Submillisekunden Konformationsänderungen in Proteinen durch Photothermische Ablenkein Gelöst

Zusammenfassung

Eine Anwendung der photothermischen Strahlablenkung Technik in Kombination mit einem Käfig Calciumverbindung, DM-Nitrophen zu Mikrosekunde und Millisekunde Dynamik und Energetik von strukturellen Veränderungen mit dem Calcium-Verband zu einer neuronalen Kalziumsensor, Downstream Regulatory Element Antagonist Modulator verbunden überwachen Hier berichten wir .

Zusammenfassung

Photothermische Strahlablenkung zusammen mit photoakustischen Kalorimetrie und thermische Gitter gehört zu der Familie der photothermischen Methoden, die die Zeit-Profil Volumen und Enthalpie Veränderungen von Licht induzierten Konformationsänderungen in Proteinen auf Mikrosekunde bis zu Zeitskalen, die nicht zugänglich sind Millisekunden mit traditionellen Stop überwachen Flussinstrumenten. Da außerdem Gesamtänderungen und / oder die Enthalpie sondiert werden, diese Techniken zu Proteinen und anderen Biomakromolekülen, die einen Fluorophor oder ein Chromophor Markierung fehlen angewendet werden. Um Dynamik und Energetik von strukturellen Veränderungen verbunden mit Ca ^{2 +-Bindung} zu überwachen, um Kalzium Wandler, wie neuronale Calcium-Sensoren, einem Käfig Calciumverbindung, DM-Nitrophen ist auf Foto-Abzug eine schnelle (τ <20 us) Anstieg der freien Kalzium beschäftigt Konzentration und das zugehörige Volumen und Enthalpie Änderungen werden mit photothermischen Strahlablenkung Technik sondiert.

Einleitung

Foto-thermischen Methoden wie photoakustische Kalorimetrie, photothermischen Strahlablenkung (PDB) und transiente Gitter verbunden mit Nanosekunden-Laseranregung stellen eine leistungsstarke Alternative zu optischen Spektroskopie für die zeitaufgelöste Untersuchungen von kurzlebigen Zwischenprodukte ^1,2 vorübergehend. Im Gegensatz zu optischen Techniken, wie transiente Absorption und IR-Spektroskopie, daß der zeitliche Verlauf der Absorptionsänderungen in dem Chromophor Umgebung zu überwachen; photothermische Techniken erfassen die Zeitabhängigkeit der Wärme-/ Volumenänderungen und sind daher wertvolle Werkzeuge für die Untersuchung von Zeitverläufen von optisch "stille" Prozesse. Bisher hat photoakustische Kalorimetrie und vorübergehende Gitter erfolgreich angewendet, um Konformationsdynamik der photoinduzierten Prozesse, einschließlich zweiatomigen Liganden Migration in Globinen ^3,4, Liganden-Interaktionen mit Sauerstoff-Sensor-Protein studieren FixL ^5, Elektronen-und Protonentransport in Häm-Kupfer-Oxidasen ⁶ einnd Photosystem II sowie Foto-Isomerisierung in Rhodopsin ⁷ und Konformationsdynamik von Cryptochrom ^8.

Die Anwendung der photothermischen Verfahren auf biologische Systeme, fehlt eine interne Chromophor und / oder Fluorophor zu erweitern wurde der PBD-Technik unter Verwendung der photoaktivierbaren Verbindung zur Photo zu einem Anstieg der Ligand / Substrat-Konzentration innerhalb von wenigen Mikrosekunden oder schneller kombiniert, je auf dem Käfig Verbindung. Dieser Ansatz ermöglicht die Überwachung von Dynamik und Energetik von strukturellen Veränderungen mit der Ligand / Substrat-Bindung an Proteine, die fehlt, ist eine interne Fluorophor oder Chromophor sind und auf Zeitskala, die nicht von kommerziellen Stop-Flow-Instrumente zugänglich sind verbunden. Hier ist ein Einsatz von PBD die Thermodynamik der Käfigverbindung, Ca ^{2 +} DM-Nitrophen Photospaltung sowie die Kinetik der Ca ^{2 +-Assoziation} mit dem C-terminalen Domäne des neuronalen Kalziumsensor überwachen untenStrom Regulatory Element Antagonist Modulator (DREAM) wird vorgestellt. Die Ca ^{2 +-Foto} veröffentlicht von Ca ^{2 +} DM-Nitrophen innerhalb von 10 Mikrosekunden und erneuten Bindungen zu einer unphotolysed Käfig mit einer Zeitkonstante von ~ 300 us. Auf der anderen Seite, in Gegenwart apoDREAM eine zusätzliche kinetische auf der Millisekunden-Zeitskala auftritt, beobachtet und reflektiert die Ligandenbindung an das Protein. Die Anwendung von PBD zu Konformationsänderungen in biologischen Systemen zu untersuchen wurde irgendwie durch den instrumentalen Schwierigkeiten beschränkt, zB beschwerliche Ausrichtung der Sonde und Pumpstrahl, eine starke und reproduzierbare PBD-Signal zu erreichen. , Eine sorgfältige Gestaltung eines Instrumentenaufbau, eine präzise Steuerung der Temperatur und eine sorgfältige Ausrichtung der Sonde und Pumpstrahl bieten jedoch eine konsistente und robuste PBD-Signal, das die Überwachung der zeitaufgelösten Volumen-und Enthalpie-Änderungen können auf eine breite Zeitskala von 10 Mikrosekunden auf etwa 200 msec. Außerdem modificErwartungen über die experimentellen Verfahren, um die Detektion von Proben-und Referenzspuren unter identischen Temperatur, Pufferzusammensetzung, optische Zelle Orientierung, Laserleistung, usw. gewährleisten die experimentellen Fehler in der gemessenen Reaktionsvolumina und Enthalpien reduziert.

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Protokoll

1. Probenvorbereitungen

1. Führen Sie die Probenvorbereitung und Proben alle Manipulationen in einem dunklen Raum eine unerwünschte Uncaging verhindern.
2. Solubilisierung DM-Nitrophen ((1 - (2-Nitro-4 ,5-dimethoxyphenyl) - N, N, N ', N'-Tetrakis [(oxy-carbonyl)-methyl] -1,2-ethandiamin) in 50 mM HEPES Puffer, 100 mM KCl, pH 7,0, auf eine Endkonzentration von 400 &mgr; m _{(350 nm} ε = 4330 M ^-1 cm ^{-1, 9).}
3. In CaCl ₂ aus dem 0,1 M Stammlösung, um eine gewünschte Verhältnis von [Ca ^{2 +]} zu erreichen: [DM-Nitrophen]. Für Proteine ​​mit _Kd für Ca ^{2 +} Verband mehr als 10 um, das Verhältnis von [Ca ^{2 +]:} ist [DM-Nitrophen] von 1:1 bevorzugt, verhindern die Bindung von Photo freigegeben Ca ^{2 +} zu uncaged DM-Nitrophen . Tatsächlich, unter Berücksichtigung der K _d-Wert für DM-Nitrophen bis 10 nm und die Gesamtkonzentration der DM-Nitrophen und Ca ^{2 +} zu 400 mm betragen, ~ 90% eines Calcium-bindenden ProteinsK _d = 10 &mgr; M wird in der apoform sein. Auf der anderen Seite, für das Studium der Ca ^{2 +-bindende} Proteine ​​mit K _d <10 &mgr; m, ist es bevorzugt, die [Ca ^{2 +] i} zu verringern: [DM-Nitrophen]-Verhältnis 0,95 zu Ca ^{2 +} Komplexierung mit dem verhindert Apo- Protein vor dem Käfig Foto-Dissoziation.
4. Solubilisierung des Referenzverbindung, K ₃ [Fe (III) (CN) _6] oder Na ₂ CrO _4, in dem gleichen Puffer wie für die Probe.

2. Einrichten des Experiment

1. Die grundlegende experimentelle Aufbau ist in Abbildung 2 dargestellt.
2. Verwenden ein Nadelloch (P _2), um den Durchmesser des Sondenstrahls (632 nm Ausgang des He-Ne-Laser, ~ 5 mW Laserleistung) bis 1 mm einzustellen und Propagation der Sondenstrahl durch die Mitte einer Zelle in einem Temperatur platziert kontrollierten Zellhalter mit einem M _ein Spiegel.
3. Verwenden einen Spiegel (M ₂₎ hinter der Probe, um die Sondenstrahlmitteauf ein Zentrum der positionsempfindlichen Detektor.
4. Fokussieren des Sondenstrahls auf die Mitte des Detektors in einer solchen Weise, dass die Differenz in der Spannung zwischen den beiden oberen und unteren zwei Dioden Dioden sowie den Unterschied in der Spannung zwischen den zwei Dioden auf der linken und rechten Seite des Detektors Null.
5. Anschließend Form einen Durchmesser des Pumpstrahls, eine 355 nm Ausgang des Q-switched Nd: YAG-Laser, Halbwertsbreite 5 ns) mit einem 3 mm Lochblende (P ₁₎ zwischen zwei 355 nm Laserspiegeln angeordnet.
6. Copropagate den Pumpstrahl durch das Zentrum der Küvette, wie in Fig. 2 gezeigt. Es ist wichtig, dass beide Laserstrahlen werden durch die Mitte der optischen Zelle in fast kolinearen Weise vermehrt, um eine messbare Ablenkwinkel und damit eine hohe Amplitude der PBD-Signal zu erhalten. Unter Versuchsbedingungen, der Winkel der Schnittpunkt der Sonde und der Pumpstrahlen weniger als 15 °.
7. Verwenden Sie eine Referenzverbindung, um die Sonde und Pumpe ausrichtenStrahls, um ein zufriedenstell PBD Signal zu erreichen, dh einen guten S / N-Verhältnis und stabile PBD Amplitude auf längeren Zeitskalen (~ 100 ms).
8. Einstellen der Position des Pumpstrahls in Bezug auf den Sondenstrahl durch eine schrittweise Einstellung von 355 nm Laserspiegel.
9. Messung der Amplitude des PBD Referenzsignal als eine Differenz zwischen zwei oberen und unteren Photodioden auf dem positionsempfindlichen Detektor. Das PBD Signal sollte eine rasche Zunahme in der Amplitude auf einem schnellen Zeitskala (<10 &mgr; s) aufweisen und bleiben auf 100 ms Zeitrahmen stabil wie in Fig. 3 gezeigt. Der Schuss zu Schuss Variabilität des HVE Amplitude innerhalb von 5% der Signalamplitude und der Signal Reproduzierbarkeit wird hauptsächlich durch Schwingungen beeinflusst.
10. Überprüfen Sie die Linearität in der PBD Signalamplitude in Bezug auf die Freigabe von Wärmeenergie durch Messen der linearen Abhängigkeit der PBD-Signal von der Anregungslaserleistung und der Anzahl von Einst absorbiert, E _a= (1-10 ^A), wobei A dem Referenz Absorption bei der Anregungswellenlänge.
11. Halten der Laserleistung unter etwa 1,000 &mgr; J und Absorption der Probe / Referenzverbindung bei der Anregungswellenlänge von weniger als 0,5 auf Mehrphotonenabsorption und Verringerung der Pumpstrahlleistung bzw. zu verhindern und sicherzustellen, Linearität der PBD-Signal.

3. PBD Messungen

1. Beginnen Sie mit der Messung der PBD Spuren für den Hinweis. Legen Sie die Lösung der Referenzverbindung in einem 1,0 cm x 1,0 cm oder 1,0 cm x 0,5 cm Quarzzelle und die Position der Zelle in der Temperatur gesteuert Halter. Beide Weglängen vergleichbare PBD Amplitude.
2. Erfassen die PBD Referenzsignals als eine Funktion der Temperatur in dem Temperaturbereich von 16 bis 35 ° C mit der Temperaturerhöhung von 3 ° C
3. Bei jeder Temperaturänderung, überprüfen Sie die Position der Sonde Strahl auf dem positionsempfindlichen Detektor und neuEinstellen der Position in der Mitte des Detektors, wenn nötig.
4. Überprüfen Sie die Linearität des PBD Signal als Funktion der [(dn / dt) / C _p ρ] Begriff gemäß Gleichung 2.
5. Platzieren der Probenlösung in der gleichen optischen Zelle für die Referenzverbindung halten die gleiche Orientierung der optischen Zelle für die Referenzmessung.
6. Erkennen Sie die Beispiel PBD Spuren im gleichen Temperaturbereich wie für die Referenz und überprüfen Sie die Linearität der Probe PBD Amplitude in Bezug auf den [(dn / dt) / C _p ρ] Begriff.

4. Datenanalyse

Die Größe der Auslenkung direkt proportional zum Volumenänderung aufgrund der Erwärmung der Probe (&Dgr; V _th) und nicht-thermische Volumenänderung (&Dgr; V _nonth) gemäß Gleichung 1:

Die Amplitude der Probe (A _S) Und Referenz-(A _r) PBD-Signal kann unter Verwendung der Gleichungen 2 bzw. 3 beschrieben.

PBD-Signal ist direkt proportional zu der Instrumentenantwortparameter (K) und die Anzahl der Einst absorbiert (E _a). Der erste Term in Gleichung 2 (dn / dt) (1/ρC _p) Q, entspricht der Signaländerung aufgrund der Wärme zu dem Lösungsmittel befreit. Die dn / dt Term stellt die temperaturabhängige Änderung des Brechungsindex, ist ρ die Dichte des Lösungsmittels ist, C _p die Wärmekapazität. Alle Parameter werden für das destillierte Wasser bekannt und kann für eine Pufferlösung, indem eine PBD Signal für die Referenzverbindung in destilliertem Wasser und in einem geeigneten Puffer bestimmt. Q die Wärmemenge returned zu dem Lösungsmittel. Die ρ (dn / d ρ) Begriff ist eine Einheit lose Konstante, die temperaturunabhängig ist im Temperaturbereich von 10-40 ° C ^10. &Dgr; N _abs Term entspricht der Änderung des Brechungsindex aufgrund der Anwesenheit von absorbierenden Spezies in der Lösung, und es ist unerheblich, ob die Wellenlänge des Meßstrahls relativ zu den Absorptionsspektren jeder Spezies in der Lösung verschoben ist. Das Signal aus der Vergleichsverbindung (A _r) wird durch Gleichung 3 wobei E _{h ν} ist die Photonenenergie bei der Anregungswellenlänge, ausgedrückt E _{h ν} = 80,5 kcal / mol für 355 nm-Anregung.

1. Nehmen Sie die Amplitude des Referenzsignals PBD als die Differenz zwischen dem Pre-Trigger-und Post-Trigger-PBD-Signal wie in Abbildung 3 gezeigt. In ähnlicher Weise, bestimmen die Amplitude der schnellen (A _s ^schnell) und langsamen Phase (A _s ^langsam) Der Probe PBD-Signal.
2. Um die Antwortparameter Instrument, K eliminieren, skaliert die Amplitude der Probe PBD Signal mit der Amplitude des PBD-Signal für den Referenz. Das Verhältnis des Probensignals mit dem Referenzsignal ergibt Gleichung 4 und kann geschrieben werden als:
   
   
3. Unter Verwendung dieser Gleichung bestimmen die Wärme an die Lösung (Q) und nicht-thermischen Volumenänderung (AV _nonth) mit einem Foto-initiierte Reaktion von der Steigung und Achsenabschnitt jeweils von einem Grundstück von [assoziiert (A _s / A _r) E veröffentlicht _{h ν]} tige Abhängigkeit von der Temperatur abhängige Term [(dn / dt) (1/ρCp)].
4. Zur Bestimmung des Reaktionsvolumens und Enthalpieänderung für die schnelle und die langsame Verfahren skalieren Beobachtungsvolumen und Enthalpieänderung dem entsprechenden Quantenausbeute nach den Gleichungen 5-7.
   
   
   
   
   
   
   Für einen mehrstufigen Prozeß mit Kinetik auf der Zeitskala zwischen 10 usec ~ 200 ms auftritt, kann das Volumen und die Enthalpie Veränderungen bei den einzelnen Reaktionsschritten zugeordnet ermittelt werden. Die Amplituden und Laufzeiten der einzelnen Schritte werden durch Anpassung der Daten an die Funktion F (t), die den zeitlichen Verlauf des Volumenänderungen und Enthalpie beschreibt, analysiert.
   
   wobei α ₀ der A _s ^schnell und α _i entspricht einem _s ^langsam für jeden einzelnen Prozess und τ _i ist die Lebensdauer der einzelnen Reaktionsschritte. Aus der Temperaturabhängigkeit der Geschwindigkeitskonstante for einzelne Prozesse (k _i = 1 / τ _i) die Aktivierung und-entropie Parameter können leicht unter Verwendung Eyring-Plots.

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Ergebnisse

Ein repräsentatives Beispiel für PBD Spuren für Ca ^{2 +} Foto-Freisetzung aus Ca ^{2 +} DM-Nitrophen ist in Abbildung 3 dargestellt. Die schnelle Phase entspricht der Photospaltung von Ca ^{2 +} DM-Nitrophen und Ca ^{2 +-Freisetzung,} während die langsame Phase reflektiert Ca ^{2 +-Bindung} an den nonphotolysed Käfig. Die Handlung der Probe PBD Amplitude für die auf die Amplitude der Referenzverbindung als Funktion der Temperatur abhängig Faktor [C _p<...

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Diskussion

Das physikalische Prinzip hinter photothermischen Verfahren ist, dass ein Foto-angeregten Molekül leitet überschüssige Energie über Schwingungsrelaxation in den Grundzustand, was zu einer thermischen Erwärmung des umgebenden Lösungsmittel ^1,12. Für Lösungsmittel, wie Wasser, ergibt sich eine schnelle Volumenexpansion (&Dgr; V _th). Excited-State-Moleküle können auch photochemische Prozesse, die in nicht-thermische Volumenänderungen (AV _nonth) führen durch Bindungsspaltung ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N',N'-Tetraacetic Acid	Life Technologies	D-6814	DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid)	Sigma Adrich	0909C	HEPES buffer
Potassium ferricyanide (III)	Sigma Aldrich	702587	reference compound for PBD measurements
Sodium chromate	Sigma Aldrich	307831	reference compound for PBD measurements
He-Ne Laser Diode 5 mW 635 nm	Edmund Optics	54-179	use as a probe beam for PBD measurements
Oscilloscope,	LeCroy	Wave Surfer 42Xs	400 MHz bandwith
Nd:YAG laser	Continuum	ML II	pump beam for PBD measurements
M355; Nd:YAG laser mirror	Edmund Optics	47-324	laser mirror for 355 nm laser line
M1 and M2; Laser diode mirror	Edmund Optics	43-532	visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm
P1 and P2; Iris Diaphragm	Edmund Optics	62-649	pin hole to shape the probe and pum beams
L1; bi-convex lens	Thorlabs	LB1844	a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350-2,000 nm
DM, dichroic mirror	Thorlabs	DMLP505	a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm
F1; Edge filter	Andower	500FH90-25	a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm
Temperature-controlled cuvette holder	Quantum Northwest	FLASH 300