Ultraschall-Imaging-guided Intra Injection zur Entwicklung eines Mausmodells von Brustkrebs Hirnmetastasen durch Längs MRI Gefolgt

Zusammenfassung

Ein Brustkrebs Hirnmetastasen Mausmodell mit Ultraschall bildgesteuerten Injektion von intra MDA-MB231/Br-GFP Zellen etabliert. Entwicklung von Hirnmetastasen multifokale längs mit hochauflösenden 9,4 T MRT überwacht.

Zusammenfassung

Brustkrebs Hirnmetastasen, bei 30% der Patientinnen mit Brustkrebs im Stadium IV auftreten, wird mit hoher Sterblichkeit. Die mediane Überlebens ist nur 6 Monate. Es ist kritisch, geeignete Tiermodelle haben die hämodynamischen Ausbreitung der metastatischen Zellen im klinischen Szenario zu simulieren. Hier stellen wir die Verwendung von Kleintierultraschallbildgebung, um eine genaue Einspritzung von Gehirn tropischen Brustkrebszellen in den linken Ventrikel von athymischen nackten Mäusen führen. Längs-MRT zur Beurteilung intrakranieller Initiierung und das Wachstum von Hirnmetastasen eingesetzt. Ultraschall-gesteuerte intrakardiale Injektion gewährleistet nicht nur eine genaue Einspritzung und hiermit eine höhere Erfolgsquote, sondern auch deutlich verringert Sterblichkeit im Vergleich zu unseren bisherigen manuellen Verfahren. In vivo hochauflösende MRT erlaubt die Visualisierung von hyperintens multifokale Läsionen, so klein wie 310 um Durchmesser auf _{T2-gewichteten} Bildern 3 Wochen nach der Injektion. Follow-up-MRT zeigt intrakraniellen Tumorwachstum und die erhöhte Anzahl von Metastasen, die während des gesamten Gehirns zu verteilen.

Einleitung

Hirnmetastasen ist die häufigste Krebserkrankung bei intrakraniellen Erwachsene. Die Prognose ist sehr schlecht, mit einer medianen Überlebens von 4-6 Monaten auch bei aggressiven Behandlung. Brustkrebs ist eine der drei großen Primärtumoren mit einer hohen Morbidität von Hirnmetastasen ^3.1. Mehrere Gehirn-tropischen Brustkrebslinien sind in der Lage sich entwickelnde Gehirn Metastasen nach intra oder intracarotid Injektion ^4. Direkte Injektion von Tumorzellen in den linken Ventrikel kann die Lunge Kapillarbett zu umgehen und somit die Häufigkeit der Bildung Hirnmetastasen bei Minimierung viszerale Metastasen. Der MDA-MB231Br Linie ist eine der am weitesten verbreiteten menschlichen Brustkrebslinien Hirnmetastasen in Nagetiermodellen ^5,6 zu entwickeln.

Wie viele andere Studien ^4,7, haben wir eine manuelle Prozedur intrakardialer Injektion in unseren früheren Studien durchgeführt. Es wurde jedoch nur 50% Erfolgsquote bei der manuellen erhaltenEinspritzung und ein Bruchteil der Mäuse starben aus den wiederholten invasiven Verfahren, wenn vor Versuchen fehlgeschlagen. Hier stellen wir die Verwendung eines bildgesteuerten Verfahren, um die Injektion von Hirnsuchbrustkrebszellen in den linken Ventrikel von athymischen Mäusen zu sichern. Längshochauflösende MRT wird angewendet, um intrakranielle Entwicklung von Hirnmetastasen zu folgen.

Protokoll

Alle Tier Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der University of Texas Southwestern Medical Center genehmigt.

1. Vorbereitung der Zellen MDA-MB231/Br-GFP

1. Abrufen und Kultur MDA-MB231/Br-GFP die Zellen in DMEM-Medium mit 10% FBS, 1% Glutamin und 1% Penicillin / Streptomycin (freundlicherweise von Dr.. Palmieri und Steeg, NCI).
2. Beachten Sie den Zustand der Zellen und Farbe des Mediums, und ersetzen Medium alle 2-3 Tage.
3. Trypsinieren und sammeln Sie die Zellen, wenn sie 80% Konfluenz erreicht ist, wie in den Schritten skizziert 1.3.1-1.3.5:
   1. Entfernen Sie das alte Medium vollständig und mit 5 ml PBS (1x), um die Zellen vorsichtig waschen. Entfernen Sie die PBS von der Schale.
   2. 1,5 ml Trypsin in die Schüssel, kippen die Schale vorsichtig, um sicherzustellen, dass alle die Zellen durch Trypsin bedeckt. Setzen Sie die Schale zurück in die Zelle und halten Sie sie Inkubator bei 37 ° C für 1 min.
   3. Nehmen Sie die Schale von Inkubator und beobachtendie Zellen unter einem optischen Mikroskop, um die Zellen zu gewährleisten lösen sich von der Schale.
   4. 3 ml Medium, um die Wirkung des Trypsins zu stoppen. Sammeln der Zellmischung in einem Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren der Mischung bei 2.000 UpM für 5 min.
   5. Entfernen Sie das Medium vorsichtig resuspendieren und in 5 ml Serum-freiem Medium, bis sie homogen.
4. Zählen geeignete Anzahl von Zellen und Resuspendieren sie in Serum-freiem DMEM-Medium mit einer Endkonzentration von 1,75 × 10 ⁵ Zellen in 100 &mgr; l Volumen.
   1. Nehmen Sie 50 ul Zellgemisch und 50 ul Trypanblau. Nach dem Mischen nehmen 10 ul Mischung und vorsichtig auf die Zellzählung Rutsche. Verwenden Sie mehrere Proben, um eine genaue Abschätzung der Zellzahl zu gewährleisten.
   2. Halten Sie in der Zellzählung Rutsche, ein Ende zu einer Zeit und dem Zellzähler startet automatisch gezählt. Nehmen Durchschnitt aller Zählergebnisse und die Berechnung der Gesamtzellzahl.
   3. Zentrifugieren Sie die Zellen wieder und wieder zu suspendieren sie indas entsprechende Volumen der serumfreien Medium in einer Endkonzentration von 1,75 × 10 ⁵ Zellen/100 &mgr; l Volumen führen.
5. Platz Zellen auf Eis vor der intra Injektion.

2. Ultraschall-Imaging-guided Intra Injection

1. Verwenden weiblichen Nacktmäusen (BALB / c nu / nu) zwischen 6-8 Wochen alt.
2. Log in dem Abbildungssystem. Initialisieren der Wandler 704 (40 MHz).
3. Starten Sie eine neue Studie und füllen Sie die Informationen.
4. Anästhesiert (3% isoflurane/100% O ₂ in einer Induktionskammer) und während des gesamten Verfahrens über einen Nasenkonus, die Tiere mit Isofluran (2%) in 100% O ₂ (1 dm ³ / min) zu halten. Anästhesie wird bestätigt, wenn kein Rückzugsreflex ist mit Zehen Prise beobachtet.
5. Stellen Sie die Temperatur der Abbildungstabelle auf 37 ° C. Kleben Sie die narkotisierten Maus zum beheizten Bildgebungstisch in Rückenlage.
6. Halten Sie die Ultraschall-Gel bei 37 ° C vor dem IMAlterung. Wenden Sie das Gel auf die Brust der Maus.
7. Montieren Sie den Schwinger in die Halterung. Senken Sie den Wandler, bis die gewünschte Bildtiefe erreicht ist. Bewegen der Plattform, bis die linke Herzkammer mit der aufsteigenden Aorta als orientierungs (1A) identifiziert. Sperren Sie die Bühne, wenn eine klare Sicht des linken Ventrikels wird visualisiert.
8. Zeichnen 100 ul Zellgemisch in eine 1 ml Spritze mit einer 22 G-Nadel. Platzieren und befestigen Sie die Spritze an der Spritze montieren.
9. Bewegen Sie die Spritze nach vorn in Richtung der Maus Brust und vorsichtig bewegen sie von Seite zu Seite, bis die Nadelspitze in der Bildfeld (vor dem Betreten der Maus).
10. Stellen Sie die Nadel Höhe und Winkel, um zu zielen Sie die linke Herzkammer.
11. Dringen Sie die Spritzennadel in inter Raum sofort durch die Haut-und Muskelschichten in den linken Ventrikel unter der Leitung von Ultraschall-Bildgebung.
    Eine Angabe der erfolgreichen Einführung der Nadel in den linken Ventrikelcle ist der Rückfluss von frischen arteriellen Blut (rosa Farbe im Gegensatz zu den dunkelroten venösen Blut) in die Spritze
12. Spritzen Sie die Zellgemisch langsam (Abbildung 1B).
13. Nach Abschluss ziehen Sie die Nadel, heben Sie den Wandler, reinigen Sie die Ultraschall-Gel mit angefeuchteten Gaze und Klebeband entfernen.
14. Bereiten Sie einen sauberen Käfig mit einem vorgewärmten Pad.
15. Legen Sie das Tier auf dem Pad und beobachten Sie das Tier bis zur vollständigen Genesung.
16. Überwachung des Verhaltens des Tieres alle 24 h für zwei Tage.
17. Allgemeine Bedingungen und neurologischen Anzeichen von Komplikationen bei Versuchsmäusen werden routinemäßig überwacht.

3. MRT-Überwachung von intrakraniellen Tumorentwicklung

1. Verwenden Sie ein 9,4 Tesla Magneten an intrakraniellen Entwicklung von Hirnmetastasen zu überwachen.
2. Initiieren MRI zwei Wochen nach der Tumorimplantation und wiederholen Sie einmal pro Woche für bis zu drei Wochen.
3. Sedieren die Tiere mit 3% Isofluran und pflegen sie unter Genral Anästhesie (Isofluran 1,5%).
4. Überwachung und die Tierkörpertemperatur und Atmung während des Experiments konstant zu halten.
5. Hochauflösende Multislice (14 Scheiben mit 1 mm dick, kein Spalt) T ₁ - und T _2-gewichtete koronale Bilder, für die Region aus der Frontallappen an der hinteren Schädelgrube, werden mit den folgenden Parametern erworben: T _1-gewichtete Bilder: mehrere Spin-Echo-Scheibe (REM), TR / TE = 400 ms msec/20, Matrix: 256 x 256, FOV 20 x 20 mm, in der Ebene Auflösung: 78 x 78 um ^2. T _2-gewichtete Bilder: Fast-Spin-Echo mehrere Scheibe (FSEMS) Sequenzen, TR / TE = 2500 msec/48 ms, 8 Echozüge, Matrix: 256 x 256, FOV 20 x 20 mm, in der Ebene Auflösung: 78 x 78 um ^28,9.
   Tumor-Läsionen erscheinen heller als normale Hirngewebe auf T _{2-gewichteten} Bildern.
6. Die Tumorgröße ist auf T _2-gewichtete Bilder manuell umreißt die Zubeh bestimmtCING Teil der Masse auf jedes Bild mit Hilfe von MATLAB-Programme von uns ⁸ geschrieben.
   Gegeben meisten der Tumordurchmesser kleiner sind als die Schichtdicke (1 mm), wird die Größe des Tumors nach ebene Fläche anstatt das Volumen dargestellt.

4. H & E-Färbung Bestätigung der Metastasen

1. Opfere die Mäuse sofort nach der letzten MR-Scan, sezieren die tumortragenden Gehirne und binde sie in OCT-Medium und in -80 ° C eingefroren
2. Abschnitt eine Serie von 10 um dicke koronale Hirnproben mit Kryostaten.
3. Führen H & E-Färbung auf den Gehirnschnitten.

Ergebnisse

Mit der hohen räumlichen Auflösung der MRT (78 in der Ebene um Auflösung) können hyperintense Läsionen so klein wie 310 um im Durchmesser (Abbildung 2) identifiziert werden. Da die Metastasen in dieser Studie sind sehr klein und die Entwicklung der Nekrose und Ödem ist minimal, die hyperintense Läsion auf T _{2-gewichteten} Bildern die Tumormasse wirklich vertreten.

Längs-MRT-Studien ermöglichen in vivo nicht-invasive Beurteilung des Tumorwachstums....

Diskussion

In der vorliegenden Studie haben wir gezeigt, dass Ultraschall bildgesteuerten linksventrikuläre Injektion gewährleistet die Genauigkeit, so dass jedes Tier in dieser Studie entwickelte Gehirn-Metastasen und kein Tier Tod beobachtet. Die Schönheit des bildgeführten Injektion ist, dass der Weg der Nadelpenetration von Haut und schließlich in den linken Ventrikel überwacht und unter Bild, das sich von dem manuellen Verfahren strengen anatomischen Strukturen erfordern zu folgen ist, eingestellt werden.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	HyClone	SH30022.01
Trypsin	Mediatech	25-051-C1
Automatic cell counter	BioRad	TC10
Isoflurane	Baxter International Inc.	1001936060
VisualSonics Vevo 770 High-Resolution Imaging System	Visual Sonics Inc.
9.4 T horizontal bore magnet with a Varian INOVA Unity system	Agilent
O.C.T Compound	Sakura Finetek USA	4583