VIGS-vermittelte Stürmer Genetics Screening zur Identifizierung von Genen in Nichtwirtresistenz Beteiligte

Zusammenfassung

Virus-induzierte Gen-Silencing ist ein nützliches Instrument zur Identifizierung von Genen in Nichtwirtresistenz von Pflanzen beteiligt. Wir demonstrieren die Verwendung von bakteriellen Erregern exprimieren GFPuv identifizieren Gen stumm Pflanzen anfällig Nichtwirt Krankheitserreger. Dieser Ansatz ist einfach, schnell und erleichtert groß angelegte Screening und ähnliches Protokoll zu studieren verschiedene andere Pflanzen-Mikroben-Interaktionen angewendet werden kann.

Zusammenfassung

Nichtwirt Krankheitsresistenz von Pflanzen gegen bakterielle Erreger wird durch komplexe Verteidigung Bahnen gesteuert. Das Verständnis dieses Mechanismus ist für die Entwicklung von dauerhaften Krankheit-resistente Pflanzen gegen breites Spektrum von Krankheitserregern wichtig. Virus-induzierte Gen-Silencing (VIGS)-basierte Screening vorwärts Genetik ist ein sinnvoller Ansatz zur Identifizierung von pflanzlichen Abwehr Gene verleihen Nichtwirtresistenz. Tobacco Rattle Virus (TRV)-basierte VIGS Vektor ist die effizienteste VIGS Vektor aktuell und wurde effizient genutzt auf endogene Zielgene in Nicotiana benthamiana Schweigen zu bringen.

In diesem Manuskript, zeigen wir eine vorausschauende Genetik Screening-Ansatz zum Schweigen einzelner Klone aus einer cDNA-Bibliothek in N. benthamiana und Bewertung der Reaktion Gen zum Schweigen Pflanzen für kompromittiert Nichtwirtresistenz gegen Nichtwirt Krankheitserreger Pseudomonas syringae pv. tomato T1, P. syringae pv. glycinea und X. campestris pv. vesicatoria. Diese bakterielle Pathogene sind ausdrücklich GFPuv Protein entwickelt und ihre grün fluoreszierende Kolonien können mit bloßem Auge unter UV-Licht in den Nichtwirt Pathogen inokulierten Pflanzen gesehen werden, wenn das Schweigen Zielgens in der Vermittlung Nichtwirtresistenz beteiligt ist. Dies erleichtert zuverlässigere und schnellere Identifizierung von Gen-Pflanzen anfällig für Schweigen Nichtwirt Krankheitserreger. Ferner kann aussichtsreicher Kandidat Gen-Informationen durch Sequenzierung der Anlage Geninsert in TRV Vektor bekannt sein. Hier zeigen wir die hohen Durchsatz Fähigkeit VIGS-vermittelte vorwärts Genetik, um Gene in Nichtwirtresistenz beteiligt sind. Etwa kann 100 cDNAs einzeln in etwa zwei bis drei Wochen und ihre Relevanz in Nichtwirtresistenz gegen mehrere bakterielle Erreger Nichtwirt zum Schweigen gebracht werden kann in einer Woche danach untersucht werden. In diesem Manuskript, aufzuzählen wir die einzelnen Schritte in diesem Screening beteiligt. VIGS-vermittelte vorwärts Genetik screening Ansatz kann nicht nur zur Identifizierung von Genen in Nichtwirtresistenz beteiligt, sondern auch auf das Studium Gene verleihen mehreren biotischen und abiotischen Stress Toleranzen in verschiedenen Pflanzenarten verlängert werden.

Einleitung

Nichtwirtresistenz ist der Widerstand aller Pflanzenarten gegen Rassen eines bestimmten Erregers ^1,2. Dies verleiht breites Spektrum und dauerhafte Resistenz gegen Krankheiten bei Pflanzen ^2,3. Allerdings ist der Mechanismus, insbesondere gegen bakterielle Krankheitserreger, nicht gut ⁴ verstanden. Screening nach Mutanten oder Pflanzen, die zum Schweigen gebracht Kompromiss Nichtwirtresistenz und hohen Durchsatz Transkript-Profiling zur Identifizierung differentiell exprimierter Gene während Nichtwirtresistenz ^5-9 zwei wichtige Ansätze zuvor zum Präparieren bakterielle Nichtwirtresistenz verwendet werden. Weil Nichtwirtresistenz durch einen komplexen Mechanismus (s) ⁴ mit der Beteiligung vieler Gene, einen hohen Durchsatz funktionellen Genomik für die Gen-Identifizierung gesteuert wird, ist entscheidend für ein besseres Verständnis der Nichtwirtresistenz Mechanismus (n).

Virus-induzierte Gen-Silencing (VIGS) wurde erfolgreich eingesetzt, um endogenen pflanzlichen SchweigenGene in vielen Pflanzenarten ^10,11. Nicotiana benthamiana ist eines der am besten geeigneten Pflanzen für VIGS ^10,12 und ihren Entwurf Genomsequenz ist jetzt ^13. Tobacco Rattle Virus (TRV)-basierte VIGS wurde weithin als reverse genetics Werkzeug um Gene in Nichtwirtresistenz ^2,4,14 beteiligt zu charakterisieren. Diese VIGS Vektoren und Derivate sind jetzt durch Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC, verfügbar http://www.arabidopsis.org/abrc/catalog/individ_cloned_gene_1.html ). VIGS auch als Vorwärts Genetik Werkzeug zur Identifizierung von Genen in Pflanzenzellen Immunität ^15-17, insbesondere Nichtwirtresistenz ^6,18 beteiligt verwendet. Beurteilung überempfindlich Reaktion (HR)-vermittelten Zelltod von Pflanzen gegen ein bestimmtes Pathogen Nichtwirt induziert und die Beurteilung der Krankheit induzierten Zelltod sind zwei wichtige Tests vor allem für identifyin verwendetg anfällig Gen zum Schweigen Pflanzen. Allerdings HR Zelltod werden nur gegen Typ-II Nichtwirt Erreger induziert und nicht gegen die Typ-I Nichtwirt Krankheitserreger ^2. Daher können HR-Assays nicht universell verwendet werden, um Nichtwirtresistenz Strategien der Pflanzen zu identifizieren, vor allem gegen breite Palette von Typ-I Nichtwirt Krankheitserreger. Auch dann, wenn teilweisen Verlust Nichtwirtresistenz in einem Gen zum Schweigen Anlage nicht immer Krankheitssymptome ⁶ und damit Krankheit Scoring nicht zur Identifizierung von Pflanzen beeinträchtigen Nichtwirtresistenz verwendet werden kann führen. Im Gegenteil, der Bewertung des Wachstums von Pathogenen Nichtwirt im Gen stumm Pflanzen ein besseres Verfahren zur Untersuchung der Verlust Nichtwirtresistenz in Gen stumm Pflanzen.

Im Vergleich zu herkömmlichen Wachstumstest ^6,19, eine schnellere Methode zur Beurteilung Nichtwirt Bakterienwachstum auf den Gen zum Schweigen Pflanzen können die Zeit verkürzen, für Vorwärts-Genetik Screening erforderlich. Wir bereits berichtet, ein Verfahren zur Beobachtung Bakterienl Wachstum des Pathogens auf Blättern mit dem bloßen Auge unter ultraviolettem (UV) Licht unter Verwendung von Bakterien, die grün fluoreszierendes Protein (GFP) ^19. In diesem Manuskript wir demonstrieren die Nützlichkeit der GFPuv Ausdruck Nichtwirt bakteriellen Erregern für eine einfache Identifizierung von Gen-Pflanzen, die zum Schweigen gebracht für Nichtwirtresistenz gefährdet sind. Diese Methodik ist genau für die Identifizierung von anfälligen Pflanzen und zugänglich für das Hochdurchsatz-Screening.

Protokoll

1. Plant Growth and Target Gene Silencing

1. Pflanzenwachstum Bedingungen:
   1. Sow N. benthamiana Samen auf erdlosen Blumenerde Mischung, Metro-Mix 350 und keimen die Samen in einer Klimakammer. Jede andere Boden-oder Boden-less Medium kann auch anstelle von Metro-Mix verwendet werden.
   2. Transplant drei Wochen alte Sämlinge in einzelne Töpfe und wachsen sie in einem Gewächshaus bei 21 ± 2 ° C zusammen mit anderen Wachstumsbedingungen wie in früheren Literatur ^12. Zwei bis drei Tage nach dem Umpflanzen, können Pflanzen für TRV Impfung verwendet werden.
2. Wachsende TRV2 Klone:
   TRV ist eine zweigeteilte Virus und seine Genom besteht aus RNA1 und RNA2. RNA1 kodiert für eine RNA-abhängige RNA-Polymerase und eine Bewegung Protein ^20,21. RNA2 codiert für ein Hüllprotein (CP) und zwei nicht-strukturellen Proteine ​​von den subgenomischen RNAs ^21. Sowohl RNA1 und RNA2 sind für die Bildung von reifen vir erforderlichuns Partikel und ihre Ausbreitung ^20,21. cDNA-Bibliothek Bau in TRV2 Vektor wird in bisherigen Literatur beschrieben ^22,23. Kurz gesagt, wurde VIGS Bibliothek in dieser Studie verwendet der RNA aus Blattgewebe ausgesetzt verschiedenen biotischen und abiotischen Auslöser extrahiert aufgebaut.
   1. Nehmen Sie Agrobacterium (Stamm GV2260), die die cDNA-Klone in TRV2 Vektor (a 96-Well-Platte) aus dem Gefrierschrank. Allmählich tauen sie und nach die Kulturen Raumtemperatur kommen, impfen die einzelnen Agrobacterium Kultur auf Luria-Bertani (LB)-Agar-Platte mit Rifampicin (10 ug / ml) und Kanamycin (50 ug / ml) mit einem 96-Pin-Replikator.
   2. Die Inkubation bei 28 ° C für zwei Tage. Wir wachsen in der Regel vier Kolonien Replikat für jeden Klon so dass eine ausreichende Agrobacterium Inokulum ist für Prick Impfung von zwei Pflanzen. Führen Sie alle Schritte unter sterilen Bedingungen.
3. VIGS:
   1. WachsenAgrobacterium (GV2260) tragenden TRV1 bei 28 ° C in LB-Flüssigmedium mit Antibiotika erwähnt. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation aus über Nacht gewachsenen Kulturen, in der Impfung Puffer resuspendieren (10 mM MES, pH 5,5, 200 pM Acetosyringon) und Inkubation für 3 Stunden bei Raumtemperatur auf einem Schüttler bei 50 Umdrehungen pro Minute.
   2. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation und in 5 mM MES-Puffer (pH 5,5) und impfen (OD ₆₀₀ = 0,3) resuspendieren in abaxial Seite 3-4 N. benthamiana Blätter mit einer Spritze ohne Nadel. Detaillierte Impfung Vorgehensweise ist in bisherigen Literatur ²⁴ demonstriert. Später, auf dem Gelände des TRV1 Impfung impfen jeweiligen TRV2 Kolonien durch Einstechen die Blätter mit einem Zahnstocher.
   3. Pflegen Sie die Pflanzen mit einer angemessenen Ernährung als kräftiges Wachstum ist für eine effiziente VIGS ¹² wichtig. Etwa zwei Wochen nach der Impfung wurden die Transkripte von gezielten Gene beginnt zu reduzieren und die Pflanzen sind bereit für Erreger inokordnung drei Wochen nach der Impfung TRV.

2. Vorbereitung der Kulturen Nichtwirt Pathogen und Pflanze Impfung

1. Details von Pathogenen in dieser Studie verwendet:
   Pseudomonas syringae pv. Tabaci, P. syringae pv. tomato T1, P. syringae pv. glycinea und Xanthomonas campestris pv. vesicatoria werden in dieser Studie verwendet. Wachsen P. syringae Stämmen in Königs B (KB) flüssigen Medium mit Rifampicin (10 ug / ml), Kanamycin (50 ug / ml) bei 28 ° C für 12 h ergänzt. Wachsen X. campestris pv. vesicatoria in LB-Flüssigmedium für 16 Stunden. Alle Krankheitserreger beherbergen, die ein Plasmid GFPuv ausdrücken können wie in den vergangenen ¹⁹ Literatur beschrieben.
2. Vorbereitung der Kulturen Erreger für Pflanze Impfung:
   1. Ernte Bakterienzellen durch Zentrifugation und bestätigen das Vorhandensein der grünen Fluoreszenz mit langen wavelength UV-Lampe in der Dunkelheit. Die Zellen werden zweimal mit sterilem Wasser und Resuspendieren sie auf die gewünschte Konzentration unter Verwendung von sterilem Wasser.
   2. Impfen die jeweiligen Erreger (s) auf abaxial Seite des Zielgens Schweigen Blätter ^(5. bis ^8.) als Punkte (ca. 1,5 cm Durchmesser). Mehrere Nichtwirt Krankheitserreger können gleichzeitig für ihr Wachstum in den Ziel-Gen zum Schweigen Pflanzen getestet werden. Gleichzeitig inokulieren Wirt-Pathogen wie dies als eine positive Kontrolle für die Anzeige in planta Bakterienwachstum verwendet werden können. Auch impfen Vektor-Kontrolle (TRV :: 00) Pflanzen.

3. Beobachtung der in planta Wachstum von bakteriellen Erregern

1. Freilegen beimpften Blättern zu einem langwelligem UV-Licht in der Dunkelheit. Bakterienkolonien können als grün fluoreszierende Punkte im abaxial Seite des Blattes in den Hintergrund der roten Fluoreszenz durch Blattoberfläche emittiert eingesehen werden.
2. Beachten Wachstum des Pathogensab 2 Tage nach der Inokulation (dpi) bis 5 dpi. Everyday Beobachtung während dieser Zeitspanne ist notwendig.
3. Nachdem der erste Bildschirm, kurze Liste der Klone, deren Ergebnisse in Silencing Wachstum von einem oder mehreren Nichtwirt Erreger (s).
4. Wiederholen VIGS für die ausgewählten Klone und wieder testen Sie die Reaktion von Gen-Pflanzen zu Schweigen Nichtwirt Erreger (s). Diese zweite Ebene des Screenings wird getan, um die Fehlalarme im ersten Bildschirm erhalten zu entfernen.

4. Bestätigung der Shortlist für Pflanzen Compromised Nichtwirtresistenz

1. Bringt das cDNA-Klone aus dem Bildschirm wie oben beschrieben gewählt. Inokulieren die gesamte Anlage mit Nichtwirt Erreger (en) durch Eintauchen der Pflanzen mit jeweiligen Erregerkulturen mit 0,01% (v / v) Silwet L-77 und Unterziehen der eingetauchten Pflanzen für 3 Vakuum - 5 min. Quantifizieren des Bakterienwachstums durch herkömmliche Wachstumsassay ^6,18,19 wie unten beschrieben.
2. Bei 0 h nach Inokulation (hpi),3 und 5 dpi dpi, sammeln zwei Blatt Proben von fünf biologischen Wiederholungen für jede Nichtwirt Erreger (s) geimpft Blätter mit einem Blatt Stempel (0,5 cm ^2). Grind die Blattproben, serielle Verdünnung und Platte der Saft auf KB-Agar-Medium mit entsprechenden Antibiotika und Inkubation bei 28 ° C für 2 Tage ergänzt. Zählen Sie die Bakterienkolonien mit einer Kolonie Zähler und berechnen die das Wachstum von Bakterien in den Blättern wie in früheren Literatur ⁶ beschrieben.
3. Pflanzen anfällig für Nichtwirt Erreger (s) sollten zeigen höhere Anzahl von Pathogen Wachstum im Vergleich zu Vektor-Kontrolle.

5. Die Sequenzierung der Insert und Identifizierung von Ziel-Gene

1. Führen Kolonie-PCR für das ausgewählte Klon mit attB1 und attB2 Primer oder Verwendung der Primer flankieren die Klonierungsstelle im Vektor TRV2. Führen Sie das PCR-Produkt auf dem Gel und prüfen für die Amplifikation der einzigen Band.
2. Pflanzengenexpression Einsatzes in der TRV2 Vektor kann sequenziert werden mit attBPrimer oder Primer flankieren Klonierungsstelle.
3. Führen Sie mit dem BLAST-Sequenz und Identifizierung der Gen Details.
4. Erhalten Gensequenz voller Länge zusammen mit den un-translatierten Regionen (UTRs).
5. Wählen 300-400 bp-Fragmente aus drei verschiedenen Bereichen der Sequenz und klonen in TRV2 Vektor. Unabhängig durchführen VIGS mit allen drei VIGS Konstrukte und bestätigen den Kompromiss von Nichtwirtresistenz in allen drei Gen zum Schweigen Pflanzen.

Ergebnisse

Hauptziel dieser Studie ist es, ein Verfahren zur einfachen und genauen Identifizierung von Gen zum Schweigen N. demonstrieren benthamiana Pflanzen, die für Nichtwirtresistenz gefährdet sind. Es gibt vier große Schritte in diese Methodik. Erster Schritt ist einzeln Schweigen Vielzahl von Genen mit TRV-VIGS. Wir hatten Schweigen etwa 5000 Gene ^6,18 über einen Zeitraum von ca. 1,5 Jahre unter Verwendung des Protokolls in Abbildung 1 dargestellt. Einige der Gen zum Schweige...

Diskussion

Pflanze Immunität begrenzt das Wachstum von Krankheitserregern Nichtwirt und daher wenig oder gar keine grüne Fluoreszenz von Vektor-Kontrolle Anlage emittiert verlässt geimpft mit Nichtwirt Erreger unter langwelligen UV-Licht (3D). Allerdings, wenn ein Gen in Nichtwirtresistenz beteiligt Schweigen gebracht wird, bevorzugen die Gen-Pflanzen Schweigen das Wachstum der Erreger Nichtwirt und grüne Fluoreszenz zu sehen ist (Abbildung 3E). Dies ist das Grundprinzip des Verfahrens in dies...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well U-bottom plates	Becton Dickinson Labware (Franklin Lakes, NJ, USA)	35-3077
96-pin replicator stainless steel	Nalge Nunc International (Naperville, IL, USA)	250520
High Intensity UV Inspection Lamps, Model B-100ap	Thomas scientific (Swedesboro, NJ, USA)	6283K50	Manufacturer ID 95-0127-01
Stuart SC6 colony counter	Bibby Scientific Limited, Staffordshire, UK	SC6PLUS
Soil-less potting mixture, Metro-Mix 350	SUNGRO Horticulture Distribution, Inc., (Bellevue, WA, USA)
Primers: attB1 (GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT) attB2 (GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT)	Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville, IA, USA)	Custom synthesized
MES, Monohydrate	VWR international (Radnor, PA, USA)	CAS No. 145224-94-8
Acetosyringone (Dimethoxy-4’-hydroxyacetophenone)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D134406
Vac-In-Stuff (Silwet L-77)	Lehle Seeds (Round Rock, TX, USA)	VIS-30