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In diesem Artikel

  • Erratum Notice
  • Zusammenfassung
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  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Erratum
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Erratum Notice

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Zusammenfassung

Listeria monocytogenes ist ein Gram-positiven bakteriellen Erreger häufig als ein Hauptmodell für die Untersuchung der intrazellulären Parasitismus verwendet. Imaging späten L. monocytogenes-Infektion Stufen im Rahmen der kleinen interferierenden RNA Bildschirme ermöglicht die globale Untersuchung von zellulären Wege für die bakterielle Infektion von Zielwirtszellen erforderlich.

Zusammenfassung

Bakterienintrazelluläre Pathogene können als molekulare Werkzeuge zur zellulären Signalkaskaden auf Grund ihrer Fähigkeit, vorzüglich zu manipulieren und zu untergraben Zellfunktionen, die für die Infektion von Wirtszielgewebe erforderlich sezieren konzipiert werden. Unter diesen bakteriellen Erreger ist Listeria monocytogenes eine Gram-positiven Mikroorganismus, der als Paradigma für den intrazellulären Parasitismus in der Charakterisierung der zellulären Immunantworten verwendet wurde, und die instrumentelle Rolle in der Entdeckung der molekularen Signalwege steuern Zytoskelett-und Membrantransport Dynamik gespielt hat. In diesem Artikel beschreiben wir einen robusten mikroskopischen Assay zum Nachweis von zellulären Infektion späten Stadien von L. monocytogenes auf der Basis der Fluoreszenzmarkierung InlC, eine sekretierte bakterielle Protein, das im Cytoplasma von infizierten Zellen akkumuliert, dieser Assay für automatisierte Hochdurchsatz-small interfering RNA-Bildschirme, um char gekoppelt werdenacterize zelluläre Signalwege in der Auf-oder Abwärtsregulierung der Infektion beteiligt.

Einleitung

Die Gram-positiven Bakterium Listeria monocytogenes ist ein Lebensmittel übertragbaren Krankheitserreger, der Wirtszellen eindringt, stört seine Internalisierung Vakuole und repliziert im Zytoplasma der Wirtszellen ein. L. monocytogenes Leichtigkeit der Manipulation im Labor Kontext (schnelles Wachstum, geringe Toxizität für gesunde Personen) mit dem Fortbestehen der in Zell-und Tiermodellen beobachtet bakteriellen Virulenz assoziiert (hämolytische Aktivität, Leukozytose) erlaubt seinen ersten Einsatz in den 1960er Jahren als Hauptmodell für die Untersuchung der intrazellulären Parasitismus und für die Errichtung der theoretischen Grundlagen der zellulären Immunität gegen eine Infektion 2. In den späten 1980er und frühen 1990er Jahren, die Präparation der bakteriellen intrazellulären Zyklus 3 sowie die molekulare Charakterisierung der wichtigsten bakteriellen Virulenzfaktoren 4-7 begünstigt die Verwendung von L. monocytogenes als Schlüssel molekulares Werkzeug für die Manipulation und Gestüty von Wirtszellfunktionen. Die Anwesenheit von avirulenten (L. innocua) und virulent (L. monocytogenes) Arten in der Gattung Listeria ebnete den Weg für die vergleichende Genomstudien 8, die zusammen mit der jüngsten Gründung der komplette L. monocytogenes Transkriptom 9, haben unser Verständnis der Evolution von L. erhöht monocytogenes als menschliche Krankheitserreger und als Modellsystem für die Infektion untersucht 10.

L. monocytogenes induziert seine Internalisierung in Wirtszellen bei Wechselwirkung der bakteriellen Oberflächenproteinen InlA und InlB mit ihren Wirtszellrezeptoren E-Cadherin und Met, jeweils 11-12. Anfängliche Kandidat-basierten Untersuchungen führten zur Identifizierung der α / β-Actin Cateninen Verbindung als wesentliche Komponente der InlA-Invasion Kanal 13 und der Phosphoinositid-3-Kinase (PI3-K) als kritischer Effektor des InlB- abhängig Invasion cascade 14-15. Proteom-und Funktionsbasierte Assays anschließend erlaubt die Identifizierung neuer Zytoskelett-Elemente 16 und Lipid-Second Messenger 17 für Wirtszellinvasion erforderlich. Transkriptions-Studien 18 und Massenspektrometrie-basierte quantitative Proteomik 19 haben vor kurzem ein neues Licht über die Aktivierung von Signalkaskaden und Gastgeber der Unterdrückung von Immunreaktionen während L. monocytogenes-Infektion. Auf der Grundlage der Inaktivierung von großen Gruppen von Genen (kinomes, komplette Genome) von small interfering RNA Systembiologie (siRNA) Silencing haben vor kurzem neue Wege für die Analyse der globalen Wirt-Signalkaskaden im Kontext der spezifischen zellulären Funktionen, einschließlich Phagozytose geöffnet und Erreger Internalisierung 20. Genomweite siRNA-Bildschirme haben bereits durchgeführt worden, um zelluläre Kaskaden zur Infektion von L. erforderlich untersuchen monocytogenes in phagocytic Drosophila S2-Zellen 21-22, doch diese Art der Analyse nicht in nicht-phagozytische Zellen durchgeführt wurde, die kritische Ziele für die Infektion in vivo darstellen.

Wir haben ein Protokoll für die mikroskopische Detektion der späten Stadien der Infektion durch L. optimiert monocytogenes, die für die Hochdurchsatz-siRNA-Studien von Bakterieneintrag in Epithelzellen geeignet ist. Unser Assay nutzt ein hochinvasiven L. monocytogenes-Stamm, der eine Punktmutation in PrfA, der Haupttranskriptionsregulator von L. präsentiert monocytogenes Virulenzfaktoren 6: diese Mutation (benannt PrfA *) macht PrfA konstitutiv aktiven 23 und führt zu einer erhöhten Expression der Proteine ​​Invasion InlA und InlB daher begünstigt bakterielle Eintrag in sonst schlecht nicht-infizierten Fresszellen. Unsere Auslese zur Infektion beruht auf dem Nachweis der Akkumulation des cytosolischen sezernierte bakterielle Protein InlC zugrunde: dieses Molekül isteine pleiotrope Effektor, der vorzugsweise durch intrazytoplasmatische L. exprimiert wird monocytogenes 9 und welche nimmt nicht nur in der bakteriellen Zelle-zu-Zelle verteilt 24 aber auch Wirtsimmunantwort moduliert 25. Die Fluoreszenzmarkierung InlC Sekretion von intrazellulären Bakterien ermöglicht nicht nur eine klare Unterscheidung infizierter von nicht-infizierten Zellen, sondern stellt auch eine Endpunktanzeige, die verwendet werden kann, um anschließend zu sezieren Infektion in verschiedenen Schritten: Eingabe vakuolären Flucht cytosolischen Bakterien Proliferation und Zell-zu-Zell-Ausbreitung. Dieses Mikroskopie-basiertes Protokoll kann siRNA Bildschirme gekoppelt werden daher zelluläre Signalwege bei der Infektion von Wirtszellen von L. beteiligt studieren monocytogenes.

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Protokoll

1. Herstellung von Zell-und Bakterienkulturen, Transfektion Werkzeuge und Primäre Antikörper

  1. Eine frische Agar-Platte, einzelne L. isolieren monocytogenes Kolonien aus einer bakteriellen Glycerin Lager (50% glycerol/50% gesättigte Flüssigkeit Bakterienübernachtkultur), der bei -80 ° C
    1. Mit einem Aluminiumgestell (bei -80 ° C gehalten), um eine gefrorene Bakterien Glycerin Lager, Streifen Bakterien auf einer Hirn-Herz-Infusion (BHI)-Agar-Platte zu transportieren.
    2. Die Platte bei 37 ° C während 48 Stunden (oder bis einzelne Bakterienkolonien isoliert werden kann).
    3. Bewahren Sie diese Arbeitsplatte danach bei 4 ° C während einer Zeit von maximal 1 Monat (es wird verwendet, um Flüssigkulturen zu impfen).
    4. In unserem Protokoll, verwenden wir die L. monocytogenes-Serotyp 1/2a EGDe.PrfA * Stamm, aber wie in Fig. 1, die veranschaulicht L. monocytogenes Serotyp 4b P14.PrfA * Belastung führt zu ähnlichen Ergebnissen.
  2. ErLa ATCC CCL2 Zellen werden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) in Abwesenheit von Antibiotika, gezüchtet.
  3. Unabhängige Pools von verschlüsselten (Kontrolle) und Anti-Met siRNAs sind in schwarz 384er-Mikroskopie Zellkulturplatten geladen.
    1. Verdünnen Sie 160 pmol siRNA in 500 ul RNase-freies Wasser und mit 5 ul dieser Lösung pro Well (Endkonzentration: 1,6 pmol).
    2. Bewahren Sie diese Platte bei -20 ° C für einen Zeitraum von 1 Jahr.
  4. Polyklonalen Kaninchen-Antikörper gegen das bakterielle Protein InlC mit einem InlC-GST rekombinantes Protein, wie zuvor beschrieben, 25 durch Immunisierung gewonnen wurden.

2. Reverse-siRNA Zelltransfektion

  1. 72 Stunden vor der Infektion auf Raumtemperatur bringen eine schwarze 384-Well-Mikroskopie Zellkulturplatte, die 1,6 pmol siRNA in 5 ul RNase-freies Wasser in jede Vertiefung.
  2. Zentrifugieren Sie die Platte für 3 min bei 300RCF bei Raumtemperatur bis siRNA, die in den Wänden der Vertiefungen abgelagert worden sein könnte senken.
  3. Bereiten Raumtemperatur DMEM mit 0,4% Lipofectamine RNAiMAX ergänzt.
  4. In 25 ul des DMEM / RNAiMAX Transfektionsmediums in jede Vertiefung (nicht die Transfektion Medium länger als 20 min inkubiert, bevor es an die siRNA).
  5. Bewegen Sie die Platte hin und her, um die siRNA-Transfektion mit der Lösung zu mischen, dann halten Sie die Platte für 1 h bei Raumtemperatur zu ermöglichen siRNA-Lipofectamin-Komplexe zu bilden.
  6. Wasch HeLa-Zellen aus einem konfluenten oder subkonfluenten Zellkulturflasche einmal mit 10 ml 37 ° C vorgewärmtes PBS.
  7. Lösen HeLa-Zellen durch Zugabe von 1 ml 37 ° C vorgewärmt Trypsin zu dem Zellkulturkolben und Inkubation für 3 bis 5 min bei 37 ° C.
  8. Re-suspend-Zellen in 10 ml 37 ° C vorgewärmten DMEM mit 16% FBS.
  9. Zählen von Zellen und bereiten eine Zellsuspension von 12.000 Zellen pro ml in DMEM, ergänzt mit16% FBS.
  10. Dann werden 50 ul der Zellsuspension in jede Vertiefung in der 384-Well-Platte.
  11. Bewegen Sie die Platte schnell hin und her, um Zellen zu verteilen und lassen Zellen richten sich für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
  12. Verschließen Sie die Platte mit Parafilm und halten Sie sie für 72 Stunden in einem befeuchteten 5% CO 2-Atmosphäre bei 37 ° C

3. Zelluläre Infektion und Färbung

  1. Der Tag vor der Infektion, nehmen Sie eine einzelne Kolonie von L. monocytogenes von BHI-Agar-Platte und Resuspendieren in 5 ml BHI-Flüssigmedium in einem 15 ml-Polystyrolröhrchen.
  2. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C in einem shacking Vorrichtung für Bakterienwachstum zu ermöglichen.
  3. Der Tag der Infektion, waschen 1 ml der über Nacht L. monocytogenes Kultur durch Zentrifugation 2 min bei 10.600 rcf auf einer Tischzentrifuge.
  4. Verwerfen des Überstandes (der das sezernierte Cytotoxin Listeriolysin O enthält) und Resuspendieren des Pellets in 1 ml PBS (repeaT Die Waschschritt 3 mal).
  5. Lesen des bakteriellen optische Dichte bei 600 nm war und die Anzahl von Bakterien (OD = 1 entspricht 1E9 Bakterien / ml).
  6. Vorbereiten des angemessenen L. monocytogenes Verdünnung in DMEM mit 1% FBS: mit hochinvasiven Stämme wie EGDe.PrfA *, empfehlen wir die Verwendung von 5E4 Bakterien in 30 ul pro Well (die Vielzahl der Infektion als 25 für 2000 Zellen geschätzt).
  7. Entfernen Sie das Zellkulturmedium in jede Vertiefung (80 ul) und ersetzen Sie es durch Zugabe von 30 ul des L. monocytogenes-haltigem Medium.
  8. Zentrifugieren der Platte bei 200 RCF für 5 min bei Raumtemperatur auf den Infektionsprozess zu synchronisieren.
  9. Inkubiere die Platte für 1 Stunde in einem befeuchteten 5% CO 2-Atmosphäre bei 37 ° C auf eine vorgewärmte Aluminiumblock.
  10. Entfernen Sie die L. monocytogenes-enthaltenden Mediums aus jeder Vertiefung werden 30 &mgr; l vorgewärmtem DMEM mit 10% FBS und40 ug / ml Gentamicin auf extrazelluläre L. töten monocytogenes.
  11. Inkubation für 4 Stunden in einem 5% CO 2-Atmosphäre bei 37 ° C auf eine vorgewärmte Metallblock.
  12. Eine Lösung von PBS mit 8% Formaldehyd (diese Lösung frisch hergestellt werden, daß die Formaldehyd-Monomere anstelle der Paraformaldehyd-Polymere, verwendet werden) ergänzt.
  13. Ohne Verwerfen des Zellkulturmediums, füge 30 &mgr; l PBS mit 8% Formaldehyd (Endkonzentration 4%) ergänzt und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur.
  14. Entfernen Sie das Fixiermittel und waschen Sie die Zellen dreimal mit 80 ul PBS pro Vertiefung (halten die Zellen in einem Gesamtvolumen von 80 ul PBS pro Vertiefung).
  15. Bereiten Sie eine 1:250 Verdünnung des Kaninchen-Anti-InlC Serum in PBS, ergänzt mit 0,2% Saponin.
  16. Werden 10 &mgr; l des primären Antikörpers in jede Vertiefung nach dem Entfernen des PBS und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur.
  17. Entsorgen Sie die primärenAntikörperlösung und waschen viermal mit 40 ul PBS pro Vertiefung.
  18. Verdünnt das sekundäre Alexa Fluor 546-gekoppelten anti-Kaninchen-Antikörper (1:250), die DAPI-Lösung (1:1500) und Phalloidin-Dy647 (1:150) in PBS, ergänzt mit 0,2% Saponin.
  19. Werden 10 ul dieser Sekundärfärbungslösung in jede Vertiefung und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur.
  20. Entsorgen Sie die sekundäre Farblösung und waschen viermal mit 40 ul PBS pro Vertiefung (Kommentar Endvolumen von 40 ul in jede Vertiefung und Abdichtung der Platte).
  21. Die Platte kann sofort abgebildet werden oder können bei 4 ° C lichtgeschützt (mit Alufolie abdecken) für die spätere Analyse gespeichert werden.

4. Bild-Akquisition und Analyse

  1. Erwerben Sie Bilder in drei verschiedenen Kanälen (350 nm, 546 nm und 647 nm) mit einem 10X-Objektiv auf einem automatisierten Mikroskop montiert (bevorzugt erwerben 9 Bilder pro Vertiefung).
  2. Die InlC Signal kann mit Hilfe von Bild gemessen werdenAnalyse-Software wie CellProfiler, die automatische Segmentierung der Zellkerne und Zellkörper mit der DAPI-Färbung und die Phalloidin bzw. ermöglicht.

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Ergebnisse

Fluoreszenzmarkierung von zytoplasmatischen InlC bietet eine robuste Anzeige für Zellinfektion durch L. monocytogenes, wie in Fig. 1 veranschaulicht: die zentrale Zelle in dem Mikrobild wird von dem Stamm P14.PrfA * 23 infiziert, wie es in dem Phasenkontrastbild (Pfeilspitzen, Fig. 1A) beobachtet werden, und es wird durch das DAPI-Signal bestätigt wird, wo einzelne Bakterien deutlich unterscheiden (Abbildung 1B). Die InlC Färbung (DAPI zum Färben...

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Diskussion

Mehrere Parameter sind kritisch für den Erfolg unserer InlC Erfassungsprotokoll, einschließlich der Verwendung von gesunden Zellinien Anzeigen einer ausreichend großen Zytoplasma eine eindeutige Erkennung der InlC Signals zu ermöglichen. Bei dem Test in diesem Artikel schlagen wir die Verwendung von HeLa CCL2-Zellen, die sich besonders gut für unseren Test geeignet aufgrund der Erweiterung ihrer zytosolischen Raum sind wir präsentieren, andere HeLa-Klone wie HeLa-Zellen Kyoto um einen kleineren Zytoplasma kann abe...

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Offenlegungen

Wir haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Research in P. Cossart Labor ist vom Pasteur-Institut, dem Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, dem Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), der Agence Nationale de la Recherche (MIE-Zuschuss unterstützt SignRupVac), den Louis-Jeantet-Stiftung und der Fondation Le Roch Les Mousquetaires. AK ist ein Empfänger eines Stipendiums von den Pasteur-Universität Paris Internationale Promotionsprogramm / Institut Carnot Mala infectieuses. Wir danken Jason Mercer für die Optimierung der Zell Transfektionsprotokolls.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Bacto Brain Heart InfusionBD237500For liquid BHI preparation
Bacto AgarBD214010Supplement to liquid BHI for BHI agar plates
Heat-Inactivated Fetal Bovine SerumBiowest51830-500
DMEMInvitrogen61965-026
Lipofectamine RNAiMaxInvitrogen13778-100
GentamicinSigmaG1397-10ML
Formaldehyde (16%)EMS15710Prepare fresh before each experiment
Anti-Rabbit Alexa Fluor 546InvitrogenA-11035
DAPIInvitrogenD-1306
Phalloidin Dy647Dyomics647-33
siRNA ScrambleDharmaconD-001810-10
siRNA MetDharmaconL-003156-00-0005
Black 384-well microscopy cell culture plateCorning3985
AxioObserver Z1 microscopeZeiss431007 9901
sCMOS cameraAndorNeo
Metamorph analysis softwareMolecular Devices4000
CellProfiler analysis softwareBroad InstitutePublic software available at http://www.cellprofiler.org/

Referenzen

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  22. Cheng, L. W., Viala, J. P., Stuurman, N., Wiedemann, U., Vale, R. D., Portnoy, D. A. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, 13646-13651 (2005).
  23. Ripio, M. T., Domínguez-Bernal, G., Lara, M., Suárez, M., Vazquez-Boland, J. A. A Gly145Ser substitution in the transcriptional activator PrfA causes constitutive overexpression of virulence factors in Listeria monocytogenes. Journal of Bacteriology. 179, 1533-1540 (1997).
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Erratum


Formal Correction: Erratum: Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes
Posted by JoVE Editors on 6/25/2014. Citeable Link.

A correction was made to Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. Three authors were omitted from the article at the time of publication. The acknowledgments section was also updated. The author list has been updated from:

Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020

to

Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Jason Mercer4, Mario Emmenlauer5, Christoph Dehio5, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute,2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel

The acknowledgments where update from:

Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We thank Jason Mercer for optimizing the cellular transfection protocol.

to

Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We acknowledge support by grant 51RT 0_126008 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology (to C.D.).

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