Nachweis der Transkripte von Genom und einem Persistent DNA-Virus in einem neuronalen Gewebe Fluorescent In situ Hybridisierung Kombination mit Immunfärbung

Zusammenfassung

Wir haben eine Fluoreszenz-in situ-Hybridisierungsprotokoll für den Nachweis eines persistenten DNA-Virus-Genom in Gewebeschnitten von Tiermodellen. Dieses Protokoll ermöglicht das Studium Infektionsprozess von codetection des viralen Genoms, dessen RNA-Produkte, und viralen oder zellulären Proteinen in einzelnen Zellen.

Zusammenfassung

Einzelzell codetection eines Gens ist seine RNA-Produkt und zellulären Regulatorproteinen kritisch Genregulation zu studieren. Dies ist eine Herausforderung auf dem Gebiet der Virologie, insbesondere für die Kern replizierende DNA-Viren, die anhaltende Tiermodellen für ihre Studie einzubeziehen. Herpes-simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) wurde eine lebenslange latente Infektion in peripheren Neuronen. Latenten Virus dient als Reservoir, aus dem es reaktiviert und induziert eine neue Herpes-Episode. Die Zellbiologie der HSV-1-Latenz vor schlecht verstanden, teilweise aufgrund des Fehlens von Methoden zur HSV-1-Genoms in situ in Tiermodellen zu erkennen. Wir beschreiben eine DNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)-Ansatz effizient Erfassung geringer Kopien viralen Genomen innerhalb der Abschnitte der neuronalen Gewebe von infizierten Tiermodellen. Die Methode beruht auf Wärmebasis Antigen Demaskierung und direkt markiert hausgemachten DNA-Sonden, oder im Handel erhältliche Sonden. Wir haben eine Dreifach staining Ansatz, der DNA-FISH mit RNA-FISH und Immunfluoreszenz, mit Peroxidase-basierte Signalverstärkung, um jede Anforderung zu erfüllen Färbung. Eine wesentliche Verbesserung ist die Möglichkeit, innerhalb von 10 um Gewebeschnitte, Low-Hintergrundsignale, die bei hoher Auflösung durch konfokale Mikroskopie und konventionellen Weitfeld-Epifluoreszenz abgebildet werden kann, zu erhalten. Zusätzlich war die Dreifachfärbung mit einer Vielzahl von Antikörpern gegen zelluläre und virale Proteine ​​gerichtet. Das komplette Protokoll dauert 2,5 Tage, um Antikörper und Penetration der Sonde im Gewebe unterzubringen.

Einleitung

Herpes-simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) ist eine persistente menschlichen neurotropen Viren, eine langfristige latente Infektion in den Neuronen des trigeminalen Ganglien (TG) des peripheren Nervensystems, von dem es periodisch reaktiviert zu replizieren und zu verbreiten. Die HSV-1-Genom ist ein 150 kb dsDNA Lokalisierungs im Zellkern der Wirts Neuron, wo es bleibt, wie Mehrfach chromatinized Plasmide, die nicht in das Wirtszellgenom integrieren ^1,2 haben. Während der Wartezeit wird der HSV-1-Replikationszyklus genetische Programm stark unterdrückt, und die Genexpression der Latenz-assoziierten Transkript (LAT) Ort, aus der Latenz Einrichtung Beginn der Reaktivierung ³ beschränkt. LAT erzeugt einen langen nicht-kodierenden RNA 8,5 kb zu einem großen 2 kb Lasso stabil verarbeitet und mehrere miRNA ^4-7. HSV-1-Latenz wird somit durch die Anwesenheit der viralen genomischen DNA-, RNA-LAT, und das Fehlen von nachweisbaren Replikationszyklus Proteine ​​gekennzeichnet.

NHALT "> Tiermodelle, vor allem Maus und Kaninchen, sind experimentelle Modelle rekapituliert einige Features der Latenz in der menschlichen. Eines der Hauptinteressen dieser Modelle ist, dass sie das Studium physiologische Aspekte der HSV-1-Latenz bei immunkompetenten Wirten. In den vergangenen Jahrzehnten Viele experimentelle Werkzeuge, wie beispielsweise gentechnisch veränderte Viren und Mäusen, wurden entwickelt, um die Physiologie, Genetik und Zellbiologie der HSV-1-Latenz, aus tierischem Gewebe zu untersuchen. Bisher wurde viraler genomischer DNA nachgewiesen und durch Southern-Blot quantifiziert und qPCR von TGs dissoziiert. gibt es jedoch noch kein Verfahren zur Verfügung, um HSV-1-Genoms von Gewebeschnitten auf ^8. Folglich Latenz wird routinemäßig bei der histologischen Schnitte durch den Nachweis von LAT-RNA durch RNA-in situ-Hybridisierung nicht bewertet erkennen in-situ-Hybridisierung Virusgenom-Nachweis. Da es nicht möglich war, infizierten Zellen zu charakterisieren, basierend auf der Anwesenheit von viralen Genomen, this technische Beschränkung hat einen großen Nachteil für die Analyse von vielen Aspekten der Wirt-Virus-Wechselwirkungen, wie die Beziehung zwischen dem viralen Genom und zelluläre und virale Genexpression oder den Host-Zell-vermittelten Immunantwort ^9,10.

Am wichtigsten ist, bleibt die Zelle-zu-Zelle Heterogenität der latenten Infektion relativ unerforscht und gezeigt wurde, ein Schlüsselmerkmal der Latenz in Mäusen und in menschlichen sensorischen Ganglienneuronen in SCID-Mäuse implantiert ^11-17 sein. Typischerweise wurde durch qPCR gezeigt, dass die HSV-1-Genom Kopienzahl pro Zelle variiert von 5 bis mehrere hundert. Obwohl LAT wird als Schlüsselregulator der Latenz und Reaktivierung qPCR Daten an isolierten Neuronen und in-situ-PCR zeigte, dass nur eine Teilmenge von latent infizierten Neuronen, so niedrig wie 30%, drückt die LAT-Locus ^11,12,18-21. Wie die Wirtszelle und die zelluläre Umgebung innerhalb des Gewebes Auswirkung auf die Virus-Latenz Einrichtung undvirale Genexpression, bleibt unklar. Hier beschreiben wir eine stabile Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)-Verfahren für die effiziente Detektion von niedriger Kopien HSV-1-Genom-DNA in tierischen neuronalen Gewebeschnitten. Diese Methode wurde von uns entworfen und für den Zugriff auf hochauflösende Mikroskopie, die notwendig ist, um die Interaktion des viralen Genoms mit den Wirtszell intra-Kernkomponenten ²² studieren zu bekommen. Zusätzlich beschreiben wir eine Mehrfachfärbung Verfahren zum gleichzeitigen Nachweis der viralen DNA mit RNA und Proteinen, die ein einzigartiges Werkzeug, um die Virus-Wirt-Wechselwirkungen, die virale Genexpression regulieren beschreiben. Das Verfahren kann auch für eine Vielzahl von Analysen den Nachweis von HSV-1-Genom latent, wie die Quantifizierung infizierten Neuronen in zahlreiche Abschnitte erforderlich angewendet werden. Ein wichtiger Schritt ist, um Antigen-Retrieval-Behandlung gelten die virale DNA-Hybridisierung zugänglich zu machen. Somit könnte das Protokoll auch effizient auf die Detektion seinandere dsDNA-Viren, die derzeit von herkömmlichen DNA-FISH Ansätze in tierischen Geweben nachweisbar sind es nicht.

Protokoll

Dieses Verfahren wurde bereits in einer Studie veröffentlicht ²² verwendet. Allgemeine Hintergrund und Beschreibung der konventionellen Manipulation auf der ISH, IF-und FISH, empfehlen wir die folgenden ²³ verfügbaren Literatur.

1. Tierinfektions

Alle Verfahren, die Versuchstiere entsprach ethischen Fragen von der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Erklärung für den Einsatz von Tieren in der Forschung, und wurden von der lokalen Ethikkommission der UPR-3296-CNRS in Übereinstimmung mit Europäischen Gemeinschaft genehmigt Richtlinie 86/609/EWG des Rates. Alle Tiere erhielten uneingeschränkten Zugang zu Nahrung und Wasser.

Das Verfahren von Maus Infektion mit HSV-1 beschrieben wurde in zuvor veröffentlichten Studien ^24-26 verwendet.

1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen, um vor dem Start vorzubereiten:
   
   HSV-1-Virus-Stammlösung
   Anästhesie-Lösung - KetaminE-100 mg / kg und Xylazin-10 mg / kg
   
2. Nehmen Sie ein ul-Virus (10 ⁶ pfu) in eine 5 ul Glasmikro zu einer Mikropumpe Gerät liefert 0,1 ul / s verbunden. Hinweis: resuspendieren das Virus in einem Lager Phenolrot-freiem Medium, um die Grenze zwischen dem roten Öl sehen in der Kapillare und der Virus-Lösung vorzulegen und Luftinjektion am Ort der Virus-Inokulation vermeiden.
3. Legen Sie den narkotisierten Maus (Ketamin-100 mg / kg und Xylazin-10 mg / kg) auf seiner Rückseite auf.
4. Positionieren Sie den narkotisierten Maus Kopf unter einem binokularen Stereo-Mikroskop und die Nadel in der subepithelialen Schicht der linken Oberlippe an der Schleimhaut Grenze. Spritzen Sie die Virus-Lösung in zwei Schritten (zweimal 0,5 ul) mit einer Geschwindigkeit von 0,5 ul pro 5 Sekunden. Hinweis: Beachten Sie eine 10 Sekunden Pause zwischen den beiden 0,5 ul-Injektionen, um die Virussuspension ermöglichen, an der Stelle der Injektion zu absorbieren.
5. Platzieren Sie die Maus inein 37 ° C-Inkubator bis Erwachen.
6. Lassen Sie die Maus in die Tierhaltung, um die benötigte Zeit zu erholen. Hinweis: Im Mausmodell, HSV-1 induziert eine Primärinfektion als akute Infektion, die weniger als 10 Tage an der Impfstelle und in mehreren neuronalen Gewebe einschließlich dauert TGs, oberen Halsganglien (SCG) und dorsalen Wurzelganglien (DRG) in Abhängigkeit von der Impfstelle. Zeichen der Primärinfektion und nach verschwinden und Latenz wird als voll etabliert etwa 28-30 Tage nach der Infektion (dpi) ab. Neuronalen Geweben kann in der Regel zwischen 4 dpi für Studien über akute Infektion geerntet werden, und von 28 dpi für Latenz-Studien.

2. Maus-Perfusion-fix

1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor Beginn: 50 ml physiologischer Kochsalzpuffer
   
   60 ml 1x PBS
   150 ml frisch hergestelltes 4% Paraformaldehyd in PBS 1x
   60 ml 20% Saccharose in 1x PBS.
   
2. Bereiten Sie den Infusionsschlauch: Schließen Sie die Nadel in eine Kapillare, die zu einer Schlauchpumpe angeschlossen ist.
3. Anesthetize die Maus wie oben (srep 1.2) beschrieben und legen Sie es auf dem Rücken auf einer Dissektion Tablett, von den vier Beine mit Stiften befestigt.
4. Mit einer Schere schneiden Sie die Haut vom Bauch bis zum Hals *. Reißen die dünne Gewebeschicht, die die Organe. Öffnen des Brustkorbs, indem die Rippen auf einer Seite des Brustbeins. Entfernen Sie die Haut durch Abreißen. Entfernen Sie sich von einander die rechte und linke Teile der Brustkorb, das Herz zu offenbaren. Hinweis: Achten Sie darauf, nicht den Mut, Lunge und große Gefäße (Halsschlagadern und Halsschlagadern), die machen perfuse-Fixierung unmöglich wird einzuschneiden.
5. Führen Sie die Nadel in die linke Herzkammer *. Inzision in den rechten Vorhof mit der Schere. Fahren Sie mit dem Ausbluten durch die Injektion von 20 ml physiologischer Kochsalzlösung in den Blutgefäßen durch das Herz. Lassen Sie den Blutfluss in den Behälter. Keinete: Während dieser Prozedur, achten nicht durch die andere Seite des Herzpunktion.
6. Perfundieren mit 150 ml 4% PFA in 1x PBS für 15 min * (Achtung: PFA ist giftig, unter Abzug zu manipulieren). Perfusion mit 60 ml 20% Saccharose in PBS 1x während 6 min. In diesem Stadium ist die Maus bereit für die Ernte TG. Hinweis: Stellen Sie die Pumpe auf 10 ml / min. Eine gute Durchblutung ist spürbar, wenn die Maus Schwanz versteift, heben Sie dann wieder zu fallen.

3. TG Ernten

1. Bereiten Sie die folgende Lösung vor dem Start:
   
   20% Saccharose in 1x PBS
   
2. Schneiden Sie den Kopf auf Höhe des Halses. Schneiden Sie die Spitze der Nase direkt hinter den Schneidezähnen, um die Nasenhöhle zu offenbaren. Inzision den Gaumen in zwei mit Schere und bewegen Sie jede Seite des Gaumens entfernt. Hinweis: Die TG erscheint direkt unter der Gaumen, wie zwei weiße und länglich Massen von 2-3 mm in der Länge auf der rechten Seite undlinken Seite und an der Trigeminus-Nerv verbunden.
3. Schneiden Sie die Trigeminus Zweige auf jeder Seite der TG, die TG aus dem Hirnstamm freizugeben. Entfernen Sie die TG mit chirurgischen Zange und halten sie in einer 20% Saccharose sterilen Lösung für 24 Stunden. Hinweis: Verwenden Sie zwei verschiedene Empfänger für den linken und rechten TG, um Verwechslungen zwischen dem linken TG (infizierte) und das Recht TG (nicht oder zu vermeiden, schwach infiziert). Inkubieren Sie die TG in 20% Saccharose in 1x PBS für 24 Stunden vor dem Einbetten.
4. Embed TGs in einem einzigen Block in Kryoschneiden Einbettungsmedium übertragen und bei -80 ° C
5. Speicher Blöcke bei -80 ° C bis zum Schneiden.

4. Kryoschnitt Vorbereitung

1. Schneiden Sie die TG 10 um Längsschnitte für ein -20 ° C Kryostaten, und legen Sie sie auf leicht erhitzt (30 ° C), Superfrost-Folien. Lassen Sie die Scheiben trocknen 5-10 min dann einfrieren und bei -80 ° C bis zur Verwendung. Hinweis: Bis zu 4-5 Abschnitte können pla seinced auf einer einzelnen Folie, wenn eine große Anzahl von Abschnitten zur gleichen Zeit bearbeitet werden soll. Wir gehen wie folgt: Serienschnitte sind so auf auf 3-Serie von Dias mit A1, B1 abgeschieden und C1, dann A2, B2, C2 und. Daher kann jede Folie Reihen (A, B und C) für unterschiedliche Färbung verarbeitet werden (in-situ-Hybridisierung, FISH, In-situ-PCR, LCM) und Daten über die verschiedenen Techniken erhalten werden, können im Vergleich zu wissen, dass Folien mit ebenso vielen entsprechen auf den gleichen Bereich der TG.

5. HSV-1 Sonde Labeling

Das nachstehend beschriebene Protokoll zum Nachweis von HSV-1-Genom-DNA von FISH wurde erfolgreich mit zwei Arten von Sonden verwendet werden. Die erste ist eine hausgemachte Cy3-markierten Fluoreszenzsonde, die für die Feinanalyse von Kern Organisation innerhalb der einzelnen Zellen, von hoher Vergrößerung Fluoreszenzmikroskopie geeignet ist. Die zweite ist eine kommerziell erhältliche biotinylierte Sonde, die kombiniert werden können,d mit Peroxidase-basierte Signalverstärkung, um ein helles Signal zu liefern. Letzteres ist für die Identifizierung und Quantifizierung von Virus enthaltenden Neuronen bei geringer Vergrößerung im gesamten Abschnitt geeignet und für die Analyse des HSV-1-Genom-Muster. Endnutzer sollten beurteilen, welche Vorgehensweise das Ziel ihrer Studie am besten passt. Die im Handel erhältlichen Sonde ist in der genannten Reagens Schnitt und der Herstellung der hausgemachten Sonde wird nachstehend beschrieben.

1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor Beginn:
   
   HSV-1-Genom enthält Vektoren (siehe Schritt 1)
   70% Ethanol, Molekularbiologie.
   
2. . Cosmide herzustellen, die 30 kb Abschnitte der HSV-1 Genom (Cosmide Zeichen 14, 28 und 56 in Bezug ²⁰ beschrieben unter Verwendung von Reinigungssäulen zur großen Vektoren gewidmet Hinweis: Andere Arten von Bibliotheken mit HSV-1-Genom, wie bakterielle künstliche Chromosomen sollte so gut, so lange die Sonde deckt alarge Teil der HSV-1-Genom zu ausreichender Signal ^27-29 zu produzieren. In unseren Händen hat Sonden aus der Cosmidvektors Rückgrat gemacht kein Signal zu produzieren, und wurden als Negativkontrolle verwendet. So gesamte Cosmid-Vektoren, die HSV-1-Sequenz wurden in unserer Studie verwendet. Es ist auch möglich, schneiden Sie die HSV-1-Sequenz und es verwenden, um die Sonde vorzubereiten.
3. . Label 2 ug jedem Cosmid mit Cy3-dCTP mit einem Nick-Translation-Kit nach den Herstellerrichtlinien Anmerkung: Führen Sie die Markierung mit einem Reaktionsgemisch, das nur Cy3-dCTP und keine unmarkierten dCTP.
4. Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 3 ul 0,5 M EDTA in die Mischung und Erwärmen auf 70 ° C für 10 min. Kühle auf Eis.
5. Reinigen Sie die Sonde auf einem G50-Gel Ausschluss Minisäule. In 150 ug Lachsspermien-DNA mit der Sonde und fällt die Sonde durch Ethanolfällung. Das DNA-Pellet sollte durch Einbeziehung Cy3 rosa werden. Waschen des Pellets mit 70% Ethanol zu entfernen und so viel Ethanolals mit einer Pipette möglich. Lassen Sie sich nicht die Pellets trocken.
6. Das Pellet mit 100 ul deionisiertem Formamid (Vorsicht: Formamid ist giftig Manipulieren unter Abzug.). Die Sonde Konzentration nicht zuverlässig an diesem Punkt gemessen werden. Die im Text genannten Sonde Mengen beziehen sich auf die Menge des verwendeten, um die Sonde zu machen Template-DNA. Das Protokoll auf 2 ug DNA-Matrize und 100 ul Formamid basiert, ist er als 20 ng / &mgr; l sein. Lagerung bei -20 ° C. Die markierte Sonde kann in großen Mengen hergestellt und gefroren gelagert für mehrere Monate.

6. DNA-FISH

Figur 1 zeigt einen Überblick über die wichtigsten Schritte des DNA-FISH-Protokoll und wie DNA-FISH als Teil einer Mehrfachfärbung Experiment durchzuführen, um RNA-und Protein codetect, wie in den Protokollen 7-9 beschrieben.

1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor Beginn:
   
   0,5% Triton X-100 in PBS 1x
   2x SSC und 0,2 x SSC-Puffer
   100 mM pH 6,0 Citrat-Puffer (10x Stammlösung) und 10 mM pH 6,0 Citratpuffer (Arbeitslösung)
   2x Hybridisierungspuffer (siehe Protokoll Nr. 4)
   
2. Am Tag 1, legen Sie die Folien auf einer Folie Halter bei Raumtemperatur, und lassen Sie die Teile trocknen für 10 min. Kreisen Sie die Abschnitte mit einem hydrophoben Stift. Rehydrate die Abschnitte in 1x PBS für 10 min. Inkubieren Sie die Abschnitte 20 min mit 0,5% Triton X-100 in 1x PBS, um das Gewebe durchlässig zu. Wash 3x 10 min mit 2x SSC, und halten Sie in 2x SSC, bis die Entlarvung Puffer beheizt (siehe unten).
3. Für Demaskierung, bereiten Sie einen Objektträger aus Glas Schale (20 Dias Kapazität) mit 200 ml 10 mM Natriumcitrat-Puffer (pH 6,0) gefüllt. Zeigen die Schale in einen größeren Behälter mit 500 ml destilliertem Wasser gefüllt. Diese Einstellung ermöglicht eine bessere Steuerung der Erwärmungspulse. Bevor Sie die Folien in der Schale, heizen Sie den Puffer in der Mikrowelle bis zum buffer erreicht Siedepunkt (ca. 8 min bei 800 W).
4. Objektträger in den vorgeheizten Citratpuffer haltigen Tablett, und sicherstellen, dass sie vollständig mit Puffer bedeckt. Wärme für ca. 20 Sekunden, bis der Puffer erreicht Kochen. Achtung, Lassen Sie nicht den Puffer über Kochen, die das Gewebe schädigen könnten. Kühle bei Raumtemperatur für 2 min nach unten. Wiederholen Sie den Heizkreislauf 6x (7 Erwärmungszyklen gesamt) *. Cool down 2 min und übertragen Sie die Folien in 2x SSC für 5 min.
   * Hinweis: Dies ist einer der kritischsten Schritte. Die optimale Anzahl und die Dauer der Erwärmungszyklen sollte empirisch bestimmt werden und kann von der Art des Gewebes oder der Art der verwendeten Sonde ab. Die Mikrowelle, Tablett, Behälter und das Volumen des Puffers in der Schale und Wasser in den Behälter sollte Reproduzierbarkeit der Demaskierung identisch gehalten werden. Übermäßige Kochen konnte in Gewebeverlust und beschädigte Zellen führen. Für jede Erwärmungspuls wird das Aussehen des Kochens sorgfältig beobachtet, und der Wärmeing sollten bei ersten Anzeichen von Kochen zu stoppen. Einmal eingerichtet, erscheint Demaskierung robust und reproduzierbar. 2A zeigt, dass HSV-1-Genom kann durch Demaskierung mit verschiedenen Puffern nachgewiesen werden, was die Entlarvung Bedingungen weiter untersucht werden kann. Citrat-Basis Demaskierung wurde festgestellt, dauerhaft eine gute FISH-Signal und Gewebeerhaltung, mit Abschnitten aus verschiedenen Labor-und Tiermodellen.
5. Essigsäure: die Folien in einem Methanol inkubieren PBS-Mix (03.01.04) für 15 Minuten, dann in einem Methanol: Essigsäure-Mischung (3:1) für 15 Minuten (Vorsicht: Essigsäure ist ätzend Manipulieren unter Rauch. Kapuze und verwenden ausreichenden Schutz. Diese Lösung direkt vor Gebrauch).
6. Entwässern den Schnitt durch aufeinanderfolgende 10 min Inkubation in 70%, dann 2x 10 min in 100% Ethanol. Trocknen lassen bei Raumtemperatur für 10 min. Trocken halten, bis Sondieren.
7. Bereiten Sie das Sondieren Lösung wie folgt: Vorbereitung im Voraus einen Bestand von 20 ml 2x Hybridisierungspuffer Containing 20% ​​Dextransulfat (MW 500.000), 2x Denhardt-Lösung, 4x SSC *. Aliquot der Lösung als 500 ul in Mikroröhrchen, und bei -20 ° C Für ein Schieber (Deckglas von 22 mm x 50 mm), mischen 90 ng von HSV-1 Cy3-markierten Sonde (30 ng Sonde für jeden Cosmid) und führen Sie die Lautstärke auf 40 ul mit Formamid. In 40 ul 2x Hybridisierungspuffer. Gut mischen durch Pipettieren von oben und unten mehrmals.
   Hinweis *: Zur Herstellung der 2x Hybridisierungspuffer, mischen 4 g MW 500.000 Dextransulfat in 10 ml destilliertem Wasser. Es macht eine zähflüssige Mischung, die nach 3-4 Stunden bei 70 ° C lösen Mischen Sie regelmäßig zu helfen, zu lösen. 4 ml 20x SSC, 400 ul von 100x Denhardt-Lösung. Füllen auf 20 ml und gut mischen mit einem Vortex.
8. Tropfen 80 ul der Sondierung Lösung auf die getrockneten Abschnitte. Decken Sie mit einem 22 mm x 50 mm Deckglas, und überprüfen, ob die Sondierung Lösung erstreckt sich überdie gesamte Oberfläche des Deckglases. Achtung: es sollten keine Blasen sein. Vorhandensein von Blasen verringert Hybridisierungseffizienz. Deckglas mit Gummilösung, und trocknen lassen. Halten Sie die Folien in der Dunkelheit bei Raumtemperatur für mindestens 2 Stunden für die optimale Hybridisierungssignal in der gesamten Folie.
   Hinweis: Gummizement ist praktisch, da es schnell trocknet, ist wasserdicht und schützt vor dem Austrocknen der Probe während der Hybridisierung. Es ist auch leicht zu schälen, um das Deckglas nach Hybridisierung zu entfernen. Nagellack ist eine alternative effiziente, aber weniger komfortable Möglichkeit.
9. Fahren Sie mit Denaturierung indem die Objektträger auf einer 80 ° C-Inkubator Rutsche für 5 min. Alternativ legen Sie die Folien auf einer Metallplatte und legen Sie das Fach in einem 80 ° C Wasserbad (die Schale sollte float). Dann schnell die Folien übertragen auf eine metallische Schale auf Eis gestellt. Lassen Sie für 5 min. Die Objektträger bei 37 ° C (Heizung oder Dia-Inkubator) zur Hybridisierung über Nacht.
   Hinweis: Wir empfehlen nicht kürzer Hybridisierung, die schwache Ergebnisse oder kein Signal.
10. Am Tag 2, entfernen Sie die Gummizement mit einer Pinzette, und gleichzeitig die Folie auf die Heizung, um den Abschnitt bei 37 ° C zu halten Entfernen des Deckglases vorsichtig mit der Spitze einer Skalpell-Klinge.
11. Wasch 3x mit 2x SSC bei 37 ° C für 5 min, und dreimal mit 0,2 × SSC bei 37 ° C für 5 min. Einmal Waschen mit 2x SSC bei Raumtemperatur für 5 Minuten und fahren Sie mit DNA-Färbung und Montage (siehe Protokoll 10 unten).
    Hinweis: Dieses Verfahren ermöglicht den Nachweis von zellulären genomischen Ziele durch Verwendung entsprechender Sonden in der Sondenlösung zusammen mit HSV-1-spezifische Sonden für und Centromer-Sequenzen pericentromeric ²² veröffentlicht.

7. Dual-RNA-DNA-FISH

Siehe Abbildung 1, grün-Boxen für einen Überblick.

Für MehrfachFärbeverfahren, einschließlich einer RNA-FISH Schritt wird allgemein empfohlen, zuerst RNA-Detektion durchzuführen, wie solche Ziel ist empfindlich gegen Abbau durch RNase und Chemikalien. Zusätzlich enthält DNA-FISH-Verfahren Behandlungen, die die Effizienz anderer Färbung zu verringern. Für die RNA-FISH, wählten wir ein Enzym basierte Erkennung Ansatz (Tyramid Signalverstärkung (TSA) mit biotinylierten Sonden und Peroxidase (HRP) gekoppelt Streptavidin). TSA wird auf einem Fluoreszenz Tyramid-Substrat (siehe Tabelle Reagenz für Details), das kovalent an das Gewebe durch eine Peroxidase enzymatische Reaktion verknüpft basiert. Die RNA-FISH Signal wird somit während der DNA-FISH erhalten.

1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor Beginn:
   
   Vektor zur in vitro-Transkription von LAT-Locus (pSLAT-2)
   1x PBS, enthaltend 2 mM RVC
   0,5% Triton X-100 in 1x PBS, enthaltend 2 mM RVC
   3% H ₂ 0 ₂ in destilliertem Wasser.
   70%, 80%, 95% Ethanol, Molekularbiologie.
   4x RNA-Hybridisierungslösung (siehe Protokoll Nr. 4)
   
2. Mindestens einen Tag vor der RNA-FISH-Experiment, bereiten Sie die RNA-FISH-Sonde. Zum Nachweis der HSV-1-Latenz assoziierten Transkript (LAT), Vorbereitung einer biotinylierten Ribo-Sonde aus dem pSLAT-2-Vektor ³⁰ oder einem anderen Vektor für in-vitro-Transkription der LAT-Locus, wie zuvor unter Bezugnahme ²⁶ beschrieben. Kurz: Linearisieren 10 ug pSLAT-2 mit HindIII und reinigen die verdauten Vektor mit einem DNA-Reinigung-Kit. Synthese eines Einzelstrang-Ribo-Sonde von 2 ug verdaute pSLAT-2 mit einem T7 in vitro-Transkription-Kit in Gegenwart von Biotin-16-UTP *. Reinige die Sonde mit einem RNA-Minisäule und zu quantifizieren bei 260 nm mit einem Spektralphotometer. Verdünnen Sie die Probe bei 50 ng / ul in DNAse / RNAse freies Wasser und bei -80 ° C in kleinen Portionen zu Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden.
   Hinweis *: Die Biotin-16-UTP: UTP-Verhältnis muß empirisch ermittelt werden. Wir found ein 40:60-Verhältnis, Sonden effizient Erfassung LAT durch RNA-FISH liefern.
3. Am Tag 1, legen Sie die Folien auf einer Folie Halter bei Raumtemperatur, und lassen Sie die Teile trocknen für 10 min. Kreisen Sie die Abschnitte mit einem hydrophoben Stift. Rehydrate die Abschnitte in 1x PBS mit 2 mM Ribonucleosid Vanadyl Complex (RVC) * für 10 min. Inkubieren der Abschnitte 20 min mit 0,5% Triton X-100 in 1x PBS, enthaltend 2 mM RVC, um das Gewebe zu permeabilisieren. Waschen 3x 10 min mit 1x PBS, 2 mM RVC. Um zu stillen jede endogene Peroxidase-Aktivität, Inkubation den Abschnitt in 3% H ₂ O ₂ für 2x 10 min, und dann einmal mit 1x PBS, 2 mM RVC waschen.
   Hinweis *: Während der RNA-FISH-Verfahren wird Ribonucleosid Vanadyl-Komplex (RVC), Puffer und Lösungen hinzugefügt, um RNA-Abbau zu verhindern.
4. Inkubieren 2x 10 min in 70% Ethanol. In diesem Stadium können Abschnitte in 70% Ethanol bei -20 ° C für mehrere Wochen gelagert werden. Dehydratisieren die Abschnitte durch Inkubation in 80%, 95% und 100% ethnol, 5 min jeweils. Lassen Sie den Abschnitt trocken für mindestens 10 min.
   Anmerkung: In einigen Fällen kann die Ethanolbehandlung schädliche zum Nachweis anderer Ziele. Eine alternative Protokoll mit einem Vorhybridisierungsschritt in 50% Formamid - 2x SSC verwendet werden (siehe unten in Protokoll Nr. 9 für Details über Dreifach-Färbung). Allerdings ist Ethanol-Behandlung das vielseitigste Ansatz zur RNA-FISH und bietet die niedrigsten Hintergrund.
5. Bereiten Sie das Sondieren Lösung wie folgt: Vorbereitung im Voraus eine 10 ml Bestand eines 4x RNA Hybridisierungslösung, die SSC 8x, 20x Denhardt-Lösung, 4 mM EDTA, 40% Dextran *. Aliquot der Lösung als 500 ul in Mikroröhrchen, und bei -20 ° C Für 1 Schlitten vorbereiten 80 ul Lösung (Deckglas von 22 mm x 50 mm), durch Mischen von 20 ng biotinylierte LAT Riboprobe, 40 ng Hefe-tRNA, 2 mM RVC und vollständig zu 20 ul mit Wasser. In 20 ul 4x RNA-Hybridisierungslösung und 40 ulFormamid (50% Endkonzentration). Für einfachere Pipettieren und Mischen wird empfohlen, die 4x-RNA-Hybridisierungslösung bei 75 ° C vorwärmen Gut mischen durch Pipettieren von oben und unten mehrmals.
   * Hinweis: Um die 4x RNA-Hybridisierungslösung herzustellen, mischen 4 g Dextransulfat (MW 500.000) in 3 ml destilliertem Wasser und 4 ml 20x SSC. Es macht eine zähflüssige Mischung, die nach 3-4 Stunden bei 70 ° C löst sich Mischen Sie regelmäßig, um zu helfen, sich aufzulösen. 2 ml 100 × Denhardt-Lösung und 80 ul einer 0,5 M EDTA-Lösung. Füllen auf 10 ml mit Wasser auffüllen und gut mischen mit einem Vortex. Achtung: Verwenden Sie nur RNase / DNase freie Produkte.
6. Denaturierung der Sonde 10 min bei 75 ° C. Unterdessen legen die Folien auf einer Folie Inkubator auf 65 ° C eingestellt Tropfen 80 ul der Sonde Lösung auf die Abschnitte und schnell legen Deckglas auf den Tropfen. Achtung: Es sollte keine Blase sein. Vorhandensein von Blasen verringert Hybridisierung effizienz. Inkubation muß in einer feuchten Kammer nehmen, da das Deckglas ist nicht versiegelt. Verwenden Sie entweder eine Dia-Inkubator, die Wasser aufnehmen kann (siehe Materialtabelle), oder bereiten Sie eine Feuchtkammer in einem verschlossenen Box und legen Sie sie in einem 65 ° C Hybridisierungsofen.
7. Inkubieren über Nacht bei 65 º C Anmerkung: LAT RNA-FISH wird bei 65 ° C durchgeführt unspezifische Bindung der Sonde, die bei 37 ° C beobachtet wird, um zu verhindern, Viele andere RNA-FISH-Sonden sollten in gutem Signal bei 37 ° C führen
8. Am 2. Tag vor Beginn der Wäsche, bereiten die Nachweisreagenzien nach den Vorschriften des Herstellers des TSA-Nachweis-Kit. Die Detektion erfolgt mit einem handelsüblichen TSA-Nachweis-Kit mit einem Meerrettich-Peroxidase (HRP) gekoppelt Streptavidin und einem grünen oder blau fluoreszierendes Substrat durchgeführt.
9. Halten Sie die Folien auf der Folie Heizung bei 65 ° C Entfernen Sie vorsichtig das Deckglas und schnell 1 ml 50% Formamid in 2x SSC, vorgewärmt eint 65 ° C. Vorsicht, lassen Sie sich nicht den Abschnitt trocken. Waschen zweimal 10 min bei 65 ° C in 50% Formamid in 2 × SSC und 2x 10 min in 2x SSC bei 65 ° C. Noch einmal mit 2x SSC waschen und legen Sie die Folie auf einem 37 ° C Dia-Heizung.
10. Fahren Sie mit der Detektionsschritt nach der TSA-Nachweis-Kit Hersteller Unterricht. Die Konzentration von HRP-Streptavidin, muss die Konzentration der fluoreszierenden Substrat und die Reaktionszeit empirisch ermittelt werden *. Für LAT-RNA-Erkennung, die wir routinemäßig verwendet, die folgende Bedingung: HRP-Streptavidin bei 1/500 verdünnt, fluoreszierende Reagenz bei 1/100 für blaue Fluoreszenz und 1/500 für grüne Fluoreszenz und Reaktionszeit von 10 min. Das Signal kann schnell mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop überprüft werden, ohne Montage, bevor mit DNA-FISH fortfahren.
    Hinweis *: Die Verstärkung Protokoll Design nach der Hauptziele des Experiments sein. Um beispielsweise fein Lokalisierung der Ziel-RNA ist es adberaten, kurze Reaktionszeit zu verwenden. Im Gegensatz dazu, schnell zu identifizieren und zu zählen positive Zellen bei geringer Vergrößerung können die Reaktionszeit erhöht, um eine helle Signal zu erzeugen.
11. Für die DNA-FISH, folgen Sie der oben genannten Verfahren ausgehend von der Entlarvung Schritt (Schritt 6.2).

8. Immuno-DNA-FISH

Siehe Abbildung 1, lila-Boxen für einen Überblick.

Ähnlich wie RNA-DNA-FISH, ist es ratsam, zuerst die Immunfluoreszenz durchführen, da DNA-FISH ist wahrscheinlich, um Proteine ​​zu denaturieren und deren Nachweis durch Antikörper zu verhindern. Die Qualität der Immunfluoreszenzsignal ist stark abhängig von der Antikörpereigenschaften und mehrere Antikörper sollte geprüft werden, wann immer möglich. Epitop-Demaskierung wird einmal vor der Immunfluoreszenz durchgeführt, um sowohl die Proteinerkennung und DNA-FISH verbessern. Um den Immunfluoreszenzsignal auf der Probe während der DNA-FISH-Verfahren notwendig, um zu bewahren cov ist esalently verknüpfen es mit dem Gewebe. Wir stellen hier zwei Ansätze, die gute Ergebnisse in unseren Händen vorgesehen ist, Antikörper nach der Fixierung und Tyramid basierte Erkennung (siehe Schritt 8.5). Die Wahl sollte durch Vorversuche für jede Ziel / Antikörperpaar angesteuert werden.

1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor Beginn:
   
   1x PBS mit 3% normalem Ziegenserum (NGS).
   2% PFA in 1x PBS (Verdünnung von 4% Stammlösung)
   
2. Am Tag 1 sind die ersten Schritte identisch mit DNA-FISH, bis zur Demaskierung Schritt (Schritte 6,1-6,2).
3. Nach der Demaskierung, Inkubation der Schnitte mit 1x PBS mit 3% NGS für 1 Stunde.
4. Inkubieren mit dem primären Antikörper in 1 × PBS, das 3% NGS für 24 Stunden. Unter Inkubationszeit kann verwendet werden, um das Protokoll zu verkürzen, obwohl wir festgestellt, dass eine Inkubation über Nacht führt gewöhnlich zu einem stärkeren Signal. Für geringe Affinität primären Antikörpern wie IgM kann bis zu 48-72 h Inkubation erforderlich.
5. Am Tag2, waschen 3x 10 min mit 1x PBS.
6. Protokoll mit Antikörper nach der Fixierung: Inkubation 1 h mit dem sekundären Antikörper gekoppelt mit einem grünen Fluoreszenzfarbstoff, ab 1/200 in 1x PBS mit 3% NGS. Dreimal 10 min mit 1x PBS waschen. Post-Fixierung mit 2% PFA in 1x PBS für 10 min * durchgeführt. Waschen 3x 10 min mit 1x PBS.
   Protokoll mit TSA-Erkennung: Inkubation 1 h mit dem HRP-gekoppelten sekundären Antikörper bei 1/250, die in 1x PBS mit 3% NGS. Dreimal 10 min mit 1x PBS waschen. Fahren Sie mit Tyramid Erfassung gemäß den Anweisungen des Herstellers. Wie oben (Schritt 7.9), Verdünnung der Reagenzien und der Reaktionszeit angegeben, müssen empirisch ermittelt werden. In den meisten Fällen hat sich unser Protokoll auf einer 1/500 Verdünnung des fluoreszierenden Substrats und 10 min Reaktionszeit basiert. Waschen 3x 10 min mit 1x PBS.
   * Hinweis: Post-Fixierung ist ein kritischer Schritt in Immuno-FISH, und erfordert eine sorgfältige Set-up. Je stärker die nach der Fixierung derbesser das ZF-Signal, und je niedriger die DNA-FISH Effizienz.
7. Fahren Sie mit dem DNA-FISH aus dem Methanol-Essigsäure (Schritt 6.3). Dauer der Immun DNA-FISH typischerweise 3 Tagen mit dem Antikörper über Nacht inkubiert.

9. Zwei DNA-RNA-FISH mit Immunfluoreszenz-Coupled

Siehe Abbildung 1, orange-Boxen für einen Überblick.

RNA-FISH wird zuerst schließlich DNA-FISH durchgeführt, gefolgt von Immunfluoreszenz, und. Wenn Immunfluoreszenz wird durch Tyramid Reaktion nachgewiesen, ist es völlig Schlüssel zu den HRP-Aktivität von der RNA-FISH Schritt mit H ₂ O ₂ zu stillen, und um sicherzustellen, dass Abschrecken ist effizient. Dies wird durch Verwendung einer Folie als "kein primärer Antikörper" Steuerung.

Da Ethanolbasis Dehydratisierung schädlich für einige Lösungsmittel-empfindlichen Proteine, kann dieser Schritt des RNA-FISH Immun hemmen. Wenn ja, können RNA-FISH w durchgeführt werdenith eine alternative Protokoll, wie unten in stpe 9.3 beschrieben.

1. Bereiten Sie die folgende Lösung vor dem Start:
   
   50% Formamid in 1x PBS mit 2 mM RVC
   
2. Am Tag 1, bereiten Sie die RNA-FISH-Sonde und gehen Sie wie für Dual-RNA-FISH, bis zu dem H ₂ O ₂ Löschschritt (Schritt 7.2).
3. Fall 1 arbeitet die Immunfluoreszenzfärbung nach Ethanol-Dehydratisierung: Weiter mit RNA-FISH, wie oben in Schritten von 7,3 bis 7,9 angegeben. Dann fahren Sie mit Schritt 9.6.
4. Fall 2 wird die Immunfluoreszenzfärbung von Ethanol-Behandlung verhindert: Objektträger in einer feuchten Kammer auf einer Folie Heizung auf 65 ° C eingestellt und Inkubation für 1,5 h in einem Vorhybridisierungslösung die 50% Formamid, 1x PBS und 2 mM RVC. Lassen Sie das Vorhybridisierungslösung und Drop 80 ul Hybridisierungslösung wie in den Schritten 7.4 und 7.5 angegeben. Fahren Sie dann mit RNA-FISH-Hybridisierung und Detektion wie angegeben above von 7,6 bis 7,9 in Schritten (Tag 2 und 3).
5. Am Tag 2 nach der RNA-FISH abgeschlossen ist, fahren Sie mit Immun-DNA-FISH, beginnend mit dem Entmaskierungsschritt (siehe Schritt 6.2). Dann folgen Sie der Immuno-DNA-FISH-Protokoll wie oben in Schritten von 8,2 bis 8,6 angegeben.

10. Slide Montage-und Imaging

1. Bereiten Sie die folgende Lösung vor dem Start:
   
   Hoechst 33342 bei 0,5 ug / ml in 1 × PBS
   
2. Fleckenkerne für 10 min mit DAPI oder Hoechst 33342 * bei 0,5 ug / ml in 1 × PBS für 10 min. Waschen 3x 10 min mit 1x PBS.
   Hinweis *:. Vorsicht Wenn eine der Detektionssysteme verwendet einen fluoreszierenden blauen Farbstoff, verwenden Sie nicht DAPI oder Hoechst. Verwenden Sie stattdessen eine fluoreszierende DNA-Farbstoffe mit einer Emissionsspektren im fernen Rot Wellenlänge wie Topro3.
3. Drain so viel Flüssigkeit wie möglich aus dem Schlitten. Drop 80 ul Medium, das eine Montageantifading-Mittel an einem Ende des Schiebers. Decken Sie die Abschnitte mit einer hohen optischen QualitätDeckglas (Nr. 1.5 Glas). Lassen Sie das Deckglas nach unten gehen langsam durch die Aufrechterhaltung es an einem Ende mit einer Pinzette, um die Montagemedium Ausbreitung über den Abschnitt, ohne Blasen zu lassen.
4. Dichtung mit Nagellack und bei 4 ° C in einer dunklen Folie Feld.
5. Direkte Beobachtung von DNA-FISH Signal der latenten HSV-1 Genome erfordert eine höhere Vergrößerung 40X oder Ölimmersionsobjektiv mit hoher numerischer Apertur (zB 40x NA 1.1, 60X-63X NA 1.4, 100X NA 1.3) und eine Anregungslichtquelle mindestens äquivalent zu einer 100 W-Quecksilberlampe. Wir beraten mit einer Hocheffizienz-Transmissionsmikroskop, wie sie von den Herstellern in den letzten 5 Jahren (siehe Tabelle der Ausrüstung). Die konfokale Mikroskopie bietet Werkzeuge, um Bilder mit niedrigeren Hintergrund durch Autofluoreszenz des Gewebes, wie dünne Schnitte oder spektrale Bildgebung zu sammeln.

Ergebnisse

Nach mehreren Monaten umfangreicher Tests, entdeckten wir, dass die Wärme-basierte chemische Demaskierung in-situ-Hybridisierung gemacht latente HSV-1-Genom vorhanden für Leuchtstofflampen. Während des Prozesses haben wir versucht, verschiedene Demaskierung Verfahren und nur Wärme-basierte Behandlungen (dh Erhitzen der Schnitte bis Unter Siedetemperatur in einem Mikrowellenherd) erschien effizient. Wir haben dann testete mehrere Salzpuffern, die routinemäßig in der Immunhistochemie (IHC) und Elek...

Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht den Nachweis von HSV-1-Genom latent in Neuronen des neuronalen Mausgewebeschnitten. Unser Verständnis der Wege Regel virale Genexpression wurde durch den Mangel an Verfahren zu HSV-1-Genom-DNA in situ in neuronalen Geweben erkennen beschränkt. Informationen über Genom-Kopienzahl und der Anteil der infizierten Nervenzellen kamen vor allem aus PCR-Analyse auf dissoziiert Neuronen ^11,12. Bei der Aufklärung der Rolle der Wirtszellkernarchitektur auf HSV-1-L...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balb/c mice	Janvier, France		6 week-old females
HSV-1 strains	SC16 strain (wild type)		See Labetoule, M. et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci 44, 217–225 (2003) for details on HSV-1 strain and virus stock preparation.
Ketamine hydrochloride	Sigma	K2753	Intraperitoneal injection of a solution containing Ketamine (100mg/kg) and Xylazine (10mg/kg)
Xylazine hydrochloride	Sigma	X1251
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	158127	Suspend 4 g of PFA in 90 ml of water. Add 50 µl of 1N NaOH, and heat at 60 °C in a water bath with agitation. PFA dissolves in about 30 min. Add 10 ml of 10x PBS. This solution can be prepared in advance and stored at -20 °C in 5 ml tubes. Caution. Manipulate under a fume hood.
Physiological Saline	Sigma	07982-100TAB-F
1x PBS, pH 7.4 (sterile)	Life Technologies	10010-015
Sucrose	Sigma	84100	Prepare a 20% sucrose solution in 1x PBS.
Cryosectionning embedding medium - Tissue-Tek OCT Compound	SAKURA	4583
Large vector DNA purification kit	Qiagen	12462	To purify Cosmid or BAC vector containing HSV-1 genome and store at -20 °C
Nick translation kit	Roche Applied Sciences	10 976 776 001
Cy3-dCTP	GE Healthcare	PA53021	Protect from light
0.5 M EDTA	Sigma	E6758
G50 Mini spin column	GE Healthcare	27-5330-01
Salmon sperm DNA 10 mg/ml	Invitrogen Life Technologies	15632-011
Ethanol molecular biology grade	Sigma	87047	Prepare a 70% solution
Salmon sperm DNA	Invitrogen Life Technologies	15632-011
Formamid Molecular biology grade	Sigma	F9037	Caution. Manipulate under fume hood.
HSV-1 biotinylated commercial probe	Enzo Life Sciences	ENZ-40838
ImmEdge hydrophobic pen	Vector Laboratories	H-4000
20x Saline Sodium Citrate (SSC)	Sigma	S6639	Prepare a 2x SSC solution in ddH20.
Triton X-100	Sigma	T8787	Prepare a 10% stock solution in water and store at +4 °C. Prepare the 0.5% solution in 1x PBS right before use.
10 mM Sodium citrate pH 6.0	Sigma	S1804	Prepare a 100 mM stock solution (10x). Weigh 10.5 g of citric acid (MW 210.14). Caution, irritant and toxic, wear appropriate mask and gloves), and dissolve in 400 ml water. Adjust pH at 6.0 with 1 N NaOH (caution, irritant, wear gloves). Adjust to 500 ml with distilled water. Dilute 10x in distilled water before use.
Acetic Acid	Sigma	320099
Methanol, molecular biology grade	Sigma	322415
Dextran sulfate - MW 500,000	Euromedex	EU0606-A
Denhardt's solution (100x)	Euromedex	1020-A
Rubber Cement "FixoGum"	Marabut	290110000
DNA purification kit  - Qiaquick PCR purification kit	Qiagen	28104
T7 in vitro transcription kit	Ambion Life Technologies	AM1314
Biotin-16-UTP	Roche Applied Sciences	11388908910
RNA purification minicolumn	Qiagen	73404
Ribonucleoside Vanadyl Complex	New England Biolabs	S1402S
H2O2	Sigma	H3410	Prepare a 3% solution in distilled water. Store at +4 °C and protect from light.
Yeast tRNA	Invitrogen	15401011	prepare a 10 mg/ml solution in RNAse free water
Normal Goat Serum	Invitrogen	PCN5000
Primary antibodies	any supplier		The following primary antibodies were used in the result section: anti-mouse CENP-A (rabbit mAb C51A7, Cell Signaling Technologies), and anti-ATRX H-300 (Santa Cruz Biotechnology)
Secondary fluorescent antibodies	Invitrogen Life Technologies		The fluorescent secondary antibodies routinely used in our protocol are Alexa Fluor labeled goat antibodies (IgG H+L). The antibody used in the result section is an anti-rabbit goat antibody labaled with Alexa Fluor 488 (reference A11001)
Tyramide Signal Amplification (TSA) kit - Streptavidin + Alexa Fluor 350 (blue fluorescence)	Invitrogen Life Technologies	#T20937	TSA kits are also available from Perkin Elmer
Tyramide Signal Amplification (TSA) kit - Streptavidin + Alexa Fluor 488 (green fluorescence)	Invitrogen Life Technologies	#T20932
Hoechst 33342	Invitrogen Life Technologies	H3570	Prepare a 0.5 µg/ml solution in 1x PBS immediately before use. Discard the remaining solution.
22 mm x 50 mm coverslip. n°1.5 glass	Electron Microscopy Sciences	72204-04
Mounting medium with anti-fading agent - VECASHIELD	Vector Laboratories	H-1000	Another conventional product is Fluoromount G from Electron Microscopy Science
Superfrost glass slides	FisherScientific	12-550-15
Equipment/Material	Company	Reference	Note
Needle for infection			Glass micropipette hot drawn. Custom made.
Dissection equipment	Moria, France		Microsurgical scissors and forceps
Peristaltic pump	Cole Palmer Instruments		Easyload Masterflex
Microsyringe pump device (Nano Pump)	kdScientific	KDS310
Cryostat	Leica France	CM 1510-1
-80 °C freezer	Sanyo		Ultra Low -80 °C
Domestic microwave oven
Dry block heater	Eppendorf	022670204
Incubator Slide moat	Boekel Scientific	240000
Coplin Jar	Dominique Dutscher	68512
Staining glass container	Dominique Dutscher	68506
Fluorescent microscope	Zeiss		The images presented in the result section were collected with a Zeiss AxioObserver with objective 40X LD NeoFluor N.A 0.6, and 100X PlanApochromat N.A 1.3. Filter set #38, #43, and #43. HXP 120 fluorescence light source. Photometrics CoolSNAP HQ2 CCD camera. Signal will be more easily observed on a recent high efficiency microscope such as Zeiss AxioImager/AxioObserver series, Nikon Ti-E/Ni-E series or Leica DM/DMI6000 series