Isolierung und Vorbereitung von bakteriellen Zellwänden für die Kompositionsanalyse durch Ultra Performance Liquid Chromatographie

Zusammenfassung

Die bakterielle Zellwand besteht aus Peptidoglycan, einem makromolekularen Netzwerk von Zuckersträngen, die durch Peptide vernetzt sind. Ultra Performance Liquid Chromatography bietet eine hohe Auflösung und Durchsatz für neuartige Entdeckungen der Peptidoglykan-Zusammensetzung. Wir präsentieren ein Verfahren zur Isolierung von Zellwänden (Sacculi) und deren anschließender Vorbereitung auf die Analyse über UPLC.

Zusammenfassung

Die bakterielle Zellwand ist entscheidend für die Bestimmung der Zellform während des Wachstums und der Teilung, und bewahrt die mechanische Integrität der Zellen im Angesicht von Turgordrücken mehrere Atmosphären in der Größe. Über die verschiedenen Formen und Größen des bakteriellen Königreichs hinweg besteht die Zellwand aus Peptidoglykan, einem makromolekularen Netzwerk von Zuckersträngen, die durch kurze Peptide vernetzt sind. Peptidoglycans zentrale Bedeutung für die bakterielle Physiologie liegt seiner Verwendung als Antibiotikum-Ziel zugrunde und hat genetische, strukturelle und zellbiologische Studien motiviert, wie es während des Wachstums und der Teilung robust zusammengesetzt wird. Dennoch sind noch umfangreiche Untersuchungen erforderlich, um die wichtigsten enzymatischen Aktivitäten in der Peptidoglykan-Synthese und die chemische Zusammensetzung von bakteriellen Zellwänden vollständig zu charakterisieren. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) ist eine leistungsstarke analytische Methode zur Quantifizierung von Unterschieden in der chemischen Zusammensetzung der Wände von Bakterien, die unter einer Vielzahl von ökologischen und genetischen Bedingungen angebaut werden, aber sein Durchsatz ist oft begrenzt. Hier stellen wir ein einfaches Verfahren zur Isolierung und Herstellung von bakteriellen Zellwänden für biologische Analysen von Peptidoglycan über HPLC und Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) vor, eine Erweiterung von HPLC, die Pumpen verwendet, um ultrahohe Drücke von bis zu 15.000 psi zu liefern, verglichen mit 6.000 psi für HPLC. In Kombination mit der hier vorgestellten Herstellung von bakteriellen Zellwänden ermöglichen die probengeringen Injektoren, Detektoren mit hohen Abtastraten, kleineren Probenvolumina und kürzeren Laufzeiten von UPLC eine hohe Auflösung und einen Durchsatz für neuartige Entdeckungen der Peptidoglykanzusammensetzung und grundlegende bakterielle Zellbiologie in den meisten biologischen Laboratorien mit Zugang zu einer Ultrazentrifuge und UPLC.

Einleitung

Das Ziel der hier beschriebenen Methode ist es, intakte bakterielle Zellwände (Sacculi) zu isolieren und das Peptidoglycan (PG) so zu verdauen, dass Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) verwendet werden kann, um Informationen wie die Identität der Muropeptidkomponenten und ihre Konzentrationen, die durchschnittliche Länge der Glykan-Stränge und den Anteil des Materials, das an Querverbindungen zwischen Strängen beteiligt ist, bereitzustellen. Für eine detaillierte Diskussion der PG Biochemie und Mutropptinatsarten, gibt es mehrere ausgezeichnete Bewertungen, die PG-Struktur und seine Rolle bei Infektion, Resistenz, Morphogenese und Wachstum^{beschreiben 1-6}. Die High Performance Liquid Chromatography (HPLC) für die PG-Analyse wurde ursprünglich von Glauner und Schwarz in den 1980er Jahren entwickelt und in jüngerer Zeit in den Laboren von Miguel de Pedro und Waldemar Vollmer umfassend aufgetragen. Frühere Methoden verwendeten Aminosäureanalyse oder Papierchromatographie, zeitaufwändige und mühsame Techniken, die keine genaue oder vollständige Bewertung von Zellwandkomponenten liefern.

Die UPLC-Analyse kann einfach in jedem Basisforschungslabor implementiert werden, das Zugriff auf eine Ultrazentrifuge und UPLC hat. Die UPLC-Methode, die wir unten vorstellen, isoliert vollständige Sacculi und liefert so umfassende, quantitative Informationen über alle darin enthaltenen chemischen Arten. Diese Methode liefert eine präzise Quantifizierung aller Muropeptide über eine Bakterienpopulation, alle innerhalb eines 20-min-UPLC-Laufs. Die Umsetzung dieser Methode beinhaltet nur grundlegende Laborfertigkeiten, ohne nennenswerte finanzielle Investitionen in Materialien. Um die Schritte in dieser Methode auszuführen, müssen die Forscher nur in pipettieren, Puffer und Enzyme vorbereiten und den pH-Wert anpassen, um es für eine Breite von wissenschaftlichen Disziplinen zugänglich zu machen. Die Wahl der in diesem Protokoll verwendeten Enzyme hängt von der analysierten Bakterienart ab; das hier beschriebene Protokoll ist nützlich für Escherichia coliund hat sich im Allgemeinen als ausreichend für die Isolierung von Sacculi von anderen Gram-negativen Organismen erwiesen. Die Konsultation der Literatur wird empfohlen, wenn diese Methode auf Gram-positive Bakterien angewendet wird; bei diesen Arten ist die Sacculus-Reinigung traditionell schwieriger. Insbesondere kann diese Methode in Bezug auf Enzymwahl und Länge der Verdauungszeiten geändert werden müssen, um die dickeren Wände und Zubehörpolymere wie Teichosäuren von Gram-positiven Bakterien unterzubringen. Das erste Enzym in diesem Protokoll spaltet die an der Peptidoglykan-Anlage des Peptidoglykans angebrachte Anhaftung des äußeren Membranlipoproteins (wie Brauns Lipoprotein oder Lpp) und löst damit bis auf das C-terminale Di- (oder Tri-) Peptid des Lpp von der Zellwand. Dieser Schritt ist notwendig bei der Untersuchung enterobacteria, aber viele andere Gram-negative Bakterien haben keine Lpp-Äquivalente, und daher kann dieser Schritt übersprungen werden. Ein zweites Enzym spaltet speziell nach der Muramicsäurekomponente des Peptidoglykans und llüflisiert die Disaccharid-Untereinheit, die die Muropeptid-Arten bildet. Um eine genaue Bewertung der Architektur des PG zu liefern, sollte bei der Verdauung der Sacculi darauf geachtet werden, eine Spaltung der Querbrücken oder eines anderen Teils des Peptidstamms zu verhindern.

Obwohl die chemischen Zusammensetzungen von Peptidoglycan aus über 100 Stämmen von 40 Bakterienarten mit HPLC analysiert wurden, wurden keine Analysen mit UPLC-Technologie durchgeführt. Darüber hinaus hat die vorherige Arbeit Peptidoglycan nur von einem kleinen Bruchteil der bakteriellen Domäne charakterisiert, teilweise durch den Durchsatz von HPLC begrenzt. Daher wird die Verbreitung dieser Methode an so viele Forscher wie möglich und die Implementierung auf UPLC-Plattformen entscheidend für die Förderung physiologischer Studien des großen Anteils von Bakterienarten sein, deren Peptidoglycan noch kategorisiert werden muss.

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Protokoll

1. Wachsen Sie bakterielle Kulturen in 2,5 ml Medien über Nacht

Rückverdünnungskulturen 1:100 in 250 ml Frischmedien und wachsen auf OD₆₀₀ von 0,7-0,8 an. Bereiten Sie eine Lösung von 6% Natriumdodecylsulfat (SDS) in Wasser vor.

VORSICHT: SDS Pulver ist gefährlich - vermeiden SDS Pulver einatmen; eine Maske über Nase und Mund tragen.

2. Tag 1 - Lysing Bakterielle Kulturen wird im Laufe eines Tages und über Nacht durchgeführt

1. Während verdünnte Kulturen wachsen, stellen Sie ein kochendes Wasserbad auf einer Kochplatte in einem 1 L Becher auf. Sobald das Wasser kocht, aliquot 6 ml 6% SDS in 50 ml Polypropylen-Röhren, fügen Sie einen kleinen Rührstab zu jedem Rohr, sichern Rohrdeckel fingerdicht, legen Sie Rohre in Wasserbad, und schalten Sie das Rühren auf 500 U/min auf der Kochplatte.
2. Die 250 ml-Kulturen bei 5.000 × g 10 min bei Raumtemperatur ernten und Pellets in 3 ml Medien oder 1x phosphatgepufferter Saline wieder aufhängen. Langsam Pipette Zell Suspensionen in 50 ml Tuben mit 6% kochenden SDS, um die Zellen zu lyse (Endkonzentration 4% SDS), während die Rohre in das kochende Wasserbad getaucht werden, und schließen Sie die Deckel wieder zu Fingerfest. Zellsuspensionen müssen nach der Resuspendierten schnell in kochende SDS übertragen werden. Abrupte Umweltveränderungen sollten vermieden werden, da dies zu einer fehlerhaften Veränderung der Zellwandstruktur führenkönnte.
3. Deckel kochendes Wasserbad und lassen Sie Zellen für 3 Stunden kochen, überprüfen Sie den Wasserstand regelmäßig und das Wasserbad nachfüllen, wenn nötig. Nach 3 Stunden das Heizelement der Kochplatte ausschalten und über Nacht bei 500 Umdrehungen umrühren.

3. Tag 2 - Enzymatische Verdauungen werden im Laufe eines Tages durchgeführt

1. Wenn SDS in den 50 ml Tuben über Nacht gefällt hat, stellen Sie das Wasserbad für weitere 1-2 Stunden zum Kochen. Schalten Sie einen Wärmeblock auf 60 °C ein. Bereiten Sie einen 1 mg/ml Vorrat an Pronase E in 10 mM Tris-HCl (pH 7.2) + 0,06% w/v NaCl vor und aktivieren Sie Pronase E bei 60 °C für mindestens 30 min.
2. Verwenden Sie ein Ultrazentrifugenset auf 400.000 × g, um Proben für 20 min bei Raumtemperatur zu spinnen, um die großen PG-Polymere zu pellet und damit von anderen zellulären Komponenten zu reinigen. Überstand vorsichtig entfernen und dann jedes Pellet in Raumtemperatur Reinstwasser wieder aufhängen. ANMERKUNG: Das Resuspensionsvolumen hängt vom Volumen der verwendeten Ultrazentrifugenrohre ab; verwenden Sie ein Volumen, das die Rohre mindestens auf halbem Weg füllt, aber das maximale Volumen der Rohre nicht überschreitet. Zentrifugieren/Waschen wiederholen, bis das Wasser während der Resuspension keine Blasen bildet, was darauf hinweist, dass die SDS vollständig entfernt wurde (in der Regel drei Waschungen). Hören Sie auf, das Pellet zu waschen, wenn sich ein weißer Niederschlag bildet, da dies darauf hindeutet, dass die Sacculi zusammenklumpen. Klumpen sind nicht katastrophal, aber Klumpen binden sehr stark an Kunststoff und Glaswaren, was zu einem großen Probenverlust führt. Fahren Sie in diesem Fall mit dem Protokoll unter Verwendung der verklumpten Sacculi-Probe fort.
3. Setzen Sie die Proben beim letzten Zentrifugations-/Waschschritt in 900 l von 10 mM Tris-HCl (pH 7.2) + 0,06 % w/v NaCl wieder auf und übertragen Sie sie in 2 ml-Röhrchen, die zuvor mit Löchern in den Oberteilen mit einer kleinen Nadel gestochen wurden. Zu jeder Probe 100 l von 1 mg/ml aktivierter Pronase E (100 g/ml Endkonzentration) geben und bei 60 °C für 2 Stunden inkubieren. Stellen Sie einen anderen Wärmeblock auf 100 °C ein.
4. Stoppen Sie die Pronase E-Verdauung, indem Sie jeder Probe 200 l 6% SDS hinzufügen und die Proben im 100 °C-Wärmeblock 30 min kochen. Stellen Sie einen anderen Wärmeblock auf 37 °C ein und machen Sie einen 1 mg/ml-Vorrat an Muramidase (Mutanolysin) in 50 mM Phosphatpuffer (pH 4.9).
5. Verwenden Sie wie in Schritt 3.2 ein Ultrazentrifugenset auf 400.000 × g, um Proben für 20 min bei Raumtemperatur zu spinnen und mit Raumtemperatur Ultrareinstwasser zu waschen, bis SDS vollständig entfernt ist (in der Regel drei Waschungen). Das Resuspensionsvolumen hängt vom Volumen der verwendeten Ultrazentrifugenrohre ab; verwenden Sie ein Volumen, das die Rohre mindestens auf halbem Weg füllt, aber das maximale Volumen der Rohre nicht überschreitet.
6. Beim letzten Zentrifugations-/Waschschritt Proben in 200 l 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 4.9) wieder aufsetzen. Dieses Volumen kann entsprechend der Menge an Peptidoglycan in der Probe angepasst werden und kann artenabhängig sein. Wenn es zuvor veröffentlichte Berichte über HPLC-Analysen für die Arten von Interesse gibt, kann dieser Band auf der Grundlage dieser Quantifizierungen geschätzt werden (eine Zusammenstellung von HPLC PG-Studien finden Sie in den ergänzenden Informationen der Referenz⁷). Für andere Arten kann die Sacculus-Vorbereitung bis zu diesem Schritt ausgeführt werden, und dann können verschiedene Mengen von Resuspension-Volumes hinzugefügt werden, um Proben zu replizieren, um das minimale Volumen zu bestimmen, das es dem PG ermöglicht, in lösungsweise zu bleiben (siehe Diskussion für weitere Schätzungen). Wenn die Probe mehr Peptidoglycan enthält, erhöhen Sie das Resuspensionsvolumen; Wenn die Probe wenig Peptidoglycan hat, reduzieren Sie das Resuspensionsvolumen auf mindestens 50 l.
7. Die Proben in 1,5 ml Tuben geben und 1 mg/ml Muramidase hinzufügen, um eine Endkonzentration von 40 g/ml zu ergeben. 6-8 Stunden oder über Nacht bei 37 °C inkubieren.

4. Tag 3 - Die Vorbereitung der Proben für UPLC wird am letzten Tag durchgeführt

1. Schalten Sie einen Wärmeblock auf 100 °C ein. Kochen Sie die Proben ohne SDS für 5 min, um die Muramidase-Verdauung zu stoppen. Zentrifugenproben für 10 min bei 16.000 × g bei Raumtemperatur, dann den Überstand (Muropeptiden sind jetzt löslich) auf 13 mm x 100 mm Glasrohre übertragen. Versuchen Sie, so viel Überstand wie möglich zu erholen, immer sehr nah an das Pellet, ohne es zu stören.
2. Stellen Sie den pH-Wert ein, indem Sie der Probe 500 mM Boratpuffer (pH 9) für eine Endkonzentration von 100 mM Boratpuffer hinzufügen. Boratpuffer ist kompatibel mit dem Reduktionsmittel Natriumborohydrid. Fügen Sie 1-2 Körner Natriumborohydrid hinzu, um jede Probe zu reduzieren und die Reaktion mindestens 30 min bei Raumtemperatur laufen zu lassen. VORSICHT: Natriumborohydrid ist hochreaktiv und gefährlich zu handhaben - vermeiden Sie den Kontakt mit der Haut (Handschuhe tragen) und vermeiden Sie den Kontakt mit den Augen (Schutzbrille).
3. Passen Sie die Proben auf pH 3-4 (der isoelektrische Muropeptidpunkt beträgt 3,5) mit 50 % v/v Orthophosphorsäure mit 20-l-Schritten bis pH 6, gemessen mit pH-Indikatorpapier, und dann mit 2-l-Schritten. VORSICHT: Orthophosphorsäure ist korrosiv und gefährlich zu handhaben - vermeiden Sie den Kontakt mit der Haut (Handschuhe tragen) und vermeiden Sie den Kontakt mit den Augen (Schutzbrille). Die Probe sollte als Reaktion auf die Zugabe von Orthophosphorsäure sprudeln; Wenn die Probe nicht mehr sprudelt, weist dies in der Regel darauf hin, dass ein pH-Wert von 6 erreicht wurde. Wenn in der Probe kein Blasen auftritt, kann dies darauf hindeuten, dass die Menge an Natriumborohydrid zugesetzt wurde, die zu klein war. In diesem Fall, stoppen Sie die Senkung des pH-Werts, fügen Sie vorsichtig ein oder zwei Körner Natriumborohydrid hinzu, lassen Sie 5-10 min reagieren, dann setzen Sie die pH-Einstellung fort.
4. Filtern Sie die Probe durch einen 0,22 m Spritzenfilter direkt in eine UPLC-Durchstechflasche. Wenn sich ein Niederschlag gebildet hat, erhitzen Sie das Rohr mit mehreren Bahnen durch eine Flamme, bevor Sie filtern. Wenn die Probe nicht innerhalb des Tages in das UPLC-Instrument injiziert wird, frieren Sie über Nacht bei -20 °C ein. Proben können bis zu einem Jahr bei -80 °C gelagert werden. Die Probe kann aufgetaut werden, indem sie mehrmals durch eine Flamme geht.
5. Injizieren Sie 10 l jeder Probe auf ein UPLC-Instrument, das mit einer C18 1,7-m-Umkehrphasensäule und einem Absorptionsdetektor ausgestattet ist, um 202-208 nm zu überwachen. Proben werden sequenziell injiziert, aber Autosampler-Funktionen ermöglichen die Verarbeitung von bis zu 96 Samples im Batch. Verwenden Sie 50 mM Natriumphosphat (pH 4,35) + 0,4 % v/v Natriumazid für Lösungsmittel A und 75 mM Natriumphosphat (pH 4,95) + 15 % v/v Methanol für Lösungsmittel B. HINWEIS: Natriumazid wird hinzugefügt, um die 205 nm Absorption von Methanol auszugleichen, um eine Basisdrift zu vermeiden. Stellen Sie den Durchfluss auf 0,25 ml/min ein und verwenden Sie einen linearen Gradienten über 25 min, um 100% Lösungsmittel B und sequentielle Elution von Muropeptiden innerhalb von 30 min zu erreichen. Wenn die Massenspektrometrie verwendet wird, um Muropeptide nach UPLC zu charakterisieren, sammeln Sie Bruchteile des Spitzenwerts eines Anteilssammlers und trocknen Sie die Fraktionen mit einem Zentrifugalverdampfer.

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Ergebnisse

Nach dem in Abbildung 1beschriebenen Verfahren sollte die endige Probe aus mindestens 200 l klarer Lösung bestehen, die direkt in eine UPLC-Durchstechflasche gefiltert wurde (Schritt 4.4). Die UPLC-Trennung der verschiedenen Muropeptide in einer bakteriellen Probe beruht auf ihrer relativen Löslichkeit zwischen der flüssigen mobilen Phase und der stationären Phase der Säule. Reversed-Phase C18 Säulen bieten eine stark hydrophobe Matrix, um die Muropeptid-Arten basierend auf Hydrophobie und Größe<...

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Diskussion

Ein wichtiger Schritt in diesem Verfahren ist Schritt 3.1 des zweiten Tages der Probenvorbereitung. Wenn die SDS über Nacht gefällt hat oder wenn die Proben mehrere Wochen lang in 4% SDS bei Raumtemperatur gelagert wurden, müssen die Proben mindestens 1 Stunde neu geölt werden, um die SDS wieder aufzulösen. Eine häufige Ursache für SDS-Fällung ist die Verwendung von Medien mit Kaliumsalzen, daher sollte Kalium möglichst in Medien vermieden werden. Wie im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse erwähnt, ist es auch...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pronase E	Amresco	E629
Mutanolysin from Streptomyces	Sigma-Aldrich	M9901
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma-Aldrich	452882	Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle
Orthophosphoric acid	Sigma-Aldrich	79607	Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle
Boric acid	Sigma-Aldrich	31146
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Sodium azide is a poison
Sodium tetraborate	Sigma-Aldrich	221732
Millex 0.22 μm syringe filters	Fisher	SLGVR04NL
pH strips (pH range 0-6)	Fisher	M95863
50 ml polypropylene Falcon tubes	VWR	21008-951
13 mm x 100 mm glass tubes	Kimble Chase	60CM13
12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial	Waters	186000327C
Sodium Dodecyl Sulfate	Ambion	AM9820	SDS powder is hazardous
Instrumentation
Waters Acquity UPLC H-Class system, including:
Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN
Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager
Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column
Acquity UPLC PDA Detector
Waters Fraction Collector III
Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler