 MPTP freie Basis); die Konzentration von MPTP-HCl im Saline-Fahrzeug beträgt 3.633 mg/ml.
    2. Bereiten Sie alle Geräte, Vorräte und Reagenzien vor, die für die MPTP-Vorbereitung und mögliche Verschüttungsdekontamination benötigt werden, bevor Sie mit dem Neurotoxin umgehen.
  4. Entfernen Sie die MPTP-HCl-Quelldurchstechs vom richtigen Speicherort.
    Hinweis: MPTP sollte bei RT in einer geschlossenen Durchstechflasche in einem sekundären Behälter beibehalten und in einem verschlossenen Schrank mit der Bezeichnung "MPTP" gespeichert werden.
    1. Abdeckung Bereich um Waagen mit Pads oder Papiertücher mit 10% Bleichlösung gedämpft, um das Risiko von verschüttetem Pulver zu reduzieren. Halten Sie Gewebe und 10% Bleichlösung vorsorglich in der Nähe.
    2. Mit einem analytischen Gleichgewicht in einer Dunstabzugshaube, wiegen 50 mg MPTP-HCl in Glasfläschchen mit sekundärem Containment mit 10% Bleichgewebe. Beschriften Sie die Glasflasche "MPTP" mit Konzentration und Datum.
    3. Quelle durchstechern und außen mit 10% Bleichmittel abwischen.
  5. Langsam 13.763-ml sterile Saline zu Durchstechflasche geben und zum Mischen komplett schließen. (Lösung ist 3.633mg/ml MPTP-HCl.)
    1. In der Haube die MPTP-Lösung sorgfältig sterilisieren, indem Sie mit einem 0,22 m Filter in eine markierte Injektionsflasche in einem Sekundärbehälter mit 10% bleichgetränktem Gewebe filtrieren. Reinigen Sie alle Verschüttungen mit bleichgetränktem Gewebe.
    2. Scharfe und Durchstechflasche sorgfältig in entsprechend gekennzeichneten Biohazard-Behältern entsorgen. MPTP-Lösung in Durchstechflasche im Sekundärbehälter mit bleichgetränktem Gewebe für den Transport in den Tierprozedurraum aufbewahren.
      Hinweis: Autoklaven Sie keine MPTP-Lösung für die Sterilisation, da ihre Verdampfung eine Inhalationsgefahr darstellt.
  6. Zurücksetzen sie die MPTP-Quelldurchstechsons in den sekundären Container und legen Sie sie am Lagerort ab. Spachtel, analytische Skala und Kapuzenoberfläche für 10 min mit 10% Bleichmittel dekontaminieren.

3. MPTP-Verwaltung

  1. Bereiten Sie Einwegkäfige mit Standard-Mikroisolator-Perforatdeckeln mit Polyester-gefilterten Linern mit der Aufschrift "MPTP" (minus Draht-Lebensmittelgrill), Einweg-Käfiglinern, vornassen Lebensmittelpellets und Hydrogel als Wasserquelle vor. Wiegen Sie alle Tiere und rekordvolumen von 3 mg/ml MPTP in Saline für 15 mg/kg Injektion erforderlich.
    Hinweis: MPTP-Metaboliten sind in Ausscheidungen für 3 Tage nach der Injektion28,29nachweisbar; Mäuse scheiden jedoch MPTP-n-Oxid aus, ein ungiftiges Derivat, das membranen wegen seiner Hydrophilie30nicht kreuzt.
    1. Tragen aller oben aufgeführten PSA und halten Sie Mäuse über ein Einweg-Absorptionspad, injizieren Sie eine Saline-Fahrzeug- oder MPTP-Lösung für 15 mg/kg Dosis in die intraperitoneale Höhle (i.p.), täglich für 4 Tage mit einer Einweg-Tuberkulinspritze mit 26 Gauge.
    2. Spritze nach Gebrauch nicht rekapieren; in einen speziellen und gekennzeichneten MPTP Biohazardous Sharps Behälter. Bewahren Sie 10% Bleichmittel und Gewebe in der Nähe auf, um versehentliche Tropfen zu reinigen.
  2. Legen Sie Tiere, die mit MPTP injiziert werden, in Einwegkäfige, bis zu 5 Mäuse pro Käfig und Haus auf offenen Regalen. Verwenden Sie keine belüfteten Racks.
    1. Platzieren Sie MPTP-Anwendungsplakate auf Rack mit Mäusen und Gehäuseraumtür bis 72 h nach der letzten Injektion.
      Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Temperatur des Gehäuseraums zwischen 22,2 und 24,4oC liegt, da Mäuse eine vorübergehende Hypothermie bis zu 12h nach MPTP-Intoxikation erleben. 31
    2. Dekontaminieren Sie die Arbeitsfläche nach jedem Gebrauch mit Bleichmittel (siehe Schritt 2.8), entsorgen Sie die übrig gebliebene MPTP-Lösung durch Zugabe eines Volumenäquivalents von 10 % Bleichmittel und entsorgen Sie den Inhalt als biogefährliche flüssige Abfälle.
    3. Entsorgen Sie alle gebrauchten PSA in einem speziellen Entsorgungsbehälter. Bei Bedarf vor der Entsorgung mit 10% Bleichmittel besprühen.
  3. Überprüfen Sie die Tiere regelmäßig und erfrischen Sie die Nahrung und die Wasserquelle täglich während des Injektionsparadigmas und 72 h nach der letzten Injektion. Hinweis: Obwohl in dem Bereich, der unmittelbar die Außenseite des Käfigs umgibt, keine Kontamination zu erwarten ist, wird dieser Bereich vorsorglich mit der Bleichlösung behandelt (wie in Schritt 2.8 beschrieben). Bei der Handhabung aller Mäuse und Geräte während dieser Zeit ist Vorsicht geboten.
    1. Drei Tage nach der letzten Injektion alle Käfige und Liner in einem entsprechend gekennzeichneten Biohazard-Beutel entsorgen. Wiederverwendung von regulären PSA und normalem Tierheim; Tür- und Regalplakate entfernen.

4. Gewebeernte

  1. Euthanisieren Sie Tiere durch Zervixdislokation 7 Tage nach der letzten MPTP-Injektion. Sezieren Sie das Gehirn sofort auf Eis mit vorgekühlter Hirnform mit 1-mm-Steckplätzen in der koronalen Ebene.
  2. Stutzieren Sie das Striatum aus einer 2 mm dicken Vorderhirnscheibe auf Höhe der vorderen Kommissure.
    1. Entfernen Sie umliegende kortikale und subkortikale Bereiche mit einem Skalpell. Schnappgefrieren des Striatalgewebes aus jeder Hemisphäre in einem separaten 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr für neurochemische oder biochemische Analysen.
  3. Block Midbrain/Hindbrain in der koronalen Ebene auf der Ebene des vorderen Hypothalamus und immersionsfixiertes Gewebe in 4% formaldehyd wässriger Lösung.

5. Gewebeverarbeitung

  1. Verfahren für die Biochemie
    1. Homogenisieren Sie das Stupatikgewebe einer Hemisphäre mit einem Ultraschall-Zelldisruptor im 200-L Tris-EDTA-Lysepuffer (25mM Tris Base, 1mM EDTA, 1:100 Protease- und Phosphatase-Inhibitor-Cocktails) für 10 Pulse bei 10-12 Hz und zentrifugiert für 10 min bei 4oC bei 1000xg.
    2. Den Überstand vorsichtig ansaugen und das Pellet in einem 150-l-Lysepuffer rekonstituieren. Fraktionen werden für die biochemische Analyse von SDS-PAGE und Western Blotting verwendet.
      Hinweis: Verwenden Sie Protease- und Phosphatase-Inhibitor-haltigen Puffer innerhalb von 1 h der Zubereitung aufgrund von Instabilität in wässrigen Lösungen.
  2. Prozess für die Neurochemie
    1. Verwenden Sie Striatum, das aus einer anderen Hemisphäre aus jeder Bei -80°C für HPLC gespeicherten Probe seziert wird. Striatalgewebe in Mikrofugenröhren auf Eis auftauen, 500-l 0,3N Perchlorsäure (PCA) hinzufügen und mit Schalltoner homogenisieren.
      Hinweis: Um 100 ml 0,3N PCA herzustellen, 90 ml ddH2O messen, zu einem 100-ml-Zylinder hinzufügen, 2,58 ml 70% PCA hinzufügen und auf 100-ml-Marke bringen. Dieser Probenpuffer kann bis zu einem Monat bei 4°C gelagert werden.
    2. Striatalgewebe in 500-l eiskaltem 0,3N PCA beschallen, für 10 Impulse bei 10-12 Hz und auf Eis legen. Um die Homogenität zu gewährleisten, beschallen Sie Proben ein zweites Mal für 10 Sek., dann Zentrifugieren für 12 min bei 4oC bei 16.100xg.
    3. Sofort dekantieren überstand auf 1,5-ml-Mikrozentrifugen-Röhrchen und lagern bei -80°C. Die Pelletfraktion in der Haube lufttrocknend.
    4. Halten Sie den Überstand bei -80°C bis zur Verwendung für die Messung von Dopamin und seinen Metaboliten, 3,4-Dihydroxyphenylessigsäure (DOPAC) und Homovanillinsäure (HVA) durch HPLC mit elektrochemischer Detektion.
    5. Nach dem Trocknen die Pelletfraktion in 0,5N NaOH (500 l) rekonstituieren und kurz beschallen. Rekonstituierte Pelletfraktion bei 4°C lagern, bis sie zur Bestimmung des Gesamtproteins nach der Lowry-Methode verwendet wird.
  3. Verfahren für die Immunhistochemie
    1. Immersionsfixe Mittel- und Hinterhirnblöcke über Nacht in 4% formaldehydwäsrige Lösung und Kryoprotect in abgestuften Saccharoselösungen (10% in phosphatgepufferter Salin (0,01 M PBS; 0,138 M NaCl, 0,0027 M KCl und ddH2O, pH 7,4) für 24 h, dann 30% in PBS bis zum Gewebesenken) bei 4°C. Kurz fälschen kryogeschützte Blöcke, um überschüssige Saccharoselösung zu entfernen, auf Trockeneis einzufrieren und bei -80°C bis zum Gebrauch aufzubewahren.
    2. Mikrotome Schnitt von Gehirnblöcken enthalten Mittel- und Hinterhirn in einem Kryostat.
      1. Gewebe von -80°C entfernen, bei -16°C für 1 h in Kryostat ausdemieren und in Gewebeeinbettungsmedien montieren.
      2. Sammeln Sie koronale Abschnitte mit einer Dicke von 40 mm in kryoprotektierister Lösung (0,01M PBS mit 30 % Saccharose, 30 % Ethylenglykol, pH 7,4) bei -16 °C. Gewebe in 240-um-Intervallen seriell in 6 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen sammeln und bei -20°C lagern.

6. Immunoblotting

  1. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration in der sttriatalen Überstandfraktion (zubereitet wie in Abschnitt 5.1 beschrieben) durch BCA-Assay.
  2. Berechnen Sie die für jede Probe erforderliche Verdünnung, um 10 g pro Bohrung in einem Volumen von 20 l zu ergeben.
  3. Verdünntes überstandes Protein mit 4X Laemmli Puffer und Homogenisierungspuffer, um 10 g Protein in 1X Laemmli Pufferlösung zu ergeben. Beispielberechnung:
    1. Bestimmen Sie die endgültige Konzentration von Protein und Volumen erforderlich. In diesem Fall sind 10 g in 20 l (0,5 mg/ml) erforderlich.
    2. Bestimmen Sie das endgültige Volumen der benötigten Proteinlösung. Obwohl für die Beladung 20 l erforderlich sind, sollte ein zusätzliches Volumen (30 l) vorbereitet werden.
    3. Da das endgültige Volumen und die Konzentration bekannt sind und die Konzentration der Proteinüberstandsfraktion bekannt ist (bestimmt durch den BCA-Assay), berechnen Sie das Volumen des Proteinüberstandes, der mit der Gleichung erforderlich ist:
      VÜberstand = (Vfinal x Cfinal)/C überstand
      Bei einer überstandenen Proteinkonzentration von 1,5 mg/ml
      VÜberstand = (30 x l x 0,5 mg/ml)/1,5 mg/ml
      VÜberstand = 10 l
    4. Berechnen Sie die Menge des 4X Laemmli Puffers, der erforderlich ist, um eine 1x-Konzentration in 30 l Volumen (30 l / 4 = 7,5 'l) zu erzielen. Hinweis: Der 4X Laemmli Puffer muss in der Probenvorbereitung auf eine 1-fache Stärke verdünnt werden.
    5. Berechnen Sie die Menge des Homogenisierungspuffers, der erforderlich ist, um das Volumen auf 30 l zu erhöhen (und die gewünschte endgültige Proteinkonzentration von 0,5 mg/ml zu erhalten):
    6. Bereiten Sie die Probe durch Wirbeln vor und pipetieren Sie 10 l Proteinüberstand in 12,5 l Homogenisierungspuffer. Fügen Sie 7,5 l 4X Laemmli Puffer für eine 30-l-Probe Arbeitslösung und 0,5 mg/ml Konzentration hinzu.
  4. Bereiten Sie alle Proben mit Verfahren beschrieben, Wirbel und kochen für 5 min.
    Hinweis: Verwenden Sie Schraub-Top-Mikrozentrifugenrohre, um Leckagen und Öffnung durch Druck während des Kochens zu verhindern.
  5. Nach 5 min sofort auf Eis legen. Laden Sie 20 l Probenarbeitslösung pro Gelbrunnen (10 g Protein). Separate Proteinproben von SDS-PAGE auf einem 12% Tris-Glycin-Gel.
    1. Verwenden Sie eine vorgebeibte Proteinleiter zur Bestätigung von Molekulargewichten. Der Laufpuffer beträgt 25 mM Tris-Basis, 192 mM Glycin, 0,1% SDS und ddH2O, pH 8,3.
    2. Trennen Sie Proteine durch Elektrophorese: Laufen Sie bei 80 V, um die Brunnen (10 min) und 125 V (ca. 1 h; bis die Proteinleiter vollständig getrennt ist) zu räumen, um die Proteine aufzulösen.
  6. Durchführung des Protein-zu-Nitrocellulose-Transfers mit 0,2 m Nitrocellulosemembran im Tris-Glycin-Transferpuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,04 % SDS, 20 % Methanol und ddH2O, pH 8,3) über Nacht für 40 V bei 4°C.
  7. Nitrocellulose-Blots in 1x Tris-Kochchen (TS; 25mM Tris, 0,9% NaCl in ddH2O, pH 7,4) 10 min bei RT. lncubate in Ponceau S für 5 min waschen und dann in ddH2O ausspülen, um eine grobe Überprüfung der äquivalenten Proteinbelastung zu ermöglichen. Scannen Sie das Bild, um die Aufzeichnung für Notebook sunden sie mithilfe von PBS aufzubewahren.
    Hinweis: Alternativ waschbar in Milli-Q oder ddH2O mit HCl (0,2%) für ca. 5 min. Suchen nach Aufzeichnung. Entfernen Sie den Ponceau S-Fleck durch nachfolgenden Inkubationsschritt (d. h. in den Sperrpuffer legen).
  8. Blockloten in 5% fettfreiem Milchpulver in TS für 1 h bei RT und 24h bei 4oC mit Kaninchen-Antityrosinhydroxylase (1:1000), Anti-β-Actin (1:200) inkubieren; Anti-GFAP (1:1000) in 5% Milch-TS.
  9. Blots 3 x 5 min in TS mit 0,05% Tween-20 und 1 x 5 min in TS waschen, dann in HRP-konjugierten Sekundärantikörper (1:5000 in TS mit 5% Milch) brüten, abgestimmt auf die Art des Primären, für 2 h bei RT.
  10. Bereiten Sie chemilumineszierendes Substrat mit gleichen Volumina von Luminol- und Peroxidlösungen vor und wenden Sie 1-3 min an. In einer Dunkelkammer, Legen Sie Blot in einer Kunststoffhülle für Filmbelichtung und setzen Sie Film aus; Film wird dann mit einem automatischen Prozessor entwickelt.
  11. Streifenflecken mit handelsüblichem Abisolierpuffer bei 37°C für 30 min, waschen 3x 10 min in TS mit 0,05% Tween-20 und 1x 10 min in TS und dann erneut zur Ladekontrolle oder zu einem anderen Protein von Interesse.
  12. Quantifizieren Sie die Signale durch die Image J Software für optische Dichtemessungen und normalisieren Sie auf die interne Ladekontrolle β-actin.

7. Neurochemie

  1. Gewebe für die Analyse wird wie oben in Abschnitt 5.2 beschrieben vorbereitet. Bitte beachten Sie Tabelle 1 für mobile Phasenrezept.
    Hinweis: Alle Reagenzien müssen ≥99,0% rein und hPLC-qualität sein. Sorgen Sie für Pufferintegrität mit sauberen, dedizierten Glas- und Rührstäben. Der mobile Phasenpuffer sollte innerhalb von sieben Tagen nach der Vorbereitung genutzt werden.
    1. Dihydrogenphosphat und Zitronensäure wiegen, 1 L ddH2O hinzufügen und in einem 2-L-Zylinder mischen. Filtern Sie die Lösung durch eine 0,22-m-GSTF-Membran.
      Hinweis: Dies maximiert die Extraktion von Verunreinigungen in Phosphat und Zitronensäure, was hilft, Hintergrundströme zu minimieren.
    2. Fügen Sie die OSA gefolgt von der Acetonitril- und EDTA-Lösung hinzu. HPLC-Grade ddH2O auf ca. 1900 ml geben, bevor Sie den pH-Wert mit Phosphorsäure auf 3,0 einstellen.
    3. Fügen Sie hPLC grade ddH2O auf die 2-L-Marke, und gießen Sie dann in einen 2-L-Kolben. Fügen Sie eine spezielle Rührstange hinzu und entgasen Sie die mobile Phase, indem Sie sie für > 10 min unter Vakuum rühren.
  2. Bereiten Sie die Standards für Dopamin und DOPAC und HVA für Standardkurven vor. Lagerlösungen von Standards werden bei 1 mg/ml in 0,3 N PCA hergestellt.
    1. Wiegen Sie 12,4 mg Dopamin-HCl, und fügen Sie 10,0 ml 0,3 N PCA hinzu, um 1 mg/ml Dopamin herzustellen.
    2. Wiegen Sie 10,0 mg DOPAC und fügen Sie 10,0 ml 0,3 N PCA hinzu, um 1 mg/ml DOPAC herzustellen.
    3. Wiegen Sie 10,0 mg HVA und fügen Sie 10,0 ml 0,3 N PCA hinzu, um 1 mg/ml HVA herzustellen.
  3. Bereiten Sie funktionierende Standardlösungen aus den Lagerlösungen vor. Fünf-Punkte-Standards werden verwendet, um eine Konzentrationskurve zu erzeugen.
    1. Zur Messung von striatalem Dopamin Standardkonzentrationen von 12,5 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml und 200 ng/ml zubereiten.
    2. Für striatale DOPAC Standardkonzentrationen von 2,5 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml und 40 ng/ml zubereiten.
    3. Für die striatale HVA Standardkonzentrationen von 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml und 80 ng/ml zubereiten.
    4. Generieren Sie Fünf-Punkte-Standards: Verdünnen Sie 1 mg/ml Dopamin-Stammlösung auf 5 g/ml mit 0,3N PCA. 1 mg/ml DOPAC-Stammlösung mit 0,3N PCA auf 1 g/ml verdünnen und 1 mg/ml HVA-Stammlösung mit 0,3N PCA auf 2 g/ml verdünnen.
    5. Übertragen Sie 1 ml von 5 g/ml Dopamin, 1 ml 1 g/ml DOPAC und 1 ml 2 g/ml HVA in einen 25-ml-Volumenkolben und bringen Das Volumen mit 0,3 N PCA auf 25 ml Mark.
      Hinweis: Die gemischten Standards im Volumenkolben enthalten die höchste Konzentration der Fünf-Punkte-Normen: 200 ng/ml Dopamin, 40 ng/ml DOPAC und 80 ng/ml HVA.
    6. 1 ml der gemischten Normen in saubere 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. Führen Sie viermal eine serielle Verdünnung von 1:1 durch, um die nachfolgenden Vier-Punkte-Standards zu generieren.
      1. Zum Beispiel, um z. B. bis zu 250 l der gemischten Normen, fügen Sie 250 l Probenpuffer und Wirbel gründlich hinzu, um gemischte Standards bei 50 % der ursprünglichen Konzentrationen zu erzeugen; bis die gewünschten Verdünnungen erreicht sind.
  4. Bereiten Sie das HPLC-System vor (Pumpe, Autosampler, Rückwärtsphasensäule (C18, 150×3,2 mm, 3 m)). Reinigen Sie die Pumpe mit einer frischen mobilen Phase, um alle bisherigen Lösungen im HPLC-System zu ersetzen und Luftblasen durch eine frische mobile Phase einzufangen. Den Autosampler auf 4°C abkühlen lassen. Erwärmen Sie die Säule auf 35°C, was den Gesamtdruck reduziert.
    1. Stellen Sie die Spannung für die erste bzw. zweite Elektrode des elektrochemischen Detektors auf -150 mV bzw. 220 mV ein. Gleichgewichten Sie das System für mindestens 2 h und idealerweise über Nacht, mit der mobilen Phase mit einer Durchflussrate von 0,2 ml/min.
      Anmerkung: Während des Gleichgewichts sollten die Zellen eingeschaltet und der Basiswert überwacht werden. Der stabile Messwert zeigt an, dass das System einsatzbereit ist. Lassen Sie die mobile Phase für die zwei Stunden der Ausgleichsphase in einen Abfallbehälter, anstatt ihn umzusiezittern. Nach dieser Zeit kann die mobile Phase über Nacht für den Ausgleich recycelt werden.
    2. Sobald die Ausgleichsregelung abgeschlossen ist, stellen Sie den mobilen Phasendurchfluss auf 0,6 ml/min ein. Injizieren Sie jeweils 20 l der Fünf-Punkte-Standards.
  5. Striatalproben auf Eis auftauen und 2 x 20 l jeder Probe in das HPLC-System injizieren. Verwenden Sie Standards am Anfang und zufällig in jedem Satz von striatalen Stichproben.
  6. Verwenden Sie die Software, um den Bereich unter Dopamin-, DOPAC- und HVA-Peaks zu analysieren, die durch die Standards und Proben erzeugt werden. Identifizieren Sie Analyten nach Retentionszeit und Maß, indem Sie die Fläche unter Peak mit der der 5-Punkte-Kurve für den entsprechenden Standard vergleichen.
  7. Bereiten Sie Pelletfraktion, wie in Abschnitt 5.2.3 beschrieben. Führen Sie einen Lowry-Protein-Test auf dem striatalen Pellet durch. Hinweis: Dieser Test misst die Menge des Proteins, das in den striatalen Proben in mg/ml enthalten ist; Diese Informationen werden verwendet, um die ng/mg-Konzentration des Analyten zu bestimmen.

8. Immunhistochemie

  1. GFAP/TH Dual-Immunfluoreszenz
    1. Entfernen Sie Rohre mit geschnittenem Mittelhirn aus -20°C Gefrierschrank und bringen Sie zu RT. Entfernen Sie Gewebeabschnitte, die Substantia nigra enthalten, aus kryokonservierungsmittelhaltiger Lösung in einem Tablett, das PBS enthält.
    2. Legen Sie Gewebeabschnitte in Polystyrol-Einsätze mit Polyester-Mesh-Böden für frei schwebende Immunchemie. Waschen Sie 3 x 5 min in PBS.
    3. Transferabschnitte auf 96-Well-Platte mit 180-l-Blocklösung (5% normales Eselsserum, 1% PVP, 1% BSA und 0,3% Triton X-100 in PBS) in jedem Brunnen. 40 min bei RT inkubieren.
      Hinweis: Alle Wasch- und Inkubationsschritte werden mit leichter Rührung am Shaker durchgeführt.
    4. Transferabschnitte in Brunnen, die die primäre Antikörperlösung enthalten (180 l pro Brunnen). Inkubieren in primärer Antikörpercocktail, Kaninchen Anti-GFAP (1:1000) und Schafe Anti-TH (1:400) in PBS mit 1% BSA und 0,3% TX-100 verdünnt, für 24 h bei 4°C. IgG von der primären Art dient als negative Immunfleckenkontrolle.
    5. Inkubieren in sekundären Antikörper-Cocktail (1:200 Esel Anti-Kaninchen 568 und 1:200 FITC Esel Anti-Schafe in PBS mit 0,1% TX-100). Verwenden Sie Folie, um die Lösung vor Licht während der Vorbereitung und Inkubation zu schützen; bei RT für 2 h brüten.
      1. Zur negativen Kontrolle, inkubieren Abschnitte in IgG von der primären Art auf die gleiche Konzentration wie für die primären Antikörper verwendet.
      2. Waschen Sie 2 x PBS und 1 x TS für je 5 min bei RT. Gewebeabschnitte auf plus Rutschen im Montagemedium mit Hoechst-Färbung und Deckelschlupf montieren.
    6. Inkubieren in sekundären Antikörper-Cocktail (1:200 Esel Anti-Kaninchen 568 und 1:200 FITC Esel Anti-Schafe in PBS mit 0,1% TX-100). Verwenden Sie Folie, um die Lösung vor Licht während der Vorbereitung und Inkubation zu schützen; bei RT für 2 h brüten.
    7. Waschen Sie 2 x PBS und 1 x TS für je 5 min bei RT. Gewebeabschnitte auf plus Rutschen im Montagemedium mit Hoechst-Färbung und Deckelschlupf montieren.
    8. Schützen Sie Dias vor Licht und Oxidation bis zur Bildgebung, indem Sie sie in einer Diabox bei 4°C aufbewahren.
    9. Analysieren Sie zuerst die Negative Kontrolle, um den Hintergrundpegel der Fluoreszenz zu bestimmen, und bewerten Sie dann die positive Immunreaktivität mithilfe der fluoreszierenden Mikroskopie.
  2. Iba1-Immunhistochemie mit Chromagenfällung
    1. Entfernen Sie Rohre mit geschnittenem Mittelhirn aus -20°C Gefrierschrank und bringen Sie zu RT. Entfernen Sie Gewebeabschnitte, die Substantia nigra enthalten, aus kryokonservierungsmittelhaltiger Lösung in einem Tablett, das PBS enthält.
    2. Legen Sie Gewebeabschnitte in Polystyrol-Einsätze für frei schwebende Immunchemie. Waschen Sie Abschnitte 3 x 5 min in PBS, und legen Sie Abschnitte direkt in 12-Well-Platte mit vorgeheiztem 10 mM Zitronensäure-Monohydrat, pH 9,0, 80°C für 30 min, für Epitop-Retrieval.
    3. Kühlplatte 20 min bei RT. Teile zu Einsätzen zurückgeben und 3 x 5 min in PBS waschen.
    4. Übertragen Sie Abschnitte auf 96-Well-Platte mit 180-l-Blockierlösung (10% normales Ziegenserum, 1% BSA in PBS) pro Bohrgut und inkubieren 40 min bei RT.
    5. Transferabschnitte in Brunnen, die 180-l verdünnten Primärantikörper enthalten (1:1000 in 1% BSA-PBS). Über Nacht bei 4°C inkubieren.
    6. Übertragen Sie Abschnitte in Einfügungen. Waschen Sie 3 x 5 min PBS und wenden Sie biotinylierten Sekundärantikörper (1:200 in 1,5% normales Serum-PBS) für 1 h bei RT an.
    7. Bereiten Sie ABC-Lösung 30 min vor der Verwendung vor. Waschen Sie 3 x 5 min PBS und übertragen Sie auf ABC-Lösung für 1 h bei RT.
    8. Bereiten Sie dAB-Lösung in Haube vor. 2x 5 min in PBS und 1x 5 min in TS waschen und Inkubationsabschnitte in DAB inkubieren.
      1. Entwickeln Sie für 3-4 min. Negativkontrolle sollte hell in der Farbe bleiben.
        Hinweis: Führen Sie diesen Schritt in der Dunstabzugshaube aus, da DAB ein bekanntes Karzinogen ist. Eine Lösung von 0,2M Kaliumpermanganat inddH2O zur Dekontamination sollte bei versehentlichen Tropfen in der Nähe erhalten bleiben.
    9. Schnitte kurz in ddH2O, dann in TS 3 x 5 min. Montageabschnitte auf Plusrutschen und lufttrocken über Nacht in Dunstabzugshaube.
    10. Dekontaminieren Sie DAB-Abfall mit einem gleichen Volumen von 0,2 M Kaliumpermanganat in ddH2O, Wirbel, und in kubieren Sie in einer Dunstabzugshaube über Nacht, bevor Sie in entsprechend gekennzeichneten DAB-Abfallbehälter in Rauchhaube lagern.
      Hinweis: Die Bleichlösung beseitigt nicht die mutagenen Eigenschaften von DAB.
      1. Dekontaminieren Sie wiederzuverwendende Gegenstände (z. B. Polystyroleinsätze) und waschen Sie sie mit Waschmittel.
    11. Mit Cresylviolett (CV) leicht dehydrieren/kontrabeflecken. Alle Austrocknungs-/Waschschritte sind 3 min: Ethanol 70%, 95%, 100%, 95%, ddH2O, CV (30 Sekunden), ddH20 x 2, 95% Ethanol + Eisessig (0,1%) x 2, 100% Ethanol und Xylol.
    12. Coverslip in Distyrene-Tolululol-Xylol-Montagemedium und trocken in Rauchhaube.
    13. Beobachten Sie eine positive Immunreaktivität durch ein Lichtmikroskop. IgG von der primären Art dient als negative Immunfleckenkontrolle.

9. Statistik

  1. Bewerten Sie die Unterschiede zwischen den Mitteln durch eine einseitige Varianzanalyse (ANOVA), um Unterschiede zwischen Genotyp und durch zweiwegs ANOVA zu vergleichen, um Unterschiede zwischen Genotyp und toxischer Behandlung zu vergleichen. Nutzen Sie Tukeys HSD-Post-hoc-Analyse, wenn Unterschiede durch ANOVA-Tests beobachtet werden (p≤0.05).
    Hinweis: Experimente (mit n = 6-9 Mäusen/Gruppe) werden mindestens zweimal durchgeführt, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.

Ergebnisse

Dieses Toxin-Expositionsparadigma kann eine signifikante und nachweisbare 20% striatale Dopamin-Erschöpfung bei MPTP- vs. kochinjizierten Tieren produzieren. Es ist wichtig zu beachten, dass verschiedene Lose von MPTP etwas mehr oder weniger Läsion ergeben können; Daher wird für eine bessere Präzision ein vorläufiges Experiment an Wildtypmäusen vor der Verwendung in Transgenen empfohlen, wenn eine neue Menge Neurotoxin verwendet wird. Die Verwendung von leicht bis mäßiger Läsion ermöglicht die Beobachtung der...

Diskussion

Das Design dieser Gen-Umgebungs-Interaktionsstudie ermöglichte es uns, neue Informationen über die Dualität des 5-LOX-Isozymen im nigrostriatalen Weg zu gewinnen. Durch die Durchführung von HPLC zur Messung von striatalen Monoamonien nach salinen oder MPTP-Behandlung in Transgenen ohne das 5-LOX-Isozym und ihre Wildtyp-Littermate konnten wir feststellen, dass sein Mangel unter toxischen Bedingungen zu schützen scheint (Abbildung 1), aber unter normalen Bedingungen reduziert der Mangel an dem Enzym ...

Offenlegungen

Es gibt nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health NIGMS 056062 finanziert.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetra-hydropyridine hydrochloride (MPTP-HCL)Sigma-AldrichM0896for PD modeling
4% Formaldehyde (paraformaldehyde) solution, phosphate-buffered (PFA)American MasterTech ScientificBUP0157for immersion fixation
Perchloric acid ACS reagent, 70% (PCA)Sigma-Aldrich244252for HPLC acid extraction
Tris BaseSigma-AldrichT1503for tissue homogenization
Ethylenediaminotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)Sigma-AldrichE1644for tissue homogenization
Protease inhibitor cocktailSigma-AldrichP8340for tissue homogenization
Phosphatase inhibitor cocktailSigma-AldrichP5726for tissue homogenization
Sodium Hydroxide (NaOH)Sigma-AldrichS5881for Lowry protein assay
Sucrose, molecular biology, ≥99.5% (GC) Sigma-AldrichS0389for cryoprotection
Phosphate buffered saline, powder, pH 7.4 (for 0.01 M PBS)Sigma-AldrichP3813for IHC
BCA Protein Assay KitPierce/Thermo23225for protein determination
Novex 12% Tris-Glycine Mini Gels 1.0 mm, 12-wellInvitrogen/Life TechnologiesEC60052BOXfor SDS-PAGE
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)Invitrogen/Life TechnologiesNP0007for SDS-PAGE
Novex Sharp Prestained Protein Standard Invitrogen/Life TechnologiesLC5800protein ladder
GlycineSigma-AldrichG7126for SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulfate, electrophoresis, 98.5% (SDS)Sigma-AldrichL3771for SDS-PAGE
Methyl Alcohol, Anhydrous, Reagent American MasterTech ScientificSPM1057Cmethanol for transfer
Sodium chloride (NaCl), ACS reagentSigma-AldrichS9888saline and buffers
Nonfat dry milk powderCarnationn/afor immunoblotting
Ponceau S solution in 5% acetic acid Sigma-AldrichP7170for immunoblotting
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), sheep polyclonalChemicon/MilliporeAB1542for immunofluorescence 
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), rabbit polyclonalPel-Freez BiologicalsP40101-0for immunoblotting
Anti-β Actin, rabbitSigma-AldrichA2066for immunoblotting
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), rabbit polyclonalChemicon/MilliporeAB5804for immunofluorescence
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), mouse monoclonalCovance Inc.SMI-22Rfor immunoblotting
Tween-20Sigma-AldrichP1379for immunoblotting
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Peroxidase Conjugated Fisher Scientific31462for immunofluorescence
goat anti-sheep, peroxidase conjugatedPierce/Thermo31480for immunofluorescence
goat anti-mouse, peroxidase conjugatedPierce/Thermo31430for immunofluorescence
SuperSignal West Pico Chemiluminescent SubstratePierce/Thermo34078for immunoblotting
CL-XPosure Film 7 in x 9.5 in Pierce/Thermo34089for immunoblotting
Restore Western Blot Stripping Buffer Pierce/Thermo21059for immunoblotting
Citric acid monohydrate, ACS reagent, ≥99.0% Sigma-AldrichC1909for IHC
Normal Donkey SerumMilliporeS30-100MLfor IHC
Polyvinylpyrrolidone (PVP)Sigma-AldrichP5288for IHC
Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilizedSigma-AldrichA3294for IHC
Triton X-100Fisher ScientificBP151-01for IHC
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568-labeled Invitrogen/Life TechnologiesA10042for IHC
Donkey Anti-Sheep IgG (H+L), FITC Jackson ImmunoResearch713-095-147for IHC
VECTASHIELD Hard-Set Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1500for IHC
Normal Goat SerumMilliporeS26-100MLfor IHC
VECTASTAIN ABC Kit (Rabbit IgG ) Vector LaboratoriesPK-4001for IHC; 10 µl each of solutions A and B per 1 ml PBS (per instructions )
DAB Peroxidase Substrate Kit, 3,3’-diaminobenzidineVector LaboratoriesSK-4100for IHC; per 5 ml cold ddH2O, add 2 drops buffer stock solution, 2 drops DAB, and 1 drop H2O2 (H2O2 is added immediately before use)
Hydrogen peroxide, 30%Sigma-Aldrich216763for quench step in IHC
Rabbit anti-Iba1Biocare MedicalsCP290Afor IHC
Cresyl Violet Solution, Regular Strength FD NeurotechnologiesPS102-01counterstain for Iba1 IHC
95% Ethanol, reagent alcoholSigma-AldrichR8382dehydration for IHC
100% Absolute ethanolMallinckrodt7019-10dehydration for IHC
Acetic acidSigma-AldrichA6283destaining for IHC
XyleneSigma-Aldrich534056clearing agent for IHC
DPX MountantSigma-Aldrich06522mounting medium for DAB IHC
O.C.T. Compound - Frozen Section Embedding Medium American MasterTech ScientificEMOCTCSembeddium medium for cryostat cutting
Potassium permanganateSigma-Aldrich223468to decontaminate DAB solution
Dopamine hydrochlorideSigma-AldrichH8502for HPLC
3,4-Dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC)Sigma-Aldrich850217for HPLC
Homovanillic acid (HVA)Sigma-AldrichH1252for HPLC
Perchloric acid (PCA) - 70%Sigma-Aldrich244252for HPLC
Sodium dihydrogen phosphate monohydrateSigma-Aldrich71504for HPLC
Citric acid monohydrateSigma-AldrichC1909for HPLC
1-Octanesulfonic acid sodium salt (OSA)Sigma-AldrichO8380for HPLC
EDTASigma-AldrichE1644for HPLC
AcetonitrileEMDAX0145-1for HPLC
HPLC-grade distilled deionized water (ddH2O)Milliporefor HPLC
0.22 µm GSTF membraneMilliporefor filtration
Corning NetwellsSigma-AldrichCLS3477polystyrene insert with polyester mesh bottom, for IHC
Ultrasonic cell disrupter (Soniprep 150)MSEMSE.41371.274
MicrocentrifugeEppendorf5414R
ESA MD-150 reverse-phase column ESA
HPLC Pump (Ultimate 3000)DionexISO-3100BM
HPLC Autosampler (Ultimate 3000)DionexWPS-3000TSL
Electrochemical detectorESACoulochem III
Guard CellESA5020
Analytical CellESA5011A
Chromeleon softwareDionex
Eclipse E400NikonE400light/fluorescent microscope
Disposable mouse cageAncareN10HT
Microfilter topAncareN10MBT
5-LOX- deficient miceThe Jackson Laboratory004155
12/15-LOX-deficient miceThe Jackson Laboratory002778

Referenzen

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